Summary

Antijenik lipozomlar hastalığa özgü antikorların üretimi için

Published: October 25, 2018
doi:

Summary

Açıklanan antijenik liposomal nano tanecikleri ve kullanımları uyarıcı B-hücre harekete geçirmek vitro ve in vivohazırlıktır. Tutarlı ve güçlü antikor yanıt-e doğru yeni bir fıstık alerjisi model gelişmesine yol açtı. Antijenik lipozomlar oluşturmak için protokol farklı antijenleri ve bağışıklama modeller için genişletilebilir.

Abstract

Antikor yanıt patojenlerin geniş bir dizi kritik koruyucu bağışıklık sağlar. Aşılama nasıl patojen antikor yanıt-e doğru geliştirmek alerjileri ve otoimmün hastalığı anlamak yanı sıra güçlü antikor üreten bir yüksek ilgi kalır. Sağlam antijen spesifik antikor yanıt üreten her zaman önemsiz değildir. Fare modellerinde bu kez Aşı indüklenen antikor düzeyleri değişkenlik büyük bir yol açar adjuvan ile birden fazla mermi gerektirir. Fıstık alerjisi nerede fare numaraları ve adjuvan kullanımını en aza indirmek daha sağlam ve tekrarlanabilir modelleri faydalı olacağını fare modellerinde bir örnektir. Burada sunulan bir çok tekrarlanabilir fare fıstık alerjisi anafilaksi modeldir. Bu yeni model iki önemli faktöre dayanıyor: (1) antijen spesifik splenocytes adoptively aktarılır bir fıstık hassas fare fareler; büyük bir takım karşısında antijen spesifik bellek B ve T hücrelerinin sayısı normale saf alıcı fare içine ve (2) alıcı fareler daha sonra büyük fıstık allerjen (Ara h 2) görüntüleme liposomal nano tanecikleri şeklinde güçlü multivalent immunogen ile artırdı. Bu model büyük avantajı sonuçta birden çok adjuvan enjeksiyonlari alma hayvan sayısını en aza indirirken her çalışmada kullanılan hayvan sayısını düşürür, tekrarlanabilirlik olmasıdır. İmmunojenik Bu lipozomlar modüler montaj patojenik antikorlar içeren diğer alerjik ya da otoimmün modelleri için nispeten facile uyum sağlar.

Introduction

Besin allerjisi ABD çocuklarda % 8’i etkiler ve yaygınlığı son artmıştır on yıl1. Fıstık alerjisi çocuk % 1’i etkiler ve genellikle geçmek2değil. Birkaç umut verici klinik çalışmalarda oral immünoterapi (OIT), sublingual immünoterapi (yırtık) ve epicutaneous immünoterapi (EPIT), dahil olmak üzere gıda alerji tedavisi için devam etmektedir rağmen orada şu anda yok FDA onaylı tedavi stratejileri Fıstık alerjisi bireyler3,4,5,6,7,8desensitizing için. Bu nedenle, Alerjik kişiler kesinlikle alerjenler anafilaksi önlemek için kaçınmak gerekir. Çok soru Sensitizasyonu yolları ile ilgili olarak ve mekanizmaları gıda Anti gelişiminin temel kalır.

Fare modelleri Anti mekanizmaları eğitim hem de yeni tolerogenic ve duyarsızlaştırma terapiler9,10,11,12geliştirmek için değerli bir araç vardır. Bu özellikle doğrudur çünkü büyük fıstık allerjen (Ara h 2; Ah2) insanlarda olduğunu da birkaç baskın alerjen açıklanan fare modelleri13,14. Fıstık alerjisi fare modelleri mekanizmaları Sensitizasyonu ve hoşgörü eğitim çok değerli olmakla birlikte, bir onlar değişken olabilir ve adjuvan kullanımını gerektiren dezavantajıdır. Daha güçlü immunogens modelleri gibi içsel değişkenliği en aza indirmek için bir yol olurdu. B-hücreleri şiddetle multivalent antijenleri tarafından etkinleştirilir beri antijenik lipozomlar alerjen görüntüleme yeteneklerini nedeniyle potansiyel olarak B-hücreleri de mülkiyeti verimli bir şekilde sahip iken B hücre reseptörü (BCR) etkinleştirmek için iyi bir seçenek vardır Özellikle antijen-sunarak alınan ile T-hücre bölmesi priming hücreleri.

Burada, protein antijenleri için facile ve modüler bir strateji kullanarak liposomal nano tanecikleri conjugating için detaylı bir protokol açıklayın. Kullanarak bir vekil antijen, anti-IgM Fab parçası, biz göstermek nasıl güçlü antijenik böyle lipozomlar uyarıcı B-hücre harekete geçirmek içinde olabilir. Antijenik lipozomlar toplam sayı Ah2 antijen bir yeni doğan duyarlılık fare modeli geliştirmek için kullanıldı. Bu modelde, splenocytes fıstık özel bellek B ve T hücreleri, içeren doğrulanmadı fıstık alerjisi fareler gelen saf congenic fareler aktarılır. Bellek antikor yanıt Ah2 karşı antikor ikna etmek için alıcı fareler Ah2 ile Birleşik lipozomlar enjeksiyon tarafından indüklenir. Ne zaman bu fareler daha sonra Ah2 ile meydan çözünür Ah2 ile tek bir artırmak ardından, Ah2 özel antikorlar neden bir güçlü anafilaktik yanıt-e doğru olmaktadır. Alerjik reaksiyon geçiren fareler son derece düzgün bir şekilde yanıt ve bir adjuvan almadım, bu yaklaşım bir arzu fıstık alerjisi modeldir ve sonuçları bu yardımcı programı diğer fare modelleri yönelik antijenleri ile tahrik olabilir öneririz alerjenler ve muhtemelen autoantigens.

Protocol

Lipid ve lipozomlar birleşmeyle için protein kaplin genel yöntem büyük ölçüde önceki çalışma15üzerinde temel alır. Aşağıda açıklanan tüm hayvan yordamları Chapel Hill kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Kuzey Carolina Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Fıstık alerjisi modelinde kullanılan tüm fareler BALB/cJ dişiler 3 haftalık satın vardır. Alberta Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanmak Komitesi (ACUC) C57Bl/6 fareler en az 6 hafta-in ya?…

Representative Results

Konjugasyon protein DSPE-PEG(2000) ile ilgi gösterilen moleküler ağırlık çekimsiz protein göre azalan bakiyeli bir artış çalıştırarak göstermiş olabilir. Şekil 1A Anti-fare IgM F(ab) parçası konjugasyon temsilcisi bir jel PEG-DSPE, 2-3 kDa bandshift denatüre protein için gösterir gösterir. Protein yaklaşık % 50’si değiştirilecek, verilen bu 1:1 stoichiometry ağır ve hafif zincir heterodimerdir olduğunu Fab parçası üzerinde elde…

Discussion

Burada özetlenen bir protein için protein liposomal nano tanecikleri üzerinde görüntülenmesini sağlayan bir lipid konjugasyon için genel bir iletişim kuralı yöntemlerdir. Çok büyük çok alt birim proteinler için bu protokolü yardımcı programını sınırlı olabilir. İdeal Yöntem bir biorthogonal kimyasal bağlanma strateji kullanılmak üzere sağlayan bir siteye özgü etiket getirilmesi olacaktır. Protein recombinantly ifade, bu mevcut siteye özgü stratejileri17ve fonksiy…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma hibe (W81XWH-16-1-0302 ve W81XWH-16-1-0303) Savunma Bakanlığı tarafından desteklenmiştir.

Materials

Model 2110 Fraction Collector BioRad 7318122
Cholestrol Sigma C8667 Sigma grade 99%
SPDP Thermo Fisher Scientific 21857
DSPC Avanti 850365
DSPE-PEG 18:0 Avanti 880120
DSPE-PEG Maleimide Avanti 880126
Extruder Avanti 610000 1mL syringe with holder/heating block
Filters 0.1 µm Avanti 610005
Filters 0.8 µm Avanti 610009
10mm Filter Supports Avanti 6100014
Glass Round Bottom Flask Sigma Z100633
Turnover stoppers Thermo Fisher Scientific P-301398
Tubing Thermo Fisher Scientific P-198194
Leur Lock Thermo Fisher Scientific k4201634503
Sephadex G50 Beads GE Life Sciences 17004201
Sephadex G100 Beads GE Life Sciences 17006001
Heat Inactivated Fetal Calf Serum Thermo Fisher Scientific 10082147
HEPES (1M) Thermo Fisher Scientific 15630080
EGTA Sigma E3889
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
1x RBC lysis Buffer Thermo Fisher Scientific 00-4333-57
Indo-1 Invitrogen I1203
CD5-PE BioLegend 100608
B220-PE-Cy7 BioLegend 103222
HBSS Thermo Fisher Scientific 14170112 without calcium and magnesium
MgCl2 Sigma M8266
CaCl2 Sigma C4901
Fab anti-mouse IgM Jackson ImmunoResearch 115-007-020
F(ab')2 anti-mouse IgM Jackson ImmunoResearch 115-006-020
Peanut flour Golden Peanut Co. 521271 12% fat light roast, 50% protein
Animal feeding needles Cadence Science 7920 22g x 1.5", 1.25 mm – straight
Microprobe thermometer Physitemp BAT-12
Rectal probe for mice Physitemp Ret-3
Cholera toxin, from vibrio cholera List Biological Laboratories, Inc. 100B Azide free
BCA Protein Assay Kit Pierce 23225
Carbonate-bicarbonate buffer Sigma C3041
TMB Stop Solution KPL 50-85-06
SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 5120-0077
96 well Immulon 4HBX plate Thermo Scientific 3855
Purified soluble Ara h 2 N/A N/A purified as in: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology
HSA-DNP Sigma A-6661
Mouse IgE anti-DNP Accurate Chemical BYA60251
Sheep anti-Mouse IgE The Binding Site PC284
Biotinylated Donkey anti-Sheep IgG Accurate Chemical JNS065003
NeutrAvidin Protein, HRP ThermoFisher Scientific 31001
Mouse IgG1 anti-DNP Accurate Chemical MADNP105
HRP Goat anti-mouse IgG1 Southern Biotech 1070-05
1 mL Insulin Syringes BD 329412 U-100 Insulin, 0.40 mm(27G) x 16.0 mm (5/8")
Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-14 25 x 75 x 1.0 mm
ACK Lysing Buffer gibco by Life Technologies A10492-01 100 mL
RPMI 1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875093 500 mL
Cell Strainer Corning 352350 70 μm Nylon, White, Sterile, Individually packaged
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Invitrogen NP0322BOX 10 gels
NuPAGE LDS buffer, 4X Invitrogen NP0008 250 mL
SeeBlue Plus2 Pre-stained standard Invitrogen LC5925 500 µL
NuPAGE MES/SDS running buffer, 20X Invitrogen NP0002 500 mL
GelCode Blue Stain Thermo Scientific 24590 500 mL

References

  1. Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
  2. Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
  3. Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
  4. Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468 (2014).
  5. Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242 (2017).
  6. Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
  7. Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
  8. Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
  9. Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
  10. Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
  11. Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
  12. Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
  13. Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
  14. Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
  15. Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
  16. Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
  17. Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
  18. Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
  19. Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
  20. LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281 (2018).
  21. Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
  22. Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
  23. Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
  24. Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
  25. Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
  26. Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
  27. Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).

Play Video

Cite This Article
Bednar, K. J., Hardy, L., Smeekens, J., Raghuwanshi, D., Duan, S., Kulis, M. D., Macauley, M. S. Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies. J. Vis. Exp. (140), e58285, doi:10.3791/58285 (2018).

View Video