Beskrevet er forberedelsen af antigene liposomal nanopartikler og deres anvendelse i stimulerende B-celle aktivering i in vitro og i vivo. Sammenhængende og robust antistof svar førte til udviklingen af en ny jordnøddeallergi model. Protokol til at generere antigene Liposomer kan udvides til at omfatte forskellige antigener og immunisering modeller.
Antistof svar give kritisk beskyttende immunitet til en bred vifte af patogener. Der er stadig en stor interesse i at skabe robuste antistoffer for vaccination samt forstå hvordan patogene antistof reaktioner udvikle allergi og autoimmune sygdom. Generere robust antigen-specifikke antistof svar er ikke altid trivielt. I musemodeller kræver det ofte flere runder af vaccinationer med adjuvans, der fører til en stor variation i niveauer af inducerede antistoffer. Et eksempel er musemodeller af jordnøddeallergi hvor mere robust og reproducerbare modeller, der minimerer mus numre og brug af adjuvans ville være gavnligt. Præsenteres her er en yderst reproducerbare musemodel af jordnøddeallergi anafylaksi. Denne nye model bygger på to centrale faktorer: (1) antigen-specifikke splenocytes adoptively overføres fra en peanut-sensibiliseret mus til en naiv modtager mus, normalisere antallet af antigen-specifikke hukommelse B – og T-celler på tværs af en lang række mus; og (2) recipient mus er efterfølgende boostet med en stærk multivalent immunogenerne i form af liposomal nanopartikler viser den største peanut allergen (Ara h 2). Den største fordel ved denne model er dens reproducerbarhed, som i sidste ende sænker antallet af dyr, der anvendes i hver undersøgelse, og minimere antallet af dyr modtager flere injektioner af adjuvans. Modulære samling af disse immunogen Liposomer giver relativt letkøbt tilpasningsevne til andre allergisk eller autoimmun modeller, der involverer patogene antistoffer.
Fødevareallergi rammer 8% af børn i USA, og er steget i prævalens i løbet af sidste ti år1. Allergi over for peanut påvirker 1% af børn og er ikke typisk forvokset2. Selv om flere lovende kliniske forsøg er på vej til behandling af fødevareallergi, herunder mundtlige immunterapi (OIT), sublingual immunterapi (SLIT) og epicutaneous immunterapi (EPIT), er der i øjeblikket ingen FDA-godkendt behandling strategier for desensibilisering peanut-allergiske personer3,4,5,6,7,8. Allergisk individer må derfor strengt undgå allergener for at undgå anafylaksi. Mange spørgsmål er fortsat med hensyn til ruter for overfølsomhed og underliggende mekanismer af mad allergi udvikling.
Musemodeller er et værdifuldt redskab til at studere mekanismerne af allergi samt udvikling af nye tolerogenic og desensibilisering terapier9,10,11,12. Dette gælder især fordi den største peanut allergen (Ara h 2; Ah2) i mennesker er også den dominerende allergen i flere beskrevet mus modeller13,14. Mens musemodeller af jordnøddeallergi er uvurderlige i at studere mekanismer af overfølsomhed og tolerance, er en ulempe, at de kan være variabel og kræver brug af adjuvans. Mere potent immunogens ville være en måde at minimere den iboende variation af sådanne modeller. Da B-celler er stærkt aktiveret af multivalent antigener, er antigene Liposomer vise allergen en god mulighed på grund af deres evne til potentielt aktivere B-celler gennem B-celle receptoren (BCR), mens også har ejendom effektivt priming af T-celle rum gennem taget op ikke-specifikt af antigen-præsenterer celler.
Her beskriver vi en detaljeret protokol for de tråddannende protein antigener til liposomal nanopartikler ved hjælp af en letkøbt og modulære strategi. Ved hjælp af et surrogat antigen, anti-IgM Fab fragmentet, vi viser, hvordan potent sådan antigene Liposomer kan være stimulerende B-celle aktivering. Antigene Liposomer vise Ah2 antigen blev brugt til at udvikle en ny musemodel konfererede følsomhed. I denne model overføres splenocytes fra verificerede peanut allergisk mus, der indeholder peanut-specifikke hukommelse B – og T-celler, til naive congenic mus. Hukommelse antistof svar er fremkaldt ved injektion af Liposomer konjugeret med Ah2 til de modtagende mus, for at inducere antistoffer mod Ah2. Efterfulgt af kun én løft med opløselig Ah2, give Ah2-specifikke antistoffer anledning til en stærk anafylaktisk reaktion, når disse mus er efterfølgende udfordret med Ah2. Som mus gennemgår den allergiske reaktion reagere meget ensartet og ikke har modtaget en adjuvans, denne tilgang er en ønskelig jordnøddeallergi model, og resultaterne tyder på, at det kan have nytte i andre musemodeller drevet af antigener rettet mod allergener og eventuelt autoantigens.
De metoder, der er skitseret her er en generel protokol til konjugation af et protein til et lipid, som giver mulighed for visning af protein på liposomal nanopartikler. For meget store multi subunit proteiner, kan denne protokol har begrænset nytte. Den ideelle metode ville være indførelse af en lokationsspecifik tag, der muliggør en biorthogonal kemiske forbinder strategi skal anvendes. Hvis udtrykker proteinet recombinantly, kan dette være muligt ved hjælp af tilgængelige lokationsspecifikke strategier<sup cla…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af tilskud fra Department of Defense (W81XWH-16-1-0302 og W81XWH-16-1-0303).
Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
DSPC | Avanti | 850365 | |
DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
Extruder | Avanti | 610000 | 1mL syringe with holder/heating block |
Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
10mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
CaCl2 | Sigma | C4901 | |
Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm – straight |
Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
Cholera toxin, from vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8") |
Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 x 75 x 1.0 mm |
ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
NuPAGE LDS buffer, 4X | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |