Summary

Antigênicos lipossomas para a geração de anticorpos específicos de doença

Published: October 25, 2018
doi:

Summary

Descrito, é a preparação de nanopartículas lipossomas antigênicas e seu uso em estimulando células B ativação in vitro e em vivo. Respostas consistentes e robustas anticorpo levaram ao desenvolvimento de um novo modelo de alergia ao amendoim. O protocolo para a geração de lipossomas antigênicos pode ser estendido para antígenos diferentes e modelos de imunização.

Abstract

Respostas de anticorpos fornecer imunidade protetora crítica para uma grande variedade de agentes patogénicos. Ainda há um grande interesse na geração de anticorpos robustos para a vacinação, bem como entender como patogênico anticorpo respostas desenvolvem alergias e doenças auto-imunes. Gerar respostas robusto anticorpos antígeno-específicos não é sempre trivial. Em modelos do rato, muitas vezes requer várias rodadas de vacinas com adjuvante que leva a uma grande variabilidade nos níveis de anticorpos induzidos. Um exemplo é em modelos do rato de alergias do amendoim onde modelos mais robustos e reprodutíveis que minimizam o rato números e o uso de adjuvantes seria benéficos. Apresentado aqui é um modelo de mouse altamente reprodutível de anafilaxia alergia ao amendoim. Esse novo modelo baseia-se em dois fatores principais: (1) antígeno-específicas splenocytes enviaram são transferidos de um rato de amendoim-sensibilizados para um rato de destinatário ingênuo, normalizando o número de memória antígeno-específicas e T-células B através de um grande número de ratos; e (2) destinatários ratos são posteriormente impulsionou com um forte immunogen multivalentes na forma de nanopartículas lipossomas exibindo o alérgeno amendoim principal (Ara h 2). A grande vantagem deste modelo é sua reprodutibilidade, que em última análise, reduz o número de animais utilizados em cada estudo, minimizando o número de animais recebendo injeções múltiplas de adjuvante. A montagem modular destes lipossomas imunogênicas fornece adaptabilidade facile relativamente a outros modelos alérgicas ou auto-imune que envolvem anticorpos patogênicos.

Introduction

Alergia alimentar afeta 8% das crianças nos Estados Unidos e tem aumentado em prevalência nos últimos década1. Alergia a amendoim afeta 1% das crianças e não é tipicamente Superdimensonada2. Embora vários ensaios clínicos promissores estão em andamento para o tratamento de alergias alimentares, incluindo imunoterapia oral (OIT), imunoterapia sublingual (fenda) e imunoterapia epicutâneos (EPIT), existem actualmente sem estratégias de tratamento aprovado pela FDA para a dessensibilização alérgica a amendoim indivíduos3,4,5,6,7,8. Portanto, indivíduos alérgicos estritamente devem evitar alérgenos para evitar a anafilaxia. Muitas questões permanecem sobre rotas de sensibilização e subjacente mecanismos de desenvolvimento de alergia alimentar.

Modelos de mouse são uma ferramenta valiosa para estudar os mecanismos da alergia, bem como desenvolver novo tolerogenic e dessensibilização terapias9,10,11,12. Isto é especialmente verdadeiro porque o principal alérgeno de amendoim (Ara h 2; Ah2) em humanos é também o alérgeno dominante em vários descrito rato modelos13,14. Enquanto modelos de rato de alergia são inestimáveis no estudo de mecanismos de sensibilização e tolerância, uma desvantagem é que pode ser variável e requerem o uso de adjuvantes. Imunogenos mais potentes seria uma maneira de minimizar a variabilidade intrínseca de tais modelos. Uma vez que as células B são fortemente ativadas por antígenos multivalentes, lipossomas antigênicos exibindo o alérgeno são uma boa opção, devido à sua capacidade de potencialmente ativar as células B através do receptor de células B (BCR), enquanto também ter a propriedade de forma eficiente escorva do compartimento de células T através de ser usada por não-especificamente apresentadoras células.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para antígenos da proteína de nanopartículas lipossomas usando uma estratégia fácil e modular de conjugação. Usando um antígeno substituto, fragmento Fab anti-IgM, demonstramos como potente tais lipossomas antigênicos podem ser na ativação de células B estimulante. Antigênicos lipossomas exibindo Ah2 antígeno foram usados para desenvolver um novo modelo de rato de sensibilidade conferida. Neste modelo, splenocytes de verificadas amendoim ratos alérgicos, contendo memória de amendoim específicas células B e T, são transferidos para o ingênuo congenic ratos. Respostas de anticorpos de memória são induzidas pela injeção de lipossomas conjugados com Ah2 em ratos os destinatários, a fim de induzir anticorpos contra Ah2. Seguido por apenas um impulso com Ah2 solúvel, anticorpos específicos Ah2 dão origem a uma forte reação anafilática quando estes ratos posteriormente são desafiados com Ah2. Como ratos submetidos a reação alérgica respondem de uma forma altamente uniforme e não tem recebido um adjuvante, esta abordagem é um modelo desejável de alergia e os resultados sugerem que pode ter utilidade em outros modelos de rato conduzidos por antígenos dirigidos a alérgenos e possivelmente auto-antigénios.

Protocol

O método geral de acoplamento proteína lipídios e incorporação em lipossomas é amplamente baseado em anterior trabalho15. Todos os procedimentos de animais descritos abaixo foram aprovados pela Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill institucional Animal Care e Comissão de utilização (IACUC). Todos os ratos usados no modelo de alergia são fêmeas BALB/cJ compradas em 3 semanas de idade. A Universidade de Alberta cuidados com animais e usar Comité (ACUC) aprovou experimentos env…

Representative Results

Conjugação da proteína de interesse com DSPE-PEG(2000) pode ser demonstrada através da execução de um redutor mostrando um aumento no peso molecular em comparação com a proteína unconjugated. Figura 1A mostra um gel representativo de conjugação de fragmento de F(ab) de IgM antirato para PEG-DSPE, que mostra um bandshift de kDa 2-3 para a proteína desnaturada. Note-se que aproximadamente 50% da proteína parece ser modificado, que é esperado, dado…

Discussion

Os métodos descritos aqui são um protocolo geral para a conjugação de uma proteína para um lipídio que permite a exibição da proteína sobre nanopartículas lipossomas. Para grandes subunidade várias proteínas, este protocolo pode ter limitado utilitário. O método ideal seria a introdução de uma marca específica do site que permite que uma estratégia de ligação química biorthogonal ser usado. Se expressar as proteínas recombinantes, isto pode ser possível usando estratégias específicas disponíveis…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada por subsídios do departamento de defesa (W81XWH-16-1-0302 e W81XWH-16-1-0303).

Materials

Model 2110 Fraction Collector BioRad 7318122
Cholestrol Sigma C8667 Sigma grade 99%
SPDP Thermo Fisher Scientific 21857
DSPC Avanti 850365
DSPE-PEG 18:0 Avanti 880120
DSPE-PEG Maleimide Avanti 880126
Extruder Avanti 610000 1mL syringe with holder/heating block
Filters 0.1 µm Avanti 610005
Filters 0.8 µm Avanti 610009
10mm Filter Supports Avanti 6100014
Glass Round Bottom Flask Sigma Z100633
Turnover stoppers Thermo Fisher Scientific P-301398
Tubing Thermo Fisher Scientific P-198194
Leur Lock Thermo Fisher Scientific k4201634503
Sephadex G50 Beads GE Life Sciences 17004201
Sephadex G100 Beads GE Life Sciences 17006001
Heat Inactivated Fetal Calf Serum Thermo Fisher Scientific 10082147
HEPES (1M) Thermo Fisher Scientific 15630080
EGTA Sigma E3889
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
1x RBC lysis Buffer Thermo Fisher Scientific 00-4333-57
Indo-1 Invitrogen I1203
CD5-PE BioLegend 100608
B220-PE-Cy7 BioLegend 103222
HBSS Thermo Fisher Scientific 14170112 without calcium and magnesium
MgCl2 Sigma M8266
CaCl2 Sigma C4901
Fab anti-mouse IgM Jackson ImmunoResearch 115-007-020
F(ab')2 anti-mouse IgM Jackson ImmunoResearch 115-006-020
Peanut flour Golden Peanut Co. 521271 12% fat light roast, 50% protein
Animal feeding needles Cadence Science 7920 22g x 1.5", 1.25 mm – straight
Microprobe thermometer Physitemp BAT-12
Rectal probe for mice Physitemp Ret-3
Cholera toxin, from vibrio cholera List Biological Laboratories, Inc. 100B Azide free
BCA Protein Assay Kit Pierce 23225
Carbonate-bicarbonate buffer Sigma C3041
TMB Stop Solution KPL 50-85-06
SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 5120-0077
96 well Immulon 4HBX plate Thermo Scientific 3855
Purified soluble Ara h 2 N/A N/A purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology
HSA-DNP Sigma A-6661
Mouse IgE anti-DNP Accurate Chemical BYA60251
Sheep anti-Mouse IgE The Binding Site PC284
Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG Accurate Chemical JNS065003
NeutrAvidin Protein, HRP ThermoFisher Scientific 31001
Mouse IgG1 anti-DNP Accurate Chemical MADNP105
HRP Goat anti-mouse IgG1 Southern Biotech 1070-05
1 mL Insulin Syringes BD 329412 U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8")
Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-14 25 x 75 x 1.0 mm
ACK Lysing Buffer gibco by Life Technologies A10492-01 100 mL
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875093 500 mL
Cell Strainer Corning 352350 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Invitrogen NP0322BOX 10 gels
NuPAGE LDS buffer, 4X Invitrogen NP0008 250 mL
SeeBlue Plus2 Pre-stained standard Invitrogen LC5925 500 µL
NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X Invitrogen NP0002 500 mL
GelCode Blue Stain Thermo Scientific 24590 500 mL

References

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Cite This Article
Bednar, K. J., Hardy, L., Smeekens, J., Raghuwanshi, D., Duan, S., Kulis, M. D., Macauley, M. S. Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies. J. Vis. Exp. (140), e58285, doi:10.3791/58285 (2018).

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