Beskrevet er utarbeidelsen av antigen liposomal nanopartikler og deres bruk i stimulerende B-celle aktivering i vitro og vivo. Konsekvent og robust antistoff svar førte til utviklingen av en ny peanøttallergi modell. Protokollen for å generere antigen liposomer kan utvides til forskjellige antigener og immunisering modeller.
Antistoff svar gi kritiske beskyttende immunitet mot en rekke patogener. Det er fortsatt en høy interesse for å generere robust antistoffer for vaksinasjon samt forstå hvordan patogene antistoff svar utvikle allergier og autoimmune sykdommer. Generere robust antigen-spesifikke antistoffer svar er ikke alltid trivielt. I musen modeller krever det ofte flere runder immunizations med adjuvant som fører til stor variasjon i nivåer av indusert antistoffer. Et eksempel er i musen modeller av peanut allergi der mer robust og reproduserbar modeller som minimerer musen tall og bruk av adjuvant ville være fordelaktig. Presenteres her er en svært reproduserbar musemodell peanøttallergi anafylaksi. Denne modellen er avhengig av to viktige faktorer: (1) antigen-spesifikke splenocytes overføres adoptively fra peanut-sensitivisert mus i en naiv mottaker mus, normalisere antall antigen-spesifikke minne B – og T-celler over en stor mengde av mus; og (2) mottakere mus er senere økt med en sterk multivalent immunogen i form av liposomal nanopartikler vise store peanut allergenet (Ara h 2). Den største fordelen ved denne modellen er dens reproduserbarhet, som til slutt senker antall dyr som brukes i hver studie, samtidig minimere antall dyr mottar flere injeksjoner av adjuvant. Modulære montering av disse immunogenic liposomer gir relativt lettvinte tilpasning til andre allergisk eller autoimmune modeller som involverer patogene antistoffer.
Matallergi påvirker 8% av barn i USA, og har økt utbredelse siste tiåret1. Peanut allergi påvirker 1% av barn og er ikke vanligvis Forvokst2. Selv om flere lovende kliniske studier er underveis for behandling av matallergi, inkludert muntlige immunterapi (OIT), sublinguale immunterapi (SPLITT) og epicutaneous immunterapi (EPIT), er det for øyeblikket ingen FDA-godkjent behandling strategier for desensitizing peanut-allergiske personer3,4,5,6,7,8. Derfor må allergiske personer strengt unngå allergener for å unngå anafylaksi. Mange spørsmål fortsatt om ruter allergi og underliggende mekanismene mat allergi utvikling.
Musen modeller er et verdifullt verktøy for å studere mekanismer for allergi, samt utvikle nye tolerogenic og desensitization, terapier,9,,10,,11,,12. Dette gjelder særlig fordi store peanut allergenet (Ara h 2; Ah2) hos mennesker er også dominerende allergenet i flere beskrevet musen modeller13,14. Mens musen modeller av peanut allergi er uvurderlig i å studere mekanismer for allergi og toleranse, er en ulempe at de kan være variabel og krever bruk av adjuvans. Mer potent immunogens ville være en måte å minimere iboende variasjon av slike modeller. Siden B-celler er sterkt aktivert av multivalent antigener, er antigen liposomer vise allergenet et godt alternativ på grunn av deres evne til å potensielt aktivere B-celler gjennom B-celle reseptor (BCR) mens har for effektivt grunning T-celle rommet gjennom blir tatt opp ikke-spesielt av antigen presentere celler.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for bøye protein antigener til liposomal nanopartikler ved hjelp av en lettvinte og modulære strategi. Bruker en surrogat antigen, anti-IgM Fab fragment, vi viser hvor potent slik antigen liposomer kan være i stimulerende B-celle aktivering. Antigen liposomer viser Ah2 antigen ble brukt til å utvikle en ny musemodell tillagt følsomhet. I denne modellen overføres splenocytes fra bekreftet peanut allergisk mus, inneholder peanut-spesifikke minne B – og T-celler, i naive congenic mus. Minne antistoff svar er indusert av injeksjon av liposomer konjugert med Ah2 i mottakerens mus, for å indusere antistoffer mot Ah2. Etterfulgt av eneste løft med løselig Ah2, gi Ah2-spesifikke antistoffer opphav til en sterk anafylaktisk reaksjon når disse musene er senere utfordret med Ah2. Mus gjennomgår allergisk reaksjon svare på en svært ensartet måte og ikke har mottatt en adjuvans, denne tilnærmingen er en ønskelig peanøttallergi modell og resultatene tyder på at det kan ha nytte i andre musen modeller drevet av antigener rettet mot allergener og eventuelt autoantigens.
Metodene som er skissert her er en generell protokoll for Bøyning av et protein til en lipid som aktiverer visning av protein på liposomal nanopartikler. For svært store multi delenhet proteiner, kan denne protokollen ha begrenset nytte. Den ideelle metoden ville være innføringen av en områdespesifikk kode som gjør at en biorthogonal kjemiske linking strategi skal brukes. Hvis uttrykke protein recombinantly, kan dette være mulig å bruke tilgjengelig områdespesifikke strategier17, og en r…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av bevilgninger fra Department of Defense (W81XWH-16-1-0302 og W81XWH-16-1-0303).
Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
DSPC | Avanti | 850365 | |
DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
Extruder | Avanti | 610000 | 1mL syringe with holder/heating block |
Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
10mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
CaCl2 | Sigma | C4901 | |
Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm – straight |
Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
Cholera toxin, from vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8") |
Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 x 75 x 1.0 mm |
ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
NuPAGE LDS buffer, 4X | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |