Summary

الدهنية مولده لتوليد الأجسام المضادة الخاصة بالمرض

Published: October 25, 2018
doi:

Summary

ووصف هو إعداد جسيمات نانوية الاسمافرون مستضدي واستخدامها في تحفيز ب-خلية التنشيط في المختبر و في فيفو. استجابات جسم متسقة وقوية أدت إلى تطوير نموذج جديد لحساسية الفول السوداني. ويمكن تمديد البروتوكول من أجل توليد الدهنية مستضدي المستضدات المختلفة ونماذج التحصين.

Abstract

توفير استجابات جسم حرجة حصانة الحماية لمجموعة واسعة من العوامل الممرضة. لا يزال هناك مصلحة كبيرة في توليد أجسام مضادة قوية للتلقيح، فضلا عن فهم كيف الممرضة جسم تطوير الاستجابات في الحساسية وأمراض المناعة الذاتية. توليد استجابات قوية محددة مستضد الضد ليس دائماً تافهة. في نماذج الماوس، فإنه غالباً ما يتطلب جولات متعددة من التحصينات مع adjuvant الذي يؤدي إلى قدر كبير من التباين في مستويات الأجسام المضادة المستحث. مثال ذلك في نماذج الماوس من الحساسية الفول السوداني حيث سيكون من المفيد أكثر نماذج قوية واستنساخه أن تقليل إعداد الماوس واستخدام adjuvant. قدم هنا نموذج ماوس استنساخه بدرجة عالية من الحساسية المفرطة الحساسية الفول السوداني. هذا النموذج الجديد يعتمد على عاملين أساسيين: سبلينوسيتيس (1) على حدة مستضد أدوبتيفيلي نقل من ماوس توعية الفول السوداني إلى ماوس المتلقي ساذج، تطبيع عدد الذاكرة محددة مستضد خلايا ب وتي عبر عدد كبير من الفئران؛ ويتم بعد ذلك عزز الفئران المستفيدة (2) مع إيمونوجين متعددي قوية في شكل جسيمات نانوية الاسمافرون عرض حساسية الفول السوداني الرئيسية (ح ارا 2). والميزة الرئيسية لهذا النموذج هو في إمكانية تكرار نتائج، مما يقلل عدد الحيوانات المستخدمة في كل دراسة، مع التقليل من عدد الحيوانات تلقي حقنات متعددة من adjuvant في نهاية المطاف. وتوفر الجمعية وحدات من هذه الدهنية مكسبه التكيف سهلة نسبيا لنماذج أخرى الحساسية أو المناعة الذاتية التي تنطوي على الأجسام المسببة للأمراض.

Introduction

الحساسية الغذائية يؤثر على نسبة 8% أطفال في الولايات المتحدة، وقد زاد في الانتشار على مدى العقد1. يؤثر على 1 في المائة أطفال الحساسية للفول السوداني وليس المتضخمة عادة2. على الرغم من أن عدة تجارب سريرية واعدة تجري حاليا لعلاج الحساسية للأغذية، بما في ذلك العلاج المناعي عن طريق الفم (OIT) والعلاج المناعي تحت اللسان (الشق) ابيكوتانيوس المناعي (EPIT)، لا يوجد حاليا لا استراتيجيات العلاج التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير الفلورايد الأفراد حساسية الفول السوداني3،4،5،6،،من78. ولذلك، يجب أن دقة تجنب حساسية الأفراد حساسية لتجنب الحساسية المفرطة. تبقى العديد من الأسئلة فيما يتعلق بطرق التوعية والكامنة وراء آليات لتنمية الحساسية الغذائية.

نماذج الفأرة أداة قيمة لدراسة آليات الحساسية، فضلا عن تطوير توليروجينيك جديدة والحساسية العلاجات9،10،،من1112. وهذا صحيح بصفة خاصة نظراً لحساسية الفول السوداني الرئيسية (ارا ح 2؛ Ah2) في البشر هو أيضا وصف الحساسية الغالبة في عدة الماوس نماذج13،14. في حين لا تقدر بثمن في دراسة آليات التوعية والتسامح نماذج الماوس من حساسية الفول السوداني، هو عيب أنهم يمكن أن يكون متغير وتتطلب استخدام المواد المساعدة. إيمونوجينس أقوى هو السبيل الوحيد للحد من تقلب الجوهرية لهذه النماذج. حيث يتم تنشيط الخلايا البائية بشدة من متعددي مولدات المضادات، مولده الدهنية عرض الحساسية خيار جيد بسبب قدرتها لتنشيط الخلايا البائية يحتمل أن تكون من خلال مستقبلات الخلية ب (المركز) بينما أيضا وجود ملك لكفاءة فتيلة حجرة تي خلية عن طريق يجري تناولها غير تحديداً بعرض مستضد الخلايا.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل للتصريف المستضدات البروتين إلى جسيمات نانوية الاسمافرون استخدام استراتيجية سهلة ووحدات. استخدام مستضد مركب، ويفتت المضادة IgM القوات المسلحة البوروندية، نبدي قوية كيف يمكن أن تكون هذه الدهنية مولده في تحفيز ب-خلية التنشيط. واستخدمت الدهنية مستضدي عرض مستضد Ah2 تطوير نموذج ماوس جديدة الممنوحة للحساسية. في هذا النموذج، يتم نقل سبلينوسيتيس من التحقق من الفئران حساسية الفول السوداني، التي تحتوي على ذاكرة خاصة بالفول السوداني ب وخلايا تي، في الفئران كونجينيك ساذج. هي استجابات جسم الذاكرة الناجم عن حقن الدهنية مترافق مع Ah2 في الفئران المستفيدة، من أجل حمل الأجسام المضادة ضد Ah2. تليها دفعة واحدة فقط مع Ah2 القابلة للذوبان، الأجسام المضادة Ah2 محددة تؤدي إلى استجابة قوية تحسسي عند وتحدي هذه الفئران في وقت لاحق مع Ah2. كما الفئران تمر الارتكاس التحسسي الاستجابة بطريقة موحدة إلى حد كبير ولم نتلق adjuvant، هذا النهج نموذج مرغوب فيه حساسية الفول السوداني والنتائج تشير إلى أن التقرير قد يكون أداة في نماذج أخرى الماوس مدفوعا بمولدات المضادات التي تستهدف المواد المسببة للحساسية، وربما أوتوانتيجينس.

Protocol

الأسلوب العام من اقتران البروتين للدهن وإدماج في الدهنية يستند إلى حد كبير سابق عمل15. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الواردة أدناه بجامعة كارولاينا الشمالية في “تشابل هيل رعاية الحيوان المؤسسية” واستخدام اللجنة (إياكوك). جميع الفئران المستخدمة في نموذج حساسية الف?…

Representative Results

يمكن إثبات تصريف بروتين الاهتمام مع DSPE-PEG(2000) التي تعمل تقليل تظهر زيادة في الوزن الجزيئي بالمقارنة مع البروتين أونكونجوجاتيد. يظهر الشكل 1A هلام ممثل للماوس المضادة IgM F(ab) يفتت الاقتران على شماعة-دسب، مما يدل باندشيفت 2 – 3 كاتشين للبروتين التشويه والتحريف….

Discussion

الأساليب المذكورة هنا هي بروتوكول عام لتصريف البروتين إلى دهن الذي يتيح عرض البروتين على جسيمات نانوية الاسمافرون. للبروتينات فرعية متعددة كبير جداً، وقد يكون هذا البروتوكول محدودة الأداة المساعدة. وسيكون الأسلوب المثالي الأخذ بالعلامة الخاصة بالموقع التي تمكن استراتيجية ربط بيورثوجو?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا البحث المنح المقدمة من وزارة الدفاع (W81XWH-16-1-0302 و W81XWH-16-1-0303).

Materials

Model 2110 Fraction Collector BioRad 7318122
Cholestrol Sigma C8667 Sigma grade 99%
SPDP Thermo Fisher Scientific 21857
DSPC Avanti 850365
DSPE-PEG 18:0 Avanti 880120
DSPE-PEG Maleimide Avanti 880126
Extruder Avanti 610000 1mL syringe with holder/heating block
Filters 0.1 µm Avanti 610005
Filters 0.8 µm Avanti 610009
10mm Filter Supports Avanti 6100014
Glass Round Bottom Flask Sigma Z100633
Turnover stoppers Thermo Fisher Scientific P-301398
Tubing Thermo Fisher Scientific P-198194
Leur Lock Thermo Fisher Scientific k4201634503
Sephadex G50 Beads GE Life Sciences 17004201
Sephadex G100 Beads GE Life Sciences 17006001
Heat Inactivated Fetal Calf Serum Thermo Fisher Scientific 10082147
HEPES (1M) Thermo Fisher Scientific 15630080
EGTA Sigma E3889
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
1x RBC lysis Buffer Thermo Fisher Scientific 00-4333-57
Indo-1 Invitrogen I1203
CD5-PE BioLegend 100608
B220-PE-Cy7 BioLegend 103222
HBSS Thermo Fisher Scientific 14170112 without calcium and magnesium
MgCl2 Sigma M8266
CaCl2 Sigma C4901
Fab anti-mouse IgM Jackson ImmunoResearch 115-007-020
F(ab')2 anti-mouse IgM Jackson ImmunoResearch 115-006-020
Peanut flour Golden Peanut Co. 521271 12% fat light roast, 50% protein
Animal feeding needles Cadence Science 7920 22g x 1.5", 1.25 mm – straight
Microprobe thermometer Physitemp BAT-12
Rectal probe for mice Physitemp Ret-3
Cholera toxin, from vibrio cholera List Biological Laboratories, Inc. 100B Azide free
BCA Protein Assay Kit Pierce 23225
Carbonate-bicarbonate buffer Sigma C3041
TMB Stop Solution KPL 50-85-06
SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 5120-0077
96 well Immulon 4HBX plate Thermo Scientific 3855
Purified soluble Ara h 2 N/A N/A purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology
HSA-DNP Sigma A-6661
Mouse IgE anti-DNP Accurate Chemical BYA60251
Sheep anti-Mouse IgE The Binding Site PC284
Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG Accurate Chemical JNS065003
NeutrAvidin Protein, HRP ThermoFisher Scientific 31001
Mouse IgG1 anti-DNP Accurate Chemical MADNP105
HRP Goat anti-mouse IgG1 Southern Biotech 1070-05
1 mL Insulin Syringes BD 329412 U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8")
Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-14 25 x 75 x 1.0 mm
ACK Lysing Buffer gibco by Life Technologies A10492-01 100 mL
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875093 500 mL
Cell Strainer Corning 352350 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Invitrogen NP0322BOX 10 gels
NuPAGE LDS buffer, 4X Invitrogen NP0008 250 mL
SeeBlue Plus2 Pre-stained standard Invitrogen LC5925 500 µL
NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X Invitrogen NP0002 500 mL
GelCode Blue Stain Thermo Scientific 24590 500 mL

References

  1. Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
  2. Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
  3. Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
  4. Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468 (2014).
  5. Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242 (2017).
  6. Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
  7. Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
  8. Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
  9. Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
  10. Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
  11. Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
  12. Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
  13. Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
  14. Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
  15. Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
  16. Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
  17. Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
  18. Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
  19. Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
  20. LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281 (2018).
  21. Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
  22. Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
  23. Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
  24. Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
  25. Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
  26. Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
  27. Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).

Play Video

Cite This Article
Bednar, K. J., Hardy, L., Smeekens, J., Raghuwanshi, D., Duan, S., Kulis, M. D., Macauley, M. S. Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies. J. Vis. Exp. (140), e58285, doi:10.3791/58285 (2018).

View Video