Summary

Antigenen Liposomen für Generation krankheitsspezifische Antikörper

Published: October 25, 2018
doi:

Summary

Beschrieben, ist die Vorbereitung von Antigenen liposomalen Nanopartikeln und ihre Verwendung in anregenden B-Zell Aktivierung in Vitro und in Vivo. Konsistente und robuste Antikörperantworten führte zur Entwicklung eines neuen Modells der Erdnuss-Allergie. Das Protokoll zur Erzeugung von Antigenen Liposomen kann auf verschiedene Antigene und Immunisierung Modelle ausgedehnt werden.

Abstract

Antikörperantworten bieten wichtige schützende Immunität auf ein breites Spektrum von Krankheitserregern. Es bleibt ein hohes Interesse bei der Schaffung von robusten Antikörper für die Impfung sowie wie pathogenen Antikörper verstehen, Antworten zu Allergien und Autoimmunkrankheiten zu entwickeln. Robuste Antigen-spezifischen Antikörper-Reaktionen zu erzeugen, ist nicht trivial. In Mausmodellen bedarf es oft mehrere Runden von Impfungen mit Adjuvans, die zu viel Variabilität in der Höhe der induzierten Antikörper führt. Ein Beispiel ist in Mausmodellen von Erdnuss-Allergien wo stabile und reproduzierbare Modelle, die Maus Zahlen und den Einsatz der adjuvanten minimieren vorteilhaft wäre. Präsentiert hier ist eine hoch reproduzierbare Mausmodell der Erdnuss-Allergie Anaphylaxie. Dieses neue Modell stützt sich auf zwei Faktoren: (1) Antigen-spezifische Splenocyten sind adoptively von einer Erdnuss sensibilisiert Maus übertragen, in eine naive Empfänger Maus, normalisieren die Anzahl von Antigen-spezifische B- und T-Zellen über eine große Anzahl von Mäusen; und (2) Empfänger Mäuse anschließend mit einem starken multivalente Immunogen in Form von liposomalen Nanopartikel, die Anzeige der wichtigsten Erdnuss Allergens (Ara h 2) gesteigert werden. Der große Vorteil dieses Modells ist die Reproduzierbarkeit, die letztlich die Anzahl der verwendeten Tiere in jeder Studie, bei gleichzeitiger Minimierung der Anzahl der Tiere erhalten mehrere Injektionen der adjuvanten senkt. Der modulare Aufbau dieser immunogenen Liposomen bietet relativ einfache Anpassungsfähigkeit zu anderen allergischen oder Autoimmun-Modelle, die pathogenen Antikörper beinhalten.

Introduction

Nahrungsmittel-Allergie betrifft 8 % der Kinder in den Vereinigten Staaten, und stieg in der Prävalenz in den vergangenen zehn Jahren1. Allergie gegen Erdnuss betrifft 1 % der Kinder und ist nicht in der Regel entwachsen2. Obwohl mehrere vielversprechende klinische Studien sind im Gange für die Behandlung von Nahrungsmittelallergien, einschließlich oraler Immuntherapie (OIT), sublinguale Immuntherapie (SLIT) und Epicutan Immuntherapie (EPIT), gibt es derzeit keine FDA-zugelassene Behandlungsstrategien für die Desensibilisierung Erdnuss-Allergiker3,4,5,6,7,8. Daher müssen allergische Personen Allergene zur Vermeidung von Anaphylaxie strikt vermeiden. Es bleiben viele Fragen in Bezug auf Routen der Sensibilisierung und zugrundeliegende Mechanismen der Lebensmittel-Allergie-Entwicklung.

Maus-Modellen sind ein wertvolles Werkzeug für die Mechanismen der Allergie zu studieren sowie die Entwicklung neuer tolerogene und Desensibilisierung Therapien9,10,11,12. Dies gilt vor allem weil die großen Erdnuss Allergen (Ara h 2; Ah2) beim Menschen ist auch das dominierende Allergen in mehreren beschrieben Maus Modelle13,14. Während Mausmodelle der Erdnuss-Allergie bei der Untersuchung der Mechanismen der Sensibilisierung und Toleranz von unschätzbarem Wert sind, ist ein Nachteil, dass sie können variabel sein und erfordern den Einsatz von Hilfsstoffen. Potentere immunogenen wäre eine Möglichkeit, die innere Variabilität solcher Modelle zu minimieren. Da B-Zellen stark durch multivalente Antigene aktiviert sind, sind Antigene Liposomen anzeigen das Allergen eine gute Wahl wegen ihrer Fähigkeit, potentiell B-Zellen durch die B-Zell-Rezeptor (BCR) aktivieren, während auch die Eigenschaft des effizient Grundieren die T-Zell-Fach durch unspezifisch durch Antigen-präsentierenden aufgegriffen wird Zellen.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für Konjugation Protein-Antigene, liposomale Nanopartikel mit einer einfache und modulare Strategie. Mit einem Ersatz-Antigen, Anti-IgM-Fab-Fragment, wir zeigen wie stark solche Antigenen Liposomen können in anregenden B-Zell-Aktivierung werden. Antigene Liposomen anzeigen Ah2 Antigen wurden verwendet, um ein neues Mausmodell der übertragenen Sensibilität zu entwickeln. In diesem Modell sind Splenocyten von verifizierten Erdnuss allergische Mäuse, mit Erdnuss-spezifische Speicher B- und T-Zellen, in naiven Congenic Mäuse übertragen. Speicher-Antikörper-Reaktionen werden durch Injektion von Liposomen in den Empfänger Mäuse, um Antikörper gegen Ah2 induzieren mit Ah2 konjugierten induziert. Gefolgt von nur einen Schub mit löslichen Ah2, geben Ah2-spezifische Antikörper Anlass zu einer starken anaphylaktischen Reaktion, wenn diese Mäuse anschließend mit Ah2 herausgefordert werden. Wie Mäuse durchläuft die allergische Reaktion sehr einheitlich reagieren und Adjuvans nicht erhalten haben, dieser Ansatz ist eine wünschenswerte Erdnuss-Allergie-Modell und die Ergebnisse deuten darauf hin, dass es in anderen getrieben durch Antigene gerichtet an Mausmodellen Dienstprogramm möglicherweise Allergene und möglicherweise Autoantigene.

Protocol

Die allgemeine Methode der Kupplung Protein, Lipid und Einbeziehung in Liposomen basiert größtenteils auf früheren Arbeiten15. Alle nachstehend beschriebene Tiere Verfahren wurden von der University of North Carolina in Chapel Hill institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt. Alle Mäuse in der Erdnuss-Allergie-Modell verwendeten sind BALB/cJ Weibchen gekauft von 3 Wochen alt. Die University of Alberta Tierpflege und verwenden Ausschuss (ACUC) genehmigte Experimente, die…

Representative Results

Konjugation des Proteins des Interesses mit DSPE-PEG(2000) nachgewiesen werden kann, indem man eine Verringerung mit einem Anstieg im Vergleich zu dem unconjugated Protein Molekulargewicht. Abbildung 1A zeigt eine repräsentativen Gel Anti-Maus IgM F(ab) Fragment Konjugation, PEG-DSPE, die eine 2 – 3-kDa-Bandshift für das denaturierte Protein zeigt. Beachten Sie, dass ca. 50 % des Proteins angezeigt wird geändert werden, das dürfte angesichts der Tatsach…

Discussion

Die hier beschriebenen Methoden sind ein allgemeines Protokoll für die Konjugation eines Proteins, ein Lipid ermöglicht die Anzeige des Proteins auf liposomalen Nanopartikel. Für sehr große Multi-Untereinheit Proteine kann dieses Protokoll Dienstprogramm begrenzt. Die ideale Methode wäre die Einführung eines Site-spezifische Tags, mit dem ein Biorthogonal chemische Verknüpfungsstrategie verwendet werden können. Wenn das Protein rekombinant zum Ausdruck zu bringen, ist dies möglich mit verfügbaren standortspezif…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Department of Defense (W81XWH-16-1-0302 und W81XWH-16-1-0303).

Materials

Model 2110 Fraction Collector BioRad 7318122
Cholestrol Sigma C8667 Sigma grade 99%
SPDP Thermo Fisher Scientific 21857
DSPC Avanti 850365
DSPE-PEG 18:0 Avanti 880120
DSPE-PEG Maleimide Avanti 880126
Extruder Avanti 610000 1mL syringe with holder/heating block
Filters 0.1 µm Avanti 610005
Filters 0.8 µm Avanti 610009
10mm Filter Supports Avanti 6100014
Glass Round Bottom Flask Sigma Z100633
Turnover stoppers Thermo Fisher Scientific P-301398
Tubing Thermo Fisher Scientific P-198194
Leur Lock Thermo Fisher Scientific k4201634503
Sephadex G50 Beads GE Life Sciences 17004201
Sephadex G100 Beads GE Life Sciences 17006001
Heat Inactivated Fetal Calf Serum Thermo Fisher Scientific 10082147
HEPES (1M) Thermo Fisher Scientific 15630080
EGTA Sigma E3889
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
1x RBC lysis Buffer Thermo Fisher Scientific 00-4333-57
Indo-1 Invitrogen I1203
CD5-PE BioLegend 100608
B220-PE-Cy7 BioLegend 103222
HBSS Thermo Fisher Scientific 14170112 without calcium and magnesium
MgCl2 Sigma M8266
CaCl2 Sigma C4901
Fab anti-mouse IgM Jackson ImmunoResearch 115-007-020
F(ab')2 anti-mouse IgM Jackson ImmunoResearch 115-006-020
Peanut flour Golden Peanut Co. 521271 12% fat light roast, 50% protein
Animal feeding needles Cadence Science 7920 22g x 1.5", 1.25 mm – straight
Microprobe thermometer Physitemp BAT-12
Rectal probe for mice Physitemp Ret-3
Cholera toxin, from vibrio cholera List Biological Laboratories, Inc. 100B Azide free
BCA Protein Assay Kit Pierce 23225
Carbonate-bicarbonate buffer Sigma C3041
TMB Stop Solution KPL 50-85-06
SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 5120-0077
96 well Immulon 4HBX plate Thermo Scientific 3855
Purified soluble Ara h 2 N/A N/A purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology
HSA-DNP Sigma A-6661
Mouse IgE anti-DNP Accurate Chemical BYA60251
Sheep anti-Mouse IgE The Binding Site PC284
Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG Accurate Chemical JNS065003
NeutrAvidin Protein, HRP ThermoFisher Scientific 31001
Mouse IgG1 anti-DNP Accurate Chemical MADNP105
HRP Goat anti-mouse IgG1 Southern Biotech 1070-05
1 mL Insulin Syringes BD 329412 U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8")
Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-14 25 x 75 x 1.0 mm
ACK Lysing Buffer gibco by Life Technologies A10492-01 100 mL
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875093 500 mL
Cell Strainer Corning 352350 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Invitrogen NP0322BOX 10 gels
NuPAGE LDS buffer, 4X Invitrogen NP0008 250 mL
SeeBlue Plus2 Pre-stained standard Invitrogen LC5925 500 µL
NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X Invitrogen NP0002 500 mL
GelCode Blue Stain Thermo Scientific 24590 500 mL

References

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Cite This Article
Bednar, K. J., Hardy, L., Smeekens, J., Raghuwanshi, D., Duan, S., Kulis, M. D., Macauley, M. S. Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies. J. Vis. Exp. (140), e58285, doi:10.3791/58285 (2018).

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