Summary
Vi udviklede protokoller og designet en brugerdefineret apparater at aktivere integrering af millimeter-skala enheder. Vi præsenterer prøve forberedelse procedurer med vægt på integrering i akryl harpiks og polyimid slanger for at opnå stive immobilisering og langtidsopbevaring af prøver for afhøring af væv arkitektur og celle morfologi af mikro-CT.
Abstract
For over hundrede år, har den histologiske undersøgelse af væv været guldstandarden for medicinsk diagnose fordi histologi giver alle celletyper i alle væv at være identificeret og karakteriseret. Vores laboratorium arbejder aktivt for at gøre teknologiske fremskridt i X-ray mikro-beregnet tomografi (mikro-CT), der vil bringe histologi diagnostiske magt til studiet af fuld væv diskenheder på cellulære opløsning (dvs., en X-ray Histo-Tomography modalitet). Mod denne ende, har vi gjort målrettede forbedringer til prøven forberedelse rørledning. En central optimering, og fokus for den nuværende arbejde, er en enkel metode til stive indlejring af faste og farves millimeter-skala prøver. Mange af de offentliggjorte metoder for eksempel immobilisering og korrelationsmaalinger mikro-CT billeddannelse stole på markedsføring prøverne i paraffinvoks, Agarosen eller væsker såsom alkohol. Vores tilgang udvider dette arbejde med brugerdefinerede procedurer og udformningen af en 3-dimensional printable apparat at integrere prøverne i en akryl harpiks direkte i polyimid slanger, som er relativt gennemsigtig til x-stråler. Prøven forberedelse procedurer er beskrevet for prøver fra 0,5 til 10 mm i diameter, som ville være velegnet til hele zebrafisk larver og ungfisk, eller andre dyr og vævsprøver af tilsvarende dimensioner. Som proof of concept, har vi indlejret prøver fra Danio, Drosophila, dafnierog en mus embryoner; repræsentative billeder fra 3-dimensionelle scanninger for tre af disse prøver er vist. Vigtigere, fører vores metodologi til flere fordele, herunder stive immobilisering, langsigtet bevaring af møjsommeligt lavet ressourcer og evnen til at re afhøre prøver.
Introduction
Fænotyper er observerbare træk af en organisme, der repræsenterer konsekvenserne af unikke interaktioner mellem dens genetiske baggrund og miljø. Disse kendetegn kan omfatte adfærdsmæssige, biokemiske, morfologiske, udviklingsmæssige og fysiologiske egenskaber. Vigtigere, kan forskellene i træk mellem vildtype organismer og genetisk mutanter give vigtige indsigt i de mekanismer og funktioner af berørte gener. Med hensyn til morfologi, histopatologi er guld standard for vurdering af fænotyper på cellulært niveau, men lider af mekaniske artefakter og tillader ikke præcise kvantitative volumetrisk analyse1. Vores laboratorium er motiveret til at overvinde hindringer for anvendelsen af histologi diagnostiske magt til fulde væv diskenheder med submicron opløsning.
En undersøgelse af tilgængelige teknologier foreslår at billeddannelse af X-ray mikro-beregnet tomografi (mikro-CT) kan give ideelle kapaciteter til millimeter-skala hele dyr 3-dimensionelle (3D) histologi. Mikro-CT kan ikke-destruktiv, isotropic, 3D visualisering og evnen til at gennemføre kvantitative analyser af væv arkitektur1,2. I de seneste år, 3D imaging af unstained og metal-farvede zebrafisk af micro-CT har fået stigende trækkraft og er blevet udnyttet til volumetrisk analyse af flere væv, herunder muskler, tænder, knogle og fedtvæv3,4 ,5,6,7,8,9,10. Andre modelorganismer og væv enheder er også indstillet til micro-CT billeddannelse. For eksempel, er en rørledning blevet indført for kvantificering tætte mesoscale Neuroanatomi af musen hjerner afbildet via synkrotron mikro-CT11. Tilsvarende, en eosin-baserede farvnings-protokollen har vist sig at være velegnet til bløde væv mikro-CT billeddannelse af hele musen organer12. Morfometrisk analyse af unstained menneskelige L3 ryghvirvler og visualisering af sølv-farvede menneskelige lungerne ved hjælp af micro-CT har vist nytten af denne teknologi for menneskelige prøver13,14.
For at aktualisere den store løfte af micro-CT for komplet morfologiske fænotyper intakt smådyr og væv prøver, skal en række forhindringer overvindes i forhold til gennemløb, opløsning, field-of-view, omfattende celle farvning, og langtidsholdbarhed. Mens hver af disse aspekter er kritisk vigtigt, er fokus for det foreliggende manuskript optimering af indlejring procedurer, med yderligere noter på prøve fiksering og farvning. Heavy metal farvning er nyttig, fordi den iboende modsætning mellem forskellige bløde væv i micro-CT billederne er lav. Styrken af forskellige metal pletter, osmium dinitrogentetraoxid, jod, phosphorwolfram syre (PTA) og gallocyanin-chromalum, for at forbedre kontrasten for micro-CT billeddannelse har været undersøgt15,16,17. Uranyl acetat har også været brugt som en kontrastfarve agent for micro-CT billeddannelse af knogle og brusk18,19. PTA som bruges i vores protokol fører til konsekvent farvning af næsten alle væv og celler i hele zebrafisk prøver, giver billeder der er potentielt kompatibel med histologi-lignende undersøgelser gennem fuld mængder af væv.
I løbet af micro-CT image erhvervelse, en 2-dimensional (2D) projektion er taget som prøven roteres ved en brøkdel af en grad og gentages, indtil prøven er gennemført en 180° og 360° rotation, generere en serie af tusindvis af 2D fremskrivninger bruges til de rekonstruktion af 3D bind20. I denne proces, vil enhver undertrykkelse af netbårne prøveemnets forårsage de tilsvarende 2D fremskrivninger at være ude af trit, hvilket resulterer i dårligt rekonstruerede 3D diskenheder. Prøven immobilisering er en måde at korrigere for dette problem og nogle aktuelle strategier indebærer nedsænkning prøven i alkohol eller integrering i Agarosen i polypropylen rør eller mikropipette tips3,5,15, 16 , 21 , 22. flydende nedsænkning metoder er ikke ideel, fordi prøven bevægelse under image erhvervelse kan forekomme mellem imaging sæt, hvilket resulterer i skiftede rekonstruktioner af 3D bind23. Endvidere er det velkendt, at den fysiske stabilitet af væske-gemt vævsprøver er fattige i tidsskalaer fra måneder til år, som følge af kemiske ustabilitet og overflade slid forbundet med bevægelse af kontaktpunkter mellem prøve og container væg ( personlige observationer med faste dyrs og menneskers vævsprøver).
For at reducere potentialet for prøven bevægelse under imaging, prøver kan være indlejret i Agarosen24,25,26, men denne praksis er forbundet med risiko for pletten spreder til Agarosen dermed reducere billede kontrast26. Derudover væske eller Agarosen præparater er udsat for fysiske skader og nedbrydes med tiden, hvilket gør dem uegnet til prøven langtidsopbevaring. Vi begrundede, at en potentielt vellykket og ligetil prøve immobilisering metode kunne tilpasses fra, bruges til elektron mikroskopi prøver. Polymeriserede resiner såsom EPON 812 (udgået og erstattet af integrere 812) er almindeligt anvendt til at give den hårdhed, der kræves for at generere ultratynde sektioner for elektronmikroskopi27,28. Ja, flere sammenlignende studier mellem røntgenoptagelser og elektronmikroskopi har vist, at de prøver, der er indkapslet i harpiks kan være afbildet af X-ray mikroskopi29,30. Men nogle af de standard praksis af elektronmikroskopi Oversæt ikke direkte til micro-CT billeddannelse. For eksempel, mikro-CT billeddannelse af prøver med firkant harpiks kanter af typiske harpiks blokke og prøver skæres fra disse blokke er forbundet med kanten diffraktion artefakter, der kan forstyrre billeddannelse. Udjævning af harpiks kanter, mens muligt, er besværlig og tidskrævende.
Mens en række plast indlejring harpiks er ansat i elektronmikroskopi, førte høj baggrunden forbundet med sværere harpiks såsom integrere 812 os at teste andre. Vi valgte LR hvid på grund af sin lav viskositet, lav krympning, lav tendens til form bobler under polymerisation og lavere baggrund. Skabe kanten-gratis prøver og minimere mængden af harpiks omkring prøven, udviklede vi protokoller for at tegne prøver i flydende harpiks i polyimid slanger før polymerisering. Polyimid blev valgt for sin høj termisk stabilitet og høj X-ray transmittans så at fjernelse af slangen ikke er nødvendig for billeddannelse. Endelig, vi designet en brugerdefineret mikropipette adapter til vores prøve indlejring teknik for at pålideligt holde slangen og forebygge forurening af Mikropipetter. Adapteren kan være 3D udskrives fra en CAD billedfil. Tilsammen, er målet med prøven præparationsmetoder præsenteres her at gøre integrering af små prøver mere ligetil, opnå forbedret farvning kontrast, stive immobilisering og langtidsopbevaring af intakt millimeter-skala enheder.
Protocol
Alle procedurer på levende dyr blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) ved Pennsylvania State University.
1. dag 1: fiksering
- For at forbedre fiksering og reducere mængden af gut indholdet, sulte ungfisk for mindst 24 h for 10 mm modellen, eller længere for større enheder (fx., 72 timer til 14 mm modellen).
- Pre chill 10% Neutral Buffered Formalin (NBF) og 2 x Tricaine-S (MS-222, 400 mg/L) på is til 4 ° C.
- Dobbelt fisk vandmængde med kølet 2 x MS-222 for hurtige og humane eutanasi.
- Vente 30 s (larver) til 60 s (unge fugle) efter fiskene stopper flytter.
- Fordyb fisk i kølet 10% NBF i 10 min.
- Ordne fisken i kølet 10% NBF løsning overnatning i fladbundede containere ved stuetemperatur.
Bemærk: Fladbundede beholdere skal minimere bøjning af modellen. Volumen af fiksativ og løsninger af alle efterfølgende trin bør være mindst 20 gange sample volumen, medmindre andet er angivet. For 1-5 larve zebrafisk er den anbefalede løsning volumen mindst 1 mL. Utilstrækkelig Fikseringsvæske resulterer i dårlig fiksering og et overskud af reagens volumen påvirker ikke negativt resultat af den beskrevne procedure. Til fuldstændig fiksation af større fisk, skar maven starter lidt foran anal pore. Bruge minimal indtrængning af saks eller kniv og anvende blid kraft fra fisken mens der skæres for at minimere skader på indre organer. Fiksering protokoller har været beskrevet af andre31,32,33.
2. dag 2: Dehydrering & farvning
- Skyl faste prøver 3 gange i 1 x phosphat bufferet saltvand (PBS) pH 7,4 i 10 min.
- Dykke prøver i 35% ethanol (EtOH) i 20 min. ved stuetemperatur med blid agitation.
Bemærk: Alle trin, blid agitation, bruge en bordplade shaker og indstillet til en blanding virkning samtidig omhyggeligt undgå bumpe og gnide af prøven mod container overflader. - Dykke prøver i 50% EtOH i 20 min. ved stuetemperatur med blid agitation.
- Opløs phosphorwolfram syre (PTA) pulver i vand for at forberede en 1% w/v stamopløsning.
- Fortyndes 1% PTA stamopløsningen 3:7 i 100% EtOH at opnå en 0,3% PTA Farvningsopløsningen.
- Pletten prøver overnatning i 0,3% PTA løsning ved stuetemperatur med blid agitation.
3. dag 3: Infiltration
- Forbered 1:1 v/v blanding af 100% EtOH og LR hvid akryl harpiks og der er afsat.
- Skyl 3 gange i 70% EtOH i 10 min.
- Dykke prøver i 90% EtOH i 30 min. ved stuetemperatur med blid agitation.
- Dykke prøver i 95% EtOH i 30 min. ved stuetemperatur med blid agitation.
- Dykke prøver to gange i 100% EtOH i 30 min. ved stuetemperatur med blid agitation.
- Dykke prøver i 1:1 EtOH og LR hvid akryl harpiks blandingen natten over ved stuetemperatur med blid agitation.
4. dag 4: indlejring
- Dykke prøver i 100% LR hvid harpiks i 2 timer ved stuetemperatur med blid agitation.
- Erstatte harpiks i trin 4.1 med friske 100% LR hvid harpiks og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur med blid agitation.
- Samle indlejring apparatet (figur 1).
- Skære polyimid slange passende diameter og længde.
Bemærk: Slanger med en indvendig diameter på mindst 0,1 mm større end diameteren af modellen anbefales. For typiske enheder bruges standard længde 30 mm af slanger til hver prøve. Når det ønskes, kan aflange prøver rummes ved hjælp af længere slange.- Vedhæfte en P1000 mikropipette til den brede ende af indlejring adapteren og indsætte polyimid slangen til den smalle ende (figur 1 c). Hvis den indlejring adapter ikke er tilgængelig, skal du gå til trin 4.3.3. Ellers fortsætter med at skridt 4.4.
- Klip ud i slutningen af en mikropipette spids lige over således at polyimid slangesættet passer stramt. Skære på 44 mm fra den brede ende af en 200 µL gule mikropipette tip til 0.0403" slanger og 59 mm fra bunden af 1 mL blå tip til 0,105" slangen. Trim efter behov.
- Tillægge en mikropipette cut mikropipette tip.
- Overføre prøverne til en lille vejer båden eller V-formet løsning basin og fuldt dykke prøver i 100% LR hvid harpiks.
- Med apparatet indlejring fra trin 4.3 sigte slangen på den brede ende af faste prøven (eller mod hovedet for animalske prøver) og afpipetteres modellen langsomt i slangen. Anbring prøven i midten af slangen og sikre slanger over og under prøven er fyldt med harpiks.
- Der afpipetteres prøven i slangen sådan, at prøven er i den naturlige, fremadrettede retning.
Bemærk: Langsom pipettering undgår luftbobler og modellen skader forårsaget af slid imod slanger kant. Baglæns bevægelse ind i slangen kan nemt beskadige ekstremiteterne (arme og ben, vinger, finner, osv.). Det anbefales at lade nogle harpiks overløb i indlejring apparatet så senere, luft ikke ind i slangen under fjernelse.
- Der afpipetteres prøven i slangen sådan, at prøven er i den naturlige, fremadrettede retning.
- Straks seal den åbne ende med olie-baseret blød modellering ler.
- Tromle leret ind i en 1 mm tyk ark.
- Stabilisere slangen mellem indeks og midterste fingre.
- Tryk langsomt på ler mod enden af slangen med tommelfingeren.
- Fjern overskydende ler.
- Fjerne integrering apparatet fra mikropipette.
- Træk slangen af blide rotation og forsegle anden enden med ler.
- Hold en finger mod den lukkede ende at forhindre udslyngning af ler.
- Langsomt skubbe ulukkede slutningen af slangen i leret.
- Placere slangen vandret og polymerisere harpiks i 24 timer ved 65 ° C.
Bemærk: Horisontal placering undgår prøve bevægelse under polymerisation. Hvis en lille mængde luft var fanget i trin 4.8, kan ende med en luftboble være forhøjet lidt for at forhindre luft boble bevægelse mod prøven. Vigtigere, kan for meget elevation under polymerisering forårsage modellen at falde mod den lave ende på grund af tyngdekraften. En korrekt indlejret prøve er vist i forhold til en med en luftboble, som bør undgås, fordi refraktion fra air/harpiks grænseflader kan forringe billedkvaliteten (figur 2).
5. dag 5: samling
- Indsamle prøver for image erhvervelse i slutningen af dagen 5.
Bemærk: Fjernelse af polyimid slanger er mulig, men ikke nødvendigt for billeddannelse. Synkrotron-baseret mikro-CT billeddannelse for zebrafisk prøven blev udført på Beamline 2-BM på avanceret Photon kilde (APS) i Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA). PTA-farvede zebrafisk, en optimal X-ray energy række 5-30 keV var bestemt, og en X-ray energi af 13,8 keV blev brugt til billedbehandling. 1501 fremskrivninger blev indhentet på 13,8 keV over 180 grader (1 projektion hver 0,12 grader) med et 2048 ved 2048 pixel kamera. Derudover blev to flade-felt (gevinst) billeder (en i begyndelsen) og en for enden af erhvervelse og en mørk-feltet billede også overtaget. Mørke- og flad-feltet korrektioner, ring artefakt reduktion og billede genopbygning blev udført ved hjælp af open source TomoPy toolkit34. PTA-farvede dafnier og Drosophila prøver blev afbildet på en X-ray mikroskop12,35. Specifikke mikro-CT indstillinger er afhængig af objektet og kvaliteten af pletten. For eksempel, Drosophila modellen blev scannet på 40 kVp, 74 mA og 15 s med en voxel opløsning på 3,10 × 3.10 × 3.10 µm3.
Representative Results
Protokollen beskrevet ovenfor detaljer forberedelse eksempelprocedure for hele zebrafisk larver og yngel til micro-CT billeddannelse. Navnlig, denne metode er let tilpasses til andre prøver typer (fx., Drosophila, dafnier, Arabidopsis, mus organer). Inkubation times i forskellige trin er passende for zebrafisk larver og prøver af lignende størrelse; større prøver kan kræve længere inkubation. For at hjælpe med prøven indlejring skridt, vi har designet en adapter, der tillægger en 1 mL mikropipette, og kan tilpasses til forskellige størrelser af polyimid slanger (figur 1). Denne brugerdefineret adapter var 3D udskrives fra en CAD-fil, der er forbundet med dette manuskript og tilgængelig for download fra http://publications.chenglab.com/LinEtAlJOVE/. Da alle læsere ikke kan har adgang til en 3D printer, er montering af en hjemmelavet indlejring apparater bruger mikropipette tips beskrevet i protokol (trin 4.3). Et succesfuldt integreret zebrafisk larve er vist i forhold til en model med en luftboble (figur 2), som vil sandsynligvis forringe billedkvaliteten. For at demonstrere alsidigheden af proceduren for indlejring, viser vi prøverne fra forskellige modelorganismer (dvs., Danio, Drosophila, dafnier, mus embryo) der har været igennem prøven forberedelse rørledningen ( Figur 3). Rekonstrueret 3D mængder af hele Danio, dafnierog Drosophila prøver afbildet af micro-CT er vist (figur 4). Vigtigere, som det fremgår af eksemplet Danio , kan disse prøver opbevares i en længere periode og genbruges for flere billeddannelse sessioner (figur 5).
Figur 1. Indlejring apparater. (A) en adapter er designet til lette integrering ved hjælp af fælles laboratorium værktøjer. (B) en tværsnits illustration af adapteren. C integrering apparater efter indsættelse af polyimid slangen på adapter punkt (a) og vedhæfter mikropipette på adapter punkt (c). Adapter segment (b) er et overløb kammer designet til at rumme overskydende resin og beskytte mikropipette mod forurening. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Succesfuldt integrerede enheder er luftbobler. A en integreret 3 dag efter befrugtning (dpf) larve zebrafisk uden luftboble. (B) en integreret 3 dpf zebrafisk med en luftboble. Luft fanget under indlejring processen kan bevæge sig mod modellen, hvis prøven ikke er placeret vandret under polymerisering. Skalere barer = 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. En bred vifte af enheder kan integreres med vores protokol. (A) 7 dpf zebrafisk larve. (B) voksen Drosophila. C voksne dafnier. (D) mus embryo. Større prøver såsom mus embryo er indkvarteret af et par ændringer til protokollen. Kort, polyimid slangen var fyldt til 1/3 af dens længde med harpiks og polymeriserede forud for indlejring. Fast og farves prøven var anbragt oven på den pre-polymeriseret resin. Slangen var så fyldt med un-polymeriseret resin efterfulgt af en anden polymerisering. Polyimid slangen var fjernet inden fotografering at tillade bedre visualisering af prøven i denne figur. Fjernelse af slangen er ikke nødvendige for vellykket billede erhvervelse af mikro-CT. skala barer: prøven billeder, 5 mm; udvidet mellemværker, 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 4. 3-dimensionelle gengivelser af integrerede enheder. (A) rekonstrueret 3 dpf zebrafisk larve på 0.743 × 0.743 × 0.743 µm3 voxel opløsning. B rekonstrueret voksne dafnier (3 × 3 × 3 µm3 voxel opløsning). C rekonstrueret voksen Drosophila (3,1 × 3.1 × 3.1 µm3 voxel opløsning). Digital tværsnit kan genereres i enhver vinkel, som vist til venstre kolonne. Overflade puds er vist til højre, gengives ved hjælp af kommerciel software. Indlejring harpiks kan ses i alle scanninger uden for stikprøven (bemærket af *), men ikke interfererer med prøven selv. Zebrafisk larve var afbildet ved Argonne National Laboratory på den avancerede Photon kilde, der er baseret på synkrotron. Dafnier eller Drosophila modellerne blev afbildet med en kommerciel X-ray mikroskop. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Prøver integreret med vores protokol kan være igen afbildet med mikro-CT. De samme 5 dpf zebrafisk larve blev afbildet i 2011 (A) og (B) 2013, præsenteret som gennemsnitlig intensitet fremskrivninger af den sagittal udsigt. Billede sammenligning mellem scanninger efter oplagring viser bevarelsen af anatomiske funktioner. (C) et nærbillede af muskel fra begge scanninger præsenteres med segmenterede linjer med angivelse af tilsvarende regioner bruges til (D) intensitet profil generation. Intensitet profiler normaliseret til deres tilsvarende gennemsnit langs begge linjer Vis rumligt matchende lokale toppe i begge scanninger. (E) gennemsnitlig intensitetsværdier for udvalgte områder i A og B tilhører baggrund (Bg, lilla), neuronal kerner (Nielsen, grønne), hvide substans (W, blå), og muskel (M, orange) blev opdelt af et gennemsnit for baggrund (hvid) og bruges til at generere signal-støj forhold (SNR), hvilket svarer godt mellem scanninger. Skalere barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
I dette manuskript præsenterer vi en detaljeret protokol for stive immobilisering af faste og farves millimeter-skala (0,5 til 2,5 mm diameter) prøver for micro-CT billeddannelse. I betragtning af den hurtige fremrykning af micro-CT teknologi med hensyn til opløsning og hastighed, er en metode til permanent prøve bevarelse med re-tænkelig kapaciteter ønskeligt. Traditionelt tætte indlejring harpiks er almindeligt anvendt i elektronmikroskopi for at yde strukturel støtte for at skær ultratynde sektioner og minimere skaderne på modellen. Vores metode er tilpasset dets anvendelse til stive immobilisering under ikke-destruktiv billedbehandling. For at minimere de billeddannelse artefakter fra tilstedeværelsen af overskydende resin, har vi implementeret brugen af X-ray gennemsigtig polyimid slanger at oprette runde prøver uden kanter og begrænse mængden af harpiks omkring prøven.
Optimal resultatet af proceduren for indlejring er betinget af omhyggelig udførelse af flere kritiske trin og opmærksomhed at prøve integritet gennem hele proceduren. Faktisk vil skader modellen resultere i en kompromitteret endelige billede uanset succes i udførelsen af billedbehandling. Da køling bidrager til en formindskelse af smerte svar, og ikke optagne væv nedbrydes hurtigere ved højere temperaturer, bruger vi pre kølet reagenser. Store eksemplarer kan skal skæres for at tillade indrejse af fiksativ i indersiden af modellen, så interne organer såsom lever, bugspytkirtel og gut er helt fast. Ikke fastspændte væv forringes og mister strukturelle integritet, ødelægge biologiske struktur. Et andet vigtigt skridt er at opretholde modellen i sin naturlige justering. Derfor, vi går ind for brugen af fladbundede containere, som vi bruger hele proceduren og er især vigtigt i løbet af fiksering. Fiksering i polypropylen rør eller koniske rør, der normalt har en V-formet bund bør undgås, fordi de kan forårsage aflange prøver at bøje, som fordrejer den naturlige morfologi af modellen. Derudover for at minimere brugen af harpiks, er den indvendige diameter af polyimid slangen kun lidt større end bredden af modellen. Bøjning af prøven kan også resultere i skader til modellen da den går ind i slangen. Det anbefales også at overføre modellen ind i slangen i en naturlig fremadrettet måde at undgå skadelige ekstremiteter. Ordentlig dehydrering er en anden afgørende skridt. Dette opnås med små intervaller af stigende EtOH koncentrationer langsomt erstatte vand med EtOH, som er mere blandbar med harpiks. Store stigninger i EtOH koncentration er associeret med væv svind og kan blive forbedret af yderligere forhøjelser af EtOH inkubation at gøre overgangen mere gradvis. Endelig, for at minimere bevægelse af prøven eller luft lommer, hvis der er nogen, prøverne er placeret vandret under resin polymerisation (slutningen af dag 4). Luftlommer eller fugemasse ud for modellen forårsager optisk artefakter med X-ray imaging tilknyttet kant diffraktion, reducere billedkvaliteten.
Med hensyn til mulige ændringer til protokollen, andre indlejring harpiks og metal pletter kan bruges i stedet for LR hvid akryl og PTA, henholdsvis. Embed812, en epoxy-harpiks, der er almindeligt anvendt i elektronmikroskopi, er meget tyktflydende, vanskeligere at overføre, kan forårsage forvrængning af enhederne, og er forbundet med højere baggrund end acryl eller glycol methacrylat harpiks. Mens JB4 Plus en glykol methylmethacrylat, er mindre tyktflydende end EMbed812 og har lavere baggrund, tilfældige dannelsen af luftlommer ofte forekommer i prøven. Som nævnt, luftlommer forringe billedkvaliteten og er særligt problematisk for dyrebare prøver. Det er værd at bemærke, at Technovit 7100, en anden glycol methylmethacrylat, forstyrrer PTA farvning, hvilket resulterer i dårlig kontrast i det endelige billede. Relativt, LR hvid akryl har vand-lignende viskositet, lav baggrund, og forstyrrer ikke PTA farvning. I vores hænder er succesraten for indlejring i LR hvid uden prøve skader eller luft bobler mere end 95%. Af disse grunde går vi ind for dets anvendelse som indlejring harpiks til tissue micro-CT. Med hensyn til pletter, resultatet af forskellige metal pletter såsom osmium dinitrogentetraoxid, jod, og PTA i micro-CT billeddannelse er blevet sammenlignet og diskuteret andetsteds15,16,17 og er omfattet af dette Håndskriftet.
Prøvestørrelse er en stor begrænsning til vores nuværende protokol. Da vi beskæftiger suge at overføre enheder ind i slangen, er evnen til at se modellen kritisk for orientering og sikre, at det er faktisk i slangen. Som et resultat, sub millimeter prøver som Tardigrade (dvs., vand bjørne) er yderst vanskeligt at integrere fordi de kræver brug et mikroskop for at visualiseres. Når sug anvendes, mikroskopiske prøver er let kan blive væk fra brændplanet og blive udfordrende at genopdage, hvilket gør det vanskeligt at bestemme, hvis de gik for langt gennem den vedlagte ende af slangen. Større prøver, såsom mus embryoner, (3-10 mm) kan integreres med mindre ændringer til indlejring protokollen (figur 4D). Især var polyimid slangen fyldt til 1/3 med flydende harpiks, som var polymeriserede forud for indlejring. Fast og farves prøven var anbragt oven på den pre-polymeriseret resin. Slangen var derefter fuldt fyldt med un-polymeriseret resin og efterfulgt af en anden polymerisering.
Betydningen af vores indlejring protokol er mangfoldige. Stift immobiliseret hele dyret eller væv prøver er ønskeligt for årsager, herunder: (1) at skabe langsigtede depoter af prøver, der er vanskelige at generere eller forberede; (2) generhvervelse af data; (3) aktivering serial imaging bruger flere billeddiagnostiske modaliteter; og (4) giver standarder for kalibrering og teknologisk udvikling. Prøver forberedt med vores indlejring procedure er indkapslet i solid harpiks, der er modstandsdygtige mod skader og kan derfor nemt opbevares måske på ubestemt tid. Langtidsopbevaring er især nyttigt for sjældne eller møjsommeligt genererede prøver som dem, der er forbundet med phenome projekter. Yderligere, at de digitale data går tabt, at data kan fremskaffes fra den oprindelige prøve. Evnen til at re-tænkelig over en lang periode potentielt giver mulighed for den samme prøve at blive afhørt med mere avancerede imaging modaliteter i fremtiden. Da prøverne er fysisk stabilt mellem imaging forekomster, er billeder erhvervet fra den samme prøvemateriale i den samme retning, at lette registrering mellem tidligere og senere datasæt. For eksempel, kan en lav opløsning billede kun tillade segmenteringen af væv i en zebrafisk larve. De samme larve kan senere være re-afbildet på højere opløsning så at mere detaljerede beregningsmæssige analyser på cellulære opløsning. Denne mulighed for direkte sammenligning mellem registrerede scanninger foreslår harpiks-embedded prøver som en standard for teknologiudvikling af mikro-CT. potentiale Virkningerne af enhver ændring billedmetoden kan vurderes af imaging den samme prøve, således at alle variabler i stikprøven præparationstrin er kontrolleret. Endelig kan en harpiks-embedded standardprøve bruges til instrument kalibrering til at teste for ensartethed af imaging.
Vores tidligere arbejde undersøge mutant og syge fisk histologi viste at cellulære opløsning giver mulighed for påvisning af subtile abnormiteter i væv struktur, der er overset i brutto undersøgelse ved hjælp af de dissekere mikroskop36eller en energibesparende stereo-mikroskop. Vi ønsker at udvide vores høj opløsning analyser til menneskelige prøver. Zebrafisk larver, der omfatter den primære genstand for vores udviklingsarbejde, ligner menneskelige nål biopsier i deres skrøbelighed, cellulære og intercellulære væv heterogenitet, størrelse (1-3 mm i diameter) og aflange. Baseret på vores omfattende erfaring med zebrafisk og andre arbejde viser mikro-CT med held farves og scannet humant væv, om end på et lavere opløsning37, forventer vi vores strategier til at bringe merværdi til billedbehandling og analyse af nålen biopsier. Vi har anslået, at montering af et kit tilstrækkeligt til en forberedelse af op til 20 prøver af den samme betingelse at være potentielt mindre end 30 USD. De prøver, der er udarbejdet af vores indlejring metode er resistente mod fysiske skader og derfor let at transportere. Lave omkostninger og lethed af transport foreslå muligheden af udtagning af prøver fra hele verden, især områder, hvor cellulære opløsning imaging med micro-CT ikke er let tilgængelige. Vores vision er for høj opløsning digitale filer af nålen biopsier (lige fra 0,1 til flere terabytes) aktivere oprettelsen af et digitalt atlas over menneskelige væv, og samtidig tillade forskere til at forfine og forbedre nuværende analyse rørledninger til lokalisering og kvantitative karakterisering af cellulære og væv arkitektur i fuld 3D forbindelse med væv scannet.
Disclosures
Alle forfatterne erklærer, at ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Roland Myers for venligst at give de oprindelige TEM-protokoller. Derudover vil vi gerne takke Dr. John Colbourne for at give dafnier modellen, Dr. Santhosh Girirajan for at give Drosophila modellen og Dr. Fadia Kamal for at give mus embryo. Efterforskerne anerkende finansieringen støtte fra NIH (1R24OD18559-01-A2, PI: KCC), Jake Gittlen laboratorier for kræftforskning, og pilot award støtte fra PSU Huck institutter på biovidenskabelige og Institut for CyberScience.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Phosphotunstic Acid | VWR | MK282402 | |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | MS-222 | |
| LR White | Electron Microscopy Sciences | 14380 | |
| Polyimide tubing (ID 0.04") | Nordson Medical | 141-0065 | The exact polyimide tubings described in the manuscript are no longer available. A close match is provided here. Tubing with custom diameter can be manufactured upon request. |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Oil-based soft modeling clay | Sculpey | S302 001 | |
| Micropipette P200 | Gilson | F123601 | |
| Micropipette P1000 | Gilson | F123502 | |
| Glass vials | VWR | 66015-042 | |
| V-shaped basin | VWR | 89094-676 | |
| Weigh boats | VWR | 10803-148 | |
| 200 μL yellow micropipette tip | Fisher Scientific | 02-707-500 | |
| 1 mL blue micropipette tip | Fisher Scientific | 02-681-163 | |
| Tabletop shaker | Thermolyne | M71735 | |
| Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 CCD | |
| X-ray microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa |
References
- Cheng, K. C., Katz, S. R., Lin, A. Y., Xin, X., Ding, Y. Whole-organism cellular pathology: a systems approach to phenomics. Advances in Genetics. 95, 89-115 (2016).
- Cheng, K. C., Xin, X., Clark, D., La Riviere, P. Whole-animal imaging, gene function, and the zebrafish phenome project. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 620-629 (2011).
- Vågberg, W., Larsson, D. H., Li, M., Arner, A., Hertz, H. M. X-ray phase-contrast tomography for high-spatial-resolution zebrafish muscle imaging. Scientific Reports. 5, 16625 (2015).
- Bruneel, B., et al. Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies. Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).
- Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
- Silvent, J., et al. Zebrafish skeleton development: High resolution micro-CT and FIB-SEM block surface serial imaging for phenotype identification. PLoS One. 12 (12), e0177731 (2017).
- Hur, M., et al. MicroCT-based phenomics in the zebrafish skeleton reveals virtues of deep phenotyping in a distributed organ system. eLife. 6, e26014 (2017).
- J, S. Whole-body imaging of a hypercholesterolemic female zebrafish by using synchrotron X-ray micro-CT. Zebrafish. 12 (1), 11-20 (2015).
- Hasamura, T., et al. Green tea extract suppresses adiposity and affects the expression of lipid metabolism genes in diet-induced obese zebrafish. Nutrition and Metabolism. 9 (1), 73 (2012).
- Meguro, S., Hasumura, T., Hase, T. Body fat accumulation in zebrafish is induced by a diet rich in fat and reduced by supplementation with green tea extract. PLoS One. 10 (3), e0120142 (2015).
- Dyer, E. L., et al. Quantifying mesoscale neuroanatomy using X-ray microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Perilli, E., Parkinson, I. H., Reynolds, K. J. Micro-CT examination of human bone: from biopsies towards the entire organ. Ann Inst Super Sanita. 48 (1), 75-82 (2012).
- Watz, H., Breithecker, A., Rau, W. S., Kriete, A. Micro-CT of the human lung: imaging of alveoli and virtual endoscopy of an alveolar duct in a normal lung and in a lung with centrilobular emphysema - initial observations. Radiology. 236 (3), 1053-1058 (2005).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Pauwels, E., Van Loo, D., Cornillie, P., Brabant, L., Van Hoorebeke, L. An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250 (1), 21-31 (2013).
- Kün-Darbois, J. D., Manero, F., Rony, L., Chappard, D. Contrast enhancement with uranyl acetate allows quantitative analysis of the articular cartilage by microCT: Application to mandibular condyles in the BTX rat model of disuse. Micro. 97, 35-40 (2017).
- Tang, S. Y., Vashishth, D. A non-invasive in vitro technique for the three-dimensional quantification of microdamage in trabecular. Bone. 40 (5), 1259-1264 (2007).
- Elliott, J. C., Dover, S. D. X-ray microtomography. Journal of Microscopy. 126 (Pt 2), 211-213 (1982).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping). PLoS Genetics. 2 (4), e61 (2006).
- Larsson, D. H., Vågberg, W., Yaroshenko, A., Yildirim, A. Ö, Hertz, H. M. High-resolution short-exposure small-animal laboratory x-ray phase-contrast tomography. Scientific Reports. 6, 39074 (2016).
- Pleissis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 5, 1011 (2017).
- Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321 (2013).
- Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, L. P., Henkelman, R. M. Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-CT. Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).
- Hsu, C. W., et al. Three-dimensional microCT imaging of mouse development from early post-implantation to early postnatal stages. Developmental Biology. 419 (2), 229-236 (2017).
- Luft, J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 409-414 (1961).
- Hayat, M. A., Giaquinta, R. Rapid fixation and embedding for electron microscopy. Tissue Cell. 2 (2), 191-195 (1970).
- Handschuh, S., Baeumler, N., Schwaha, T., Ruthensteiner, B. A correlative approach for combining microCT, light and transmission electron microscopy in a single 3D scenario. Frontiers in Zoology. 10, 44 (2013).
- Bushong, E. A., et al. X-ray microscopy as an approach to increasing accuracy and efficiency of serial block-face imaging for correlated light and electron microscopy of biological specimens. Microscopy and Microanalysis. 21 (1), 231-238 (2015).
- Tsao-Wu, G. S., Weber, C. H., Budgeon, L. R., Cheng, K. C. Agarose-embedded tissue arrays for histologic and genetic analysis. Biotechniques. 25 (4), 614-618 (1998).
- Sabaliauskas, N. A., et al. High-throughput zebrafish histology. Methods. 39 (3), 246-254 (2006).
- Copper, J. E., et al. Comparative analysis of fixation and embedding techniques for optimized histological preparation of zebrafish. Comparative Biochemistry and Physiology. 208, 38-46 (2018).
- Gürsoy, D., De Carlo, F., Xiao, X., Jacobsen, C. TomoPy: a framework for the analysis of synchrotron tomographic data. J Synchrotron Radiat. 21 (Pt 5), 1188-1193 (2014).
- Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21 (2), 10-15 (2013).
- Thomas, G. K. A molecular and systems biology analysis of pleiotropic vertebrate phenotypes (Doctoral dissertation). , Retrieved from the Penn State Electronic Theses and Dissertations Database (2009).
- Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano- tomography. Scientific Reports. 5, 10074 (2015).
