Beskrivs är utarbetandet av antigena liposomalt nanopartiklar och deras användning i stimulerande B-cells aktivering in vitro- och in-vivo. Konsekvent och robust antikroppssvar ledde till utvecklingen av en ny jordnötsallergi modell. Protokollet för att generera antigena liposomer kan utvidgas till olika antigener och immunisering modeller.
Antikroppssvar ge kritiska skyddande immunitet mot ett brett spektrum av patogener. Det finns fortfarande ett stort intresse i att generera robusta antikroppar för vaccination samt förstå hur patogena antikroppen Svaren utvecklar allergier och autoimmuna sjukdomar. Generera robusta antigen-specifika antikroppen svaren är inte alltid trivial. I musmodeller kräver det ofta flera rundor av vaccinationer med adjuvant som leder till en hel del variation i nivåerna av inducerade antikroppar. Ett exempel är i musmodeller av jordnötter allergier där mer stabila och reproducerbara modeller som minimerar mus nummer och användning av adjuvant skulle vara fördelaktigt. Presenteras här är en mycket reproducerbara musmodell av jordnötsallergi anafylaxi. Denna nya modell bygger på två viktiga faktorer: (1) antigen-specifika splenocytes överförs adoptively från en jordnöt-sensibiliserad mus till en naiv mottagarens mus, normalisera antalet antigen-specifika minne B – och T-celler över ett stort antal möss; och (2) mottagaren möss är därefter boostade med en stark multivalenta immunogen i form av liposomalt nanopartiklar visar det stor jordnöt allergenet (Ara h 2). Den stora fördelen med denna modell är dess reproducerbarhet, vilket i slutändan minskar antalet djur som användes i varje studie, samtidigt minimera antalet djur flera injektioner av adjuvans. Modulär montering av dessa immunogent liposomer ger relativt lättköpt anpassningsförmåga till andra allergiska eller autoimmuna modeller som innebär patogena antikroppar.
Matallergi påverkar 8% av barnen i USA, och har ökat i prevalens under senaste decenniet1. Allergi mot jordnöt drabbar 1% av barn och är inte vanligtvis urvuxna2. Även om flera lovande kliniska prövningar pågår för behandling av födoämnesallergi, inklusive orala immunterapi (OIT), sublingual immunterapi (SLIT) och epikutan immunterapi (EPIT), finns det för närvarande ingen FDA-godkända behandlingsstrategier för okänsliggöra jordnöt-allergiska personer3,4,5,6,7,8. Allergiska personer måste därför strikt undvika allergener för att undvika anafylaxi. Många frågor återstår när det gäller rutter av sensibilisering och underliggande mekanismer av mat allergi utveckling.
Musmodeller är ett värdefullt verktyg för studerar mekanismer för allergi samt utveckla nya tolerogena och hyposensibilisering terapier9,10,11,12. Detta gäller särskilt eftersom det stor jordnöt allergenet (Ara h 2; Ah2) hos människa är också det dominerande allergenet i flera beskrivs mus modeller13,14. Medan musmodeller av jordnötsallergi är ovärderligt för att studera mekanismer av sensibilisering och tolerans, är en nackdel att de kan vara variabel och kräver användning av tillsatsmedel. Mer potent immunogens skulle vara ett sätt att minimera det inneboende variabilitet av sådana modeller. Eftersom B-celler aktiveras starkt av multivalenta antigener, är antigen liposomer visar allergen ett bra alternativ på grund av deras förmåga att potentiellt aktivera B-celler via B-cells receptor (BCR) medan också har egenskapen för effektivt grundning T-cell kupén genom tas upp icke-specifikt av antigen-presenterande celler.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för konjugera proteinantigener för liposomalt nanopartiklar med en lättköpt och modulär strategi. Använda en surrogat antigen, anti-IgM Fab-fragment, vi visar hur potent sådant antigen liposomer kan vara stimulerande B-cells aktivering. Antigena liposomer visar Ah2 antigen användes för att utveckla en ny musmodell av tillerkänner känslighet. I denna modell överförs splenocytes från verifierade jordnöt allergisk möss, som innehåller jordnötter-specifika minne B – och T-celler, till naiva congenic möss. Minne-antikroppssvar induceras av injektion av liposomer konjugerat med Ah2 in mottagarens möss, för att inducera antikroppar mot Ah2. Följt av endast en boost med lösliga Ah2, ger Ah2-specifika antikroppar upphov till en stark anafylaktisk reaktion när dessa möss utmanas därefter med Ah2. Möss som genomgår den allergiska reaktionen reagerar mycket enhetligt och inte har fått ett adjuvans, detta tillvägagångssätt är en önskvärd jordnötsallergi modell och resultaten tyder på att det kan ha nytta i andra musmodeller som drivs av antigener som riktas allergener och eventuellt autoantigener.
De metoder som beskrivs här är ett allmänt protokoll för konjugationen av ett protein till en lipid som möjliggör visning av proteinet på liposomalt nanopartiklar. För mycket stora multi subenhet proteiner, har detta protokoll begränsad nytta. Den idealiska metoden skulle vara införandet av en platsspecifik tagg som möjliggör en biorthogonal kemisk länka strategi som ska användas. Om uttrycker proteinet recombinantly, kan detta vara möjligt med hjälp av tillgängliga platsspecifika strategier<sup class="x…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöds av bidrag från Department of Defense (W81XWH-16-1-0302 och W81XWH-16-1-0303).
Model 2110 Fraction Collector | BioRad | 7318122 | |
Cholestrol | Sigma | C8667 | Sigma grade 99% |
SPDP | Thermo Fisher Scientific | 21857 | |
DSPC | Avanti | 850365 | |
DSPE-PEG 18:0 | Avanti | 880120 | |
DSPE-PEG Maleimide | Avanti | 880126 | |
Extruder | Avanti | 610000 | 1mL syringe with holder/heating block |
Filters 0.1 µm | Avanti | 610005 | |
Filters 0.8 µm | Avanti | 610009 | |
10mm Filter Supports | Avanti | 6100014 | |
Glass Round Bottom Flask | Sigma | Z100633 | |
Turnover stoppers | Thermo Fisher Scientific | P-301398 | |
Tubing | Thermo Fisher Scientific | P-198194 | |
Leur Lock | Thermo Fisher Scientific | k4201634503 | |
Sephadex G50 Beads | GE Life Sciences | 17004201 | |
Sephadex G100 Beads | GE Life Sciences | 17006001 | |
Heat Inactivated Fetal Calf Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
1x RBC lysis Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4333-57 | |
Indo-1 | Invitrogen | I1203 | |
CD5-PE | BioLegend | 100608 | |
B220-PE-Cy7 | BioLegend | 103222 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | without calcium and magnesium |
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
CaCl2 | Sigma | C4901 | |
Fab anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-007-020 | |
F(ab')2 anti-mouse IgM | Jackson ImmunoResearch | 115-006-020 | |
Peanut flour | Golden Peanut Co. | 521271 | 12% fat light roast, 50% protein |
Animal feeding needles | Cadence Science | 7920 | 22g x 1.5", 1.25 mm – straight |
Microprobe thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Rectal probe for mice | Physitemp | Ret-3 | |
Cholera toxin, from vibrio cholera | List Biological Laboratories, Inc. | 100B | Azide free |
BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
Carbonate-bicarbonate buffer | Sigma | C3041 | |
TMB Stop Solution | KPL | 50-85-06 | |
SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 5120-0077 | |
96 well Immulon 4HBX plate | Thermo Scientific | 3855 | |
Purified soluble Ara h 2 | N/A | N/A | purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology |
HSA-DNP | Sigma | A-6661 | |
Mouse IgE anti-DNP | Accurate Chemical | BYA60251 | |
Sheep anti-Mouse IgE | The Binding Site | PC284 | |
Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG | Accurate Chemical | JNS065003 | |
NeutrAvidin Protein, HRP | ThermoFisher Scientific | 31001 | |
Mouse IgG1 anti-DNP | Accurate Chemical | MADNP105 | |
HRP Goat anti-mouse IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
1 mL Insulin Syringes | BD | 329412 | U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8") |
Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-14 | 25 x 75 x 1.0 mm |
ACK Lysing Buffer | gibco by Life Technologies | A10492-01 | 100 mL |
RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | 500 mL |
Cell Strainer | Corning | 352350 | 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen | NP0322BOX | 10 gels |
NuPAGE LDS buffer, 4X | Invitrogen | NP0008 | 250 mL |
SeeBlue Plus2 Pre-stained standard | Invitrogen | LC5925 | 500 µL |
NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X | Invitrogen | NP0002 | 500 mL |
GelCode Blue Stain | Thermo Scientific | 24590 | 500 mL |