Summary
Wij protocollen ontwikkeld en ontworpen een aangepaste apparatuur om insluiten van millimeter-schaal specimens. We presenteren monsterbereidingsprocedures met de nadruk op het insluiten in acryl hars en polyimide buizen om rigide immobilisatie en langdurige opslag van specimens voor de ondervraging van architectuur en cel morfologie van weefsels door micro-CT.
Abstract
Meer dan honderd jaar, is het histologisch onderzoek van weefsels al de gouden standaard voor medische diagnose omdat histologie alle celtypes in elk weefsel toestaat kunnen worden geïdentificeerd en gekarakteriseerd. Ons laboratorium is actief bezig om technologische vooruitgang maken in X-ray micro-berekend tomografie (micro-CT) die de diagnostische kracht van histologie aan de studie van volledige weefsel volumes bij cellulaire resolutie zal brengen (dwz., een röntgenfoto Histo-tomography modaliteit). Richting van dit doel hebben we gerichte verbeteringen in de sample voorbereiding pijpleiding. Één van de belangrijkste optimalisatie, en de focus van het huidige werk, is een eenvoudige methode voor het insluiten van de rigide van vaste en gebeitst millimeter-schaal monsters. Veel van de gepubliceerde methoden voor monster immobilisatie en oereenstemming micro-CT beeldvorming vertrouwen op het plaatsen van de monsters in paraffine, agarose of vloeistoffen zoals alcohol. Onze aanpak strekt zich uit dit werk met aangepaste procedures en het ontwerp van een 3-dimensionale afdrukbare toestel niet blootstellen aan de monsters in een acryl hars rechtstreeks insluiten in polyimide buizen, die relatief transparant aan x-stralen. Hierin worden monsterbereidingsprocedures beschreven voor de monsters van 0,5 tot 10 mm in diameter, die geschikt voor hele zebrafish larven en jonge exemplaren, of andere dieren zijn zou en weefselsteekproeven met vergelijkbare afmetingen. Als bewijs van concept, hebben wij ingesloten de specimens van Danio, Drosophila, Daphniaen een muis embryo; representatieve beelden van 3-dimensionale scans voor drie van deze monsters worden weergegeven. Belangrijk is dat leidt onze methodologie tot meerdere voordelen, met inbegrip van rigide immobilisatie, op lange termijn behoud van hulpbronnen moeizaam gemaakt, en de mogelijkheid om opnieuw het ondervragen van monsters.
Introduction
Fenotypen zijn waarneembare kenmerken van een organisme dat de gevolgen van unieke interacties tussen haar genetische achtergrond en het milieu vertegenwoordigen. Deze kenmerken kunnen gedrags, biochemische, morfologische, ontwikkelingsstoornissen en/of fysiologische eigenschappen bevatten. Nog belangrijker is, kunnen verschillen in kenmerken tussen wild-type organismen en genetische mutanten bieden belangrijke inzicht in de mechanismen en de functies van de betrokken genen. Met betrekking tot de morfologie, Histopathologie is de gouden standaard voor de beoordeling van de fenotypen op cellulair niveau maar lijdt aan mechanische artefacten en kan geen nauwkeurige kwantitatieve analyse van de volumetric1. Ons laboratorium is gemotiveerd om de belemmeringen voor de toepassing van de diagnostische kracht van histologie naar volledige weefsel volumes bij submicron resolutie.
Een overzicht van beschikbare technologieën suggereert dat beeldvorming door X-ray micro-berekend tomografie (micro-CT) voorschrijven ideale vermogens die nodig zijn voor millimeter-schaal geheel-dier 3-dimensionale (3D) histologie. Micro-CT maakt niet-destructief, isotrope, 3D visualisatie en de mogelijkheid om het kwantitatieve analyse van weefsel het platform1,2. In de afgelopen jaren 3D beeldvorming van onbevlekt en metaal gebeitste zebrafish door micro-CT heeft opgedaan steeds tractie en is gebruikt voor volumetric analyse van verschillende weefsels, met inbegrip van spier-, tanden-, bot- en vetweefsel3,4 ,5,6,7,8,9,10. Andere modelorganismen en weefsel exemplaren zijn ook vatbaar voor micro-CT beeldvorming. Bijvoorbeeld, is een pijpleiding geïntroduceerd voor het kwantificeren van de neuroanatomie van het dichte MESOSCHAAL van muis hersenen beeld via synchrotron micro-CT11. Een op basis van eosine kleuring protocol blijkt ook geschikt voor zacht weefsel micro-CT beeldvorming van hele muis organen12. Morfometrische analyse van onbevlekt menselijke L3 wervels en de visualisatie van zilver gebeitste menselijke longen met behulp van micro-CT is gebleken dat het nut van deze technologie voor menselijke monsters13,14.
Om het actualiseren van de grote belofte van micro-CT voor volledige morfologische fenotypering van intact kleine dieren en weefsel monsters, moet een aantal hindernissen worden overwonnen met betrekking tot resolutie, veld-of-view, doorvoer, uitgebreide cel kleuring, en behoud op lange termijn. Terwijl elk van deze aspecten is van cruciaal belang, is de focus van het huidige manuscript de optimalisatie van insluiten procedures, met extra notities steekproef fixatie en kleuring. Heavy metal kleuring is nuttig omdat het inherente contrast tussen verschillende zachte weefsels in micro-CT-beelden laag is. De potentie van verschillende metalen vlekken, zoals osmium tetroxide, jodium, phosphotungstic zuur (PTA) en gallocyanin-chromalum, ter verbetering van contrast voor micro-CT beeldvorming geweest bestudeerde15,16,17. Uranyl acetaat is ook gebruikt als een contrasterende agent voor micro-CT beeldvorming van botten en het kraakbeen18,19. PTA zoals gebruikt in ons protocol leidt tot consistente kleuring van bijna alle weefsels en cellen in de hele zebrafish specimens, levert beelden die potentieel compatibel zijn met histologie-achtige studies via volledige volumes van weefsel.
Tijdens micro-CT Beeldacquisitie, een 2-dimensionale (2D) projectie is genomen zoals het monster wordt gedraaid door een fractie van een graad en herhaald totdat het monster is voltooid een 180° en 360° rotatie, het genereren van een aantal duizenden 2D projecties gebruikt voor de reconstructie van het 3D-volume20. In dit proces, verstoring van het specimen zal leiden tot de overeenkomstige 2D projecties to be out of uitlijning, resulterend in slecht gereconstrueerde 3D volumes. Monster immobilisatie is een manier om te corrigeren voor dit probleem en enkele huidige strategieën betrekken inlaten van het monster in alcohol of in te sluiten in de agarose in polypropyleen tubes of micropipet tips3,5,15, 16 , 21 , 22. vloeibare onderdompeling methoden zijn niet ideaal, omdat de beweging van het monster gedurende de Beeldacquisitie tussen imaging sets optreden kan, resulterend in verschoven reconstructies van 3D volumes23. Verder, het is algemeen bekend dat de fysieke stabiliteit van vloeistof-opgeslagen weefselsteekproeven slecht in termijnen van maanden tot jaren, als gevolg van chemische instabiliteit en oppervlakte schuren verkeer van contactpunten tussen monster en de (muur) container zijn gekoppeld is persoonlijke opmerkingen te maken met vaste weefselsteekproeven op het gebied van mens en dier).
Verklein het potentieel voor monster beweging tijdens imaging en monsters kunnen worden ingebed in de agarose24,25,26, maar deze praktijk wordt geassocieerd met het risico van de vlek verspreiden in agarose waardoor de afbeelding contrast26. Bovendien, vloeistof of agarose preparaten zijn gevoelig voor fysieke schade en degraderen na verloop van tijd, waardoor ze ongeschikt zijn voor langdurige opslag van het monster. We redeneerde dat een potentieel succesvol en ongecompliceerd monster immobilisatie methode aangepast van die gebruikt voor elektronenmicroscopie specimens worden kan. Gepolymeriseerde harsen zoals EPON 812 (stopgezet en vervangen door insluiten 812) worden vaak gebruikt om de hardheid vereist voor het genereren van uiterst dunne secties voor elektronenmicroscopie27,28. Inderdaad, hebben de verschillende vergelijkende studies tussen X-ray beeldvorming en elektronenmicroscopie aangetoond dat de monsters in de hars ingesloten image kunnen worden gemaakt door X-ray microscopie29,30. Sommige van de standaardprocedures van elektronenmicroscopie Vertaal echter niet rechtstreeks naar micro-CT beeldvorming. Bijvoorbeeld, micro-CT beeldvorming van monsters met een kwadraat hars randen van typische hars blokken en monsters gesneden uit die blokken wordt geassocieerd met rand diffractie artefacten die met imaging interfereren kunnen. Vloeiende randen van hars, terwijl het mogelijk is moeizaam en tijdrovend.
Hoewel een verscheidenheid van kunststof insluiten harsen zijn werkzaam in elektronenmicroscopie, leidde de hoge achtergrond gekoppeld moeilijker harsen zoals insluiten 812 ons naar het testen van anderen. Wij kozen LR White wegens haar lage viscositeit, lage inkrimping, lage neiging om vorm bubbels gedurende de polymerisatie en lagere achtergrond. Wilt maken van rand-gratis monsters, en om te minimaliseren van de hoeveelheid hars die rond het monster, ontwikkelden we de protocollen om te tekenen van specimens in vloeibare hars in polyimide buis vóór de polymerisatie. Polyimide werd gekozen voor de hoge thermische stabiliteit en hoge X-ray doorlating zodat de verwijdering van de leidingen niet noodzakelijk voor de beeldvorming is. Tot slot, we ontwierpen een aangepaste micropipet adapter voor onze steekproef inbedding techniek om betrouwbaar de buis te houden en te voorkomen dat de besmetting van micropipetten. De adapter kunnen 3D afgedrukt van een CAD-afbeeldingsbestand. Samen genomen, is het doel van de steekproef bereidingswijzen hier gepresenteerd maken inbedding van kleine steekproeven eenvoudiger te bereiken verbeterd contrast, rigide immobilisatie en langdurige opslag van intact millimeter-schaal specimens kleuring.
Protocol
Alle procedures op levende dieren werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) aan de Pennsylvania State University.
1. dag 1: fixatie
- Ter verbetering van de fixatie en het volume van de inhoud van de darm verminderen, verhongeren de jonge vis voor ten minste 24 h 10 mm specimens, of langer voor grotere exemplaren (bv., 72 h voor een specimen van 14 mm).
- Vooraf chill 10% neutraal gebufferd formaline (NBF) en 2 x tricaïne-S (MS-222, 400 mg/L) op ijs tot 4 ° C.
- Dubbele de vis water volume met gekoelde 2 x MS-222 voor snelle en humane euthanasie.
- Wachten voor 30 s (larven) tot 60 s (jonge) na de vis niet meer beweegt.
- Dompel de vis in gekoeld 10% NBF voor 10 min.
- Corrigeer de vis in gekoeld 10% NBF oplossing overnachting in platbodem containers bij kamertemperatuur.
Opmerking: Platbodem containers zijn nodig om het minimaliseren van het buigen van het model. De hoeveelheid fixeer en oplossingen voor alle volgende stappen moeten minstens 20 keer het monstervolume tenzij anders aangegeven. Voor 1-5 larvale zebrafish is het volume van de aanbevolen oplossing ten minste 1 mL. Onvoldoende kleefpoeders resulteert in slechte fixatie en een overschot van reagens volume doet niet nadelig beïnvloeden de uitkomst van de beschreven procedure. Gleuf voor volledige fixatie van grotere vissen, de buik beginnen iets anterior to de anale poriën. Minimale penetratie van schaar of mes gebruiken en zachte kracht uit de buurt van de vis worden toegepast tijdens het snijden om te minimaliseren van schade aan inwendige organen. Fixatie protocollen zijn beschreven door anderen31,32,33.
2. dag 2: Uitdroging & kleuring
- Spoel vaste exemplaren 3 keer in 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7.4 gedurende 10 minuten.
- De monsters voor 35% ethylalcohol (EtOH) dompelen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met zachte agitatie.
Opmerking: Voor alle stappen van de zachte agitatie, gebruikt u een tafelblad shaker en stel voor een mengen effect terwijl het zorgvuldig vermijden stoten en wrijven van het monster tegen de oppervlakken van de container. - Onderdompelen van de monsters bij 50% EtOH gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met zachte agitatie.
- Los phosphotungstic zuur (PTA) poeder in water te bereiden van een stamoplossing van 1% w/v.
- Verdun de stockoplossing van de PTA 1% 3:7 in 100% EtOH te verkrijgen van een 0.3% PTA kleurstofoplossing.
- Vlek de monsters 's nachts in de 0,3% PTA oplossing bij kamertemperatuur met zachte agitatie.
3. dag 3: infiltratie
- Bereiden van 1:1 v/v mengsel van 100% EtOH en LR Wit acryl hars en zet opzij.
- Spoelen 3 keer in 70% EtOH gedurende 10 minuten.
- Onderdompelen van de monsters in 90% EtOH gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met zachte agitatie.
- Onderdompelen van de monsters in 95% EtOH gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met zachte agitatie.
- Onderdompelen van de monsters tweemaal in 100% EtOH gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met zachte agitatie.
- Het onderdompelen van de monsters in het 1:1 EtOH en LR Wit acryl hars mengsel 's nachts bij kamertemperatuur met zachte agitatie.
4. dag 4: insluiten
- Het onderdompelen van de monsters in 100% LR White hars gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met zachte agitatie.
- De hars in stap 4.1 vervangen door verse 100% LR witte hars en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met zachte agitatie.
- Monteer het insluiten apparaat (Figuur 1).
- Het knippen van polyimide buis van de juiste diameter en lengte.
Opmerking: De slang met een binnendiameter thats ten minste 0,1 mm groter zijn dan de diameter van het specimen wordt aanbevolen. Voor typische specimens, wordt een standaard lengte van 30 mm buis gebruikt voor elk monster. Wanneer gewenst, kunnen langwerpige exemplaren worden opgevangen met behulp van langere leidingen.- Een P1000 micropipet hechten aan het brede einde van de insluiten adapter en voeg de polyimide buis naar het smalle einde (Figuur 1 c). Als de insluiten adapter niet beschikbaar is, gaat u naar stap 4.3.3. Ga anders verder naar stap 4.4.
- Illustraties uit het einde van een tip micropipet dwars door zodat de polyimide buis past precies. Gesneden op 44 mm vanaf het brede einde van een 200 µL gele micropipet tip voor de 0.0403" buizen en 59 mm vanaf onderkant van 1 mL blauw tip voor de 0.105" slang. Trim zo nodig.
- Sluit het uiteinde gesneden micropipet aan een micropipet.
- De monsters overbrengen in een kleine wegen boot- of V-vormige oplossing bekken en volledig dompelen de monsters in 100% LR White hars.
- Met het insluiten van dit apparaat uit stap 4.3, richt de slang op het brede einde van het vaste monster (of richting van het hoofd voor dierlijke specimens) en Pipetteer van de monster langzaam in de buis. Plaats van het monster in het midden van de buis en zorgen dat de slang boven en onder het specimen is gevuld met hars.
- Pipetteer het monster in de buis zodat het monster zich beweegt in de richting van natuurlijke, naar voren.
Opmerking: Trage pipetteren voorkomt luchtbellen en specimen schade veroorzaakt door schuren tegen de rand van de buis. Achterwaartse beweging in de buis kan gemakkelijk beschadigen extremiteiten (ledematen, vleugels, vinnen, enz.). Het is aanbevolen om enkele overloop van de hars in het insluiten apparaat toestaan, zodat later, lucht niet in de buis tijdens het verwijderen.
- Pipetteer het monster in de buis zodat het monster zich beweegt in de richting van natuurlijke, naar voren.
- Onmiddellijk zegel het open uiteinde met zachte modellering op basis van olie klei.
- Het afvlakken van de klei in een 1 mm dik blad.
- Het stabiliseren van de buis tussen index en middelste vingers.
- Druk langzaam op de klei tegen het einde van de buis met de duim.
- Verwijder overtollige klei.
- Verwijder het insluiten apparaat uit de micropipet.
- Uitlichten van de buis door zachte rotatie en verzegel het andere uiteinde met de klei.
- Houd een vinger tegen het gesloten einde om te voorkomen dat het uitwerpen van de klei.
- Langzaam sluit de onverharde uiteinde van de buis in de klei.
- Plaats de buis horizontaal en polymeriseren de hars gedurende 24 uur bij 65 ° C.
Opmerking: Horizontale plaatsing vermijdt het monster verkeer tijdens de polymerisatie. Als een kleine hoeveelheid lucht in stap 4.8 gevangen zat, kan het einde met de luchtbel licht worden verhoogd om te voorkomen dat de zeepbel luchtbeweging richting van het model. Nog belangrijker is, kan teveel hoogte tijdens de polymerisatie het specimen te vallen aan het lage einde als gevolg van de zwaartekracht. Een goed ingesloten monster wordt weergegeven ten opzichte van een met een luchtbel, die moet worden vermeden omdat de breking van lucht/hars interfaces (Figuur 2 afbeeldingskwaliteit kunt).
5. dag 5: collectie
- Het verzamelen van de monsters voor Beeldacquisitie aan het eind van dag 5.
Opmerking: De verwijdering van polyimide buizen is mogelijk maar niet noodzakelijk voor imaging. Synchrotron gebaseerde micro-CT beeldvorming voor de zebravis steekproef werd uitgevoerd in Beamline 2-BM op geavanceerde Photon bron (APS) in Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA). Voor de PTA gebeitste zebrafish, een optimale X-ray energiebereik van 5-30 keV werd vastgesteld, en de energie van een X-ray van 13,8 keV werd gebruikt voor imaging. 1501 projecties werden verkregen op 13,8 keV meer dan 180 graden (1 projectie elke 0,12 graden) met een 2048-door-2048 pixel camera. Bovendien werden twee flat-veld (winst) beelden (één aan het begin) en één aan het einde van de overname en een donker-veld afbeelding ook verworven. Flat-veld en donker-veld correcties, ring artefact reductie en afbeelding wederopbouw werden gedaan met behulp van de open source TomoPy toolkit34. PTA gebeitste dafnia's en Drosophila monsters werden beeld op een X-ray Microscoop12,35. Specifieke micro-CT instellingen zijn afhankelijk van het object en de kwaliteit van de vlek. Bijvoorbeeld, de Drosophila specimen is gescand op 40 kVp, 74 mA, en 15 s met een resolutie van voxel van 3,10 × 3.10 × 3.10 µm3.
Representative Results
Het protocol beschreven bovenstaande gegevens de voorbeeldprocedure voorbereiding voor hele zebrafish larven en juvenielen voor micro-CT beeldvorming. Met name deze methode is gemakkelijk aangepast aan andere soorten monsters (bijv., Drosophila Daphnia, Arabidopsis, muis organen). Incubatie keren in verschillende stappen zijn geschikt om zebrafish larven en monsters van vergelijkbare grootte; grotere monsters mogelijk langere incubatietijd. Om te helpen met het monster stappen te embedding, ontwierpen we een adapter die hecht aan een micropipet van 1 mL, en kan worden aangepast voor verschillende maten van polyimide buizen (Figuur 1). Deze aangepaste adapter was 3D afgedrukt van een CAD-bestand dat is gekoppeld aan dit manuscript en beschikbaar voor download van http://publications.chenglab.com/LinEtAlJOVE/. Aangezien alle lezers niet toegang tot een 3D-printer hebben kunnen, wordt vergadering van een zelfgemaakte insluiten apparaat met behulp van tips van de micropipet beschreven in het protocol (stap 4.3). De larve van een succesvol ingesloten zebrafish wordt weergegeven in vergelijking met een model met een luchtbel (Figuur 2), die zal de afbeeldingskwaliteit waarschijnlijk. Om aan te tonen van de veelzijdigheid van de insluiten procedure, we laten zien van de specimens uit verschillende modelorganismen (dwz., Danio, Drosophila, Daphnia, muis embryo) die zijn gegaan door de sample voorbereiding pijpleiding ( Figuur 3). Gereconstrueerde 3D hoeveelheden van hele Danio, Daphniaen Drosophila specimens beeld door micro-CT staan (Figuur 4). Nog belangrijker is, zoals blijkt uit het monster Danio , kunnen voor meerdere beeldvorming sessies (Figuur 5) deze exemplaren worden opgeslagen voor een langere periode van tijd en opnieuw gebruikt.
Figuur 1. Apparaat te Embedding. (A) een adapter is ontworpen om het insluiten met behulp van gemeenschappelijke laboratorium instrumenten. (B) een transversale illustratie van de adapter. (C) de toestellen te embedding na het inbrengen van de slang van polyimide op adapter punt, (a) en het koppelen van de micropipet op adapter punt (c). Adapter segment (b) is een zaal van de overloop ontworpen om geschikt voor overtollige hars en de micropipet te beschermen tegen besmetting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Succesvol ingesloten specimens zijn verstoken van luchtbellen. (A) een ingesloten 3 dagen na bevruchting (dpf) larval zebrafish zonder luchtbel. (B) een ingesloten 3 dpf zebrafish met een luchtbel. Lucht gevangen tijdens het insluiten kan bewegen in de richting van het model als het monster niet horizontaal tijdens de polymerisatie geplaatst wordt. Schaal bars = 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Een breed scala aan exemplaren kan worden ingesloten met ons protocol. (A) 7 dpf zebrafish larve. (B) volwassen Drosophila. (C) volwassene Daphnia. (D) muis embryo. Grotere monsters zoals de muis embryo worden opgevangen door een paar aanpassingen aan het protocol. Kort, was de slang van polyimide tot 1/3 van de lengte gevuld met hars en polymeervorm vóór het insluiten. Vaste en gebeitst monster was geplaatst op de top van de vooraf gepolymeriseerde hars. De buis was dan gevuld met un-gepolymeriseerde hars, gevolgd door een tweede polymerisatie. De polyimide buis werd verwijderd voorafgaand aan de fotografie om betere visualisatie van het monster in deze afbeelding. De verwijdering van de leidingen is niet noodzakelijk voor succesvolle Beeldacquisitie door micro-CT. schaal balken: specimen beelden, 5 mm; uitgebreide inzetstukken, 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. 3-dimensionale renderings van ingesloten specimens. (A) gereconstrueerd 3 dpf zebrafish larve bij 0.743 × 0.743 × 0.743 µm3 voxel resolutie. (B) gereconstrueerd volwassen Daphnia (3 × 3 × 3 µm3 voxel resolutie). (C) gereconstrueerd volwassen Drosophila (3.1 × 3.1 × 3.1 µm3 voxel resolutie). Digitale dwarsdoorsneden kunnen op elke hoek worden gegenereerd, zoals wordt weergegeven in de linkerkolom. Oppervlakte renderings worden weergegeven aan de rechterzijde weergegeven met behulp van commerciële software. Inbedding hars kan worden gezien in alle scans buiten het monster (opgemerkt door *), maar het niet interfereert met het monster zelf. De larve van de zebravis was bij het Argonne National Laboratory bij de geavanceerde Photon bron thats synchrotron gebaseerde beeld. De Daphnia of Drosophila specimens werden beeld met een commerciële X-ray Microscoop. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. Monsters ingebed met ons protocol kunnen opnieuw verbeelde met micro-CT. De larve van de dezelfde 5 dpf zebrafish was beeld in 2011 (A) en (B) 2013, gepresenteerd als gemiddelde intensiteit projecties van de Sagittaal weergave. Afbeelding vergelijking tussen scans na de opslag het behoud van anatomische eigenschappen toont. (C) een close-up van de spier uit beide scans wordt gepresenteerd, met gesegmenteerde lijnen die overeenkomstige regio's gebruikt voor (D) intensiteit profiel generatie aangeeft. Intensiteit profielen genormaliseerd naar hun overeenkomstige gemiddelden langs beide lijnen tonen ruimtelijk overeenkomende lokale pieken in beide scans. (E) gemiddelde intensiteitswaarden voor geselecteerde regio's in A en B behorend tot achtergrond (Bg, paarse), neuronale kernen (N, groen), witte stof (W, blauw), en de spier (M, oranje) werden gedeeld door een gemiddelde voor de achtergrond (wit) en gebruikt voor het genereren van signal-to-noise ratio's (SNR), die overeenkomt met goed tussen scans. Schaal bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
In dit manuscript presenteren we een gedetailleerd protocol voor rigide immobilisatie van vaste en gebeitst millimeter-schaal (0,5 tot en met 2.5 mm doorsnede) exemplaren voor micro-CT beeldvorming. Gezien de snelle opmars van micro-CT technologie met betrekking tot de resolutie en snelheid, is een methode van permanente monster behoud met opnieuw imaging mogelijkheden zeer wenselijk. Traditioneel, dichte inbedding hars worden vaak gebruikt in elektronenmicroscopie om structurele ondersteuning om te knippen uiterst dunne secties en minimaliseren van de schade aan het model. Onze methode aangepast het gebruik ervan voor rigide immobilisatie tijdens niet-destructieve beeldbewerking. Om te minimaliseren van de beeldvorming artefacten uit de aanwezigheid van overtollige hars, hebben wij het gebruik van X-ray transparante polyimide buis ronde monsters zonder randen maken, en het beperken van de hoeveelheid hars rond het monster.
Optimale resultaten van de insluiten procedure is afhankelijk van de zorgvuldige uitvoering van verschillende kritische stappen en aandacht voor de integriteit van het monster gedurende de hele procedure. Inderdaad, beschadiging van het specimen zal resulteren in een gecompromitteerde eindbeeld ongeacht het succes van de uitvoering van de beeldvorming. Aangezien koelen draagt bij tot een vermindering van de pijn reacties, en losse weefsel sneller bij hogere temperaturen degradeert, gebruiken we vooraf gekoeld reagentia. Grote exemplaren wellicht worden gesneden zodat de post van fixeerspray in de binnenkant van het specimen zodat de inwendige organen zoals lever, alvleesklier en darm worden volledig opgelost. Nietgefixeerde weefsels verslechteren en structurele integriteit, vernietiging van biologische structuur verliest. Een andere belangrijke stap is het handhaven van het model in de natuurlijke uitlijning. Wij pleiten daarom voor het gebruik van platbodem containers, die we in de gehele procedure en zijn met name belangrijk tijdens fixatie gebruiken. Fixatie in polypropyleen tubes of conische buisjes die meestal een V-vormige bodem hebben moeten worden vermeden omdat ze leiden een verlengde monsters tot kunnen te buigen, die verstoort de natuurlijke morfologie van het model. Bovendien, om te minimaliseren van het gebruik van hars, is de binnendiameter van de buis van polyimide slechts iets groter dan de breedte van het model. Buigen van het model kan ook leiden tot schade aan het model als het binnenkomt de buis. Het is ook aanbevolen om de overdracht van het model in de slang op een natuurlijke voorwaartse manier om te voorkomen dat schadelijke extremiteiten. Juiste uitdroging is een andere kritische stap. Dit wordt bereikt met kleine stappen van toenemende EtOH concentraties te langzaam vervangen door water EtOH, die is meer mengbaar met de hars. Grote stijgingen van de EtOH concentratie worden geassocieerd met weefsel krimp en kunnen worden verbeterd door extra stappen van EtOH incubatie te maken de overgang geleidelijker. Tot slot, om te minimaliseren van het verkeer van het model of de luchtzakken, als die er zijn, de monsters zijn horizontaal geplaatst tijdens de polymerisatie van hars (eind van dag 4). Luchtzakken of sealant naast het model veroorzaakt optische artefacten met X-ray beeldvorming rand diffractie, vermindering van de beeldkwaliteit is gekoppeld.
Met betrekking tot eventuele wijzigingen in het protocol, andere insluiten harsen en metaal vlekken kunnen worden gebruikt in plaats van LR White acryl en PTA, respectievelijk. Embed812, een veelgebruikte elektronenmicroscopie, epoxyhars is zeer viskeuze, moeilijker om te dragen, kan de vervorming van de specimens en wordt geassocieerd met hogere achtergrond dan acryl of glycol methacrylaat harsen. Terwijl JB4 Plus, een glycol-methacrylaat, is minder viskeuze dan EMbed812 en lagere achtergrond heeft, willekeurige vorming van luchtzakken vaak verschijnen in de nabijheid van het model. Zoals vermeld, luchtzakken de afbeeldingskwaliteit en zijn bijzonder problematisch voor kostbare monsters. Het is vermeldenswaard dat Technovit 7100, een ander glycol methacrylaat, interfereert met het PTA kleuring, resulterend in slechte contrast in de uiteindelijke afbeelding. Betrekkelijk, LR White acryl heeft water-achtige viscositeit, lage achtergrond, en interfereert niet met het PTA kleuring. In onze handen is het slagingspercentage van inbedding in LR wit zonder schade of lucht bubbels van de steekproef groter dan 95%. Om deze redenen pleiten wij voor het gebruik ervan als de inbedding hars voor weefsel micro-CT. Met betrekking tot de vlekken, het resultaat van verschillende metalen vlekken zoals osmium tetroxide, jodium, en PTA in micro-CT beeldvorming is vergeleken en besproken elders15,16,17 en is buiten het toepassingsgebied van deze manuscript.
De grootte van de steekproef is een belangrijke beperking bij onze huidige protocol. Aangezien we employ zuig specimens overbrengen naar de buis, is de mogelijkheid om te zien van het model van cruciaal belang voor oriëntatie en ervoor te zorgen dat het is inderdaad in de buis. Dientengevolge, sub millimeter monsters zoals beerdiertjes (dwz., water beren) zijn uiterst moeilijk te sluiten omdat ze vereisen het gebruik van een microscoop om te worden gevisualiseerd. Zodra afzuiging wordt toegepast, microscopische exemplaren zijn gemakkelijk verloren van het brandvlak en uitdagend om te herontdekken, waardoor het moeilijk is om te bepalen als zij te ver via het bijgevoegde einde van de buis doorgegeven. Grotere monsters, zoals muis embryo's (3-10 mm) kunnen worden ingebed met kleine aanpassingen aan het insluiten protocol (Figuur 4 d). In het bijzonder was de polyimide buis gevuld tot 1/3 met vloeibare hars, die was polymeervorm vóór het insluiten. De vaste en gebeitst monster was geplaatst op de top van de vooraf gepolymeriseerde hars. De buis was vervolgens volledig gevuld met un-gepolymeriseerde hars en gevolgd door een tweede polymerisatie.
De betekenis van onze insluiten protocol is spruitstuk. Rigide geïmmobiliseerdet hele dier of weefsel exemplaren zijn wenselijk voor redenen, waaronder: (1) maken op lange termijn repositories van monsters die moeilijk te genereren of voor te bereiden; (2) opnieuw overname van gegevens; (3) waardoor seriële beeldvorming met behulp van meerdere beeldvormende modaliteiten; en (4) bieden normen voor kalibratie en technologische ontwikkeling. Monsters met onze insluiten procedure bereid zijn ingekapseld in solide hars die is veerkrachtig tegen schade en kunnen daarom worden gemakkelijk opgeslagen misschien voor onbepaalde tijd. Langdurige opslag is vooral handig voor zeldzame of moeizaam gegenereerde specimens zoals die verband houden met phenome projecten. Verder, in het geval dat de digitale gegevens verloren zijn, de gegevens kunnen worden gegenereerd uit het oorspronkelijke monster. Het vermogen van het opnieuw imaging gedurende een lange periode van tijd mogelijk maakt hetzelfde monster te worden ondervraagd met meer geavanceerde imaging modaliteiten in de toekomst. Aangezien de monsters fysiek stabiel tussen imaging exemplaren zijn, worden beelden verkregen uit het hetzelfde model in dezelfde afdrukstand, vergemakkelijking van registratie tussen eerdere en latere data sets. Bijvoorbeeld, kan een lage resolutie afbeelding alleen segmentatie van weefsels in de larve van een zebravis toestaan. De larve van de dezelfde kan later opnieuw bij hogere resolutie zijn beeld, zodat meer computationele analyses op cellulaire resolutie gedetailleerde. Deze mogelijkheid voor directe vergelijking tussen geregistreerde scans suggereert hars-embedded monsters als een potentieel standaard voor technologische ontwikkeling van micro-CT. De gevolgen van elke wijziging in de imaging-methode kunnen worden geëvalueerd door imaging van hetzelfde monster, zodat alle variabelen in de steekproef voorbereiding stap worden gecontroleerd. Tenslotte, een standaardmonster hars-embedded kan gebruikt worden voor het kalibreren van het instrument om te testen voor consistentie voor imaging.
Onze vorige werk mutant en zieke vis histologie onderzoeken bleek dat cellulaire resolutie maakt de ontdekking van subtiele afwijkingen in weefsel structuur die over het hoofd zijn gezien bij bruto onderzoek met behulp van het ontleden Microscoop36, of een spaarstand stereomicroscoop. Wij wensen uit te breiden onze high-resolution analyses naar menselijke specimens. Zebravis larven, die bestaan uit het primaire onderwerp van ons ontwikkelingswerk, zijn vergelijkbaar met menselijke naald biopsieën in hun kwetsbaarheid, cellulaire en intercellulaire weefsel heterogeniteit grootte (1-3 mm doorsnede) en langwerpige vorm. Op basis van onze uitgebreide ervaring met zebravis en andere werk toont dat micro-CT met succes gekleurd en gescand van menselijk weefsel, zij het op een lagere resolutie37, verwachten we onze benaderingen van toegevoegde waarde bieden aan de beeldvorming en analyse van naald biopsieën. Wij schatten dat de vergadering van een kit voldoende voor één preparaat van maximaal 20 monsters van dezelfde voorwaarde als potentieel minder dan 30 USD. De monsters worden bereid door onze verzonken methode resistent zijn tegen fysieke schade en dus makkelijk te vervoeren. De lage kosten en het gemak van vervoer suggereren de mogelijkheid van het verzamelen van monsters van over de hele wereld, met name in sectoren waarin cellulaire resolutie beeldvorming met micro-CT niet gemakkelijk toegankelijk is. Onze visie is voor hoge resolutie digitale bestanden van naald biopten (variërend van 0.1 tot verschillende terabytes) het inschakelen van het creëren van een digitale atlas van de menselijke weefsels, en tegelijkertijd de onderzoekers te verfijnen en te verbeteren huidige analyse pijpleidingen voor lokalisatie en kwantitatieve karakterisering van cellulaire en weefsel architectuur in het volledige 3D-kader van de weefsels gescand.
Disclosures
Alle van de auteurs verklaren dat er geen conflicten van belangen.
Acknowledgments
De auteurs bedank Roland Myers voor het vriendelijk het verstrekken van de oorspronkelijke TEM-protocollen. Daarnaast zouden we graag bedanken Dr. John Colbourne voor het verstrekken van de Daphnia -specimen, Dr. Santhosh Girirajan voor het verstrekken van de Drosophila specimen en Dr. Fadia Kamal voor het verstrekken van het embryo van de muis. De onderzoekers erkennen financiering van de steun van de NIH (1R24OD18559-01-A2, PI: KCC), de Jake Gittlen laboratoria voor kankeronderzoek, en van de pilot award financiering uit de PSU Huck instituten van de biowetenschappen en het Instituut voor CyberScience.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Phosphotunstic Acid | VWR | MK282402 | |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | MS-222 | |
| LR White | Electron Microscopy Sciences | 14380 | |
| Polyimide tubing (ID 0.04") | Nordson Medical | 141-0065 | The exact polyimide tubings described in the manuscript are no longer available. A close match is provided here. Tubing with custom diameter can be manufactured upon request. |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Oil-based soft modeling clay | Sculpey | S302 001 | |
| Micropipette P200 | Gilson | F123601 | |
| Micropipette P1000 | Gilson | F123502 | |
| Glass vials | VWR | 66015-042 | |
| V-shaped basin | VWR | 89094-676 | |
| Weigh boats | VWR | 10803-148 | |
| 200 μL yellow micropipette tip | Fisher Scientific | 02-707-500 | |
| 1 mL blue micropipette tip | Fisher Scientific | 02-681-163 | |
| Tabletop shaker | Thermolyne | M71735 | |
| Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 CCD | |
| X-ray microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa |
References
- Cheng, K. C., Katz, S. R., Lin, A. Y., Xin, X., Ding, Y. Whole-organism cellular pathology: a systems approach to phenomics. Advances in Genetics. 95, 89-115 (2016).
- Cheng, K. C., Xin, X., Clark, D., La Riviere, P. Whole-animal imaging, gene function, and the zebrafish phenome project. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 620-629 (2011).
- Vågberg, W., Larsson, D. H., Li, M., Arner, A., Hertz, H. M. X-ray phase-contrast tomography for high-spatial-resolution zebrafish muscle imaging. Scientific Reports. 5, 16625 (2015).
- Bruneel, B., et al. Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies. Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).
- Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
- Silvent, J., et al. Zebrafish skeleton development: High resolution micro-CT and FIB-SEM block surface serial imaging for phenotype identification. PLoS One. 12 (12), e0177731 (2017).
- Hur, M., et al. MicroCT-based phenomics in the zebrafish skeleton reveals virtues of deep phenotyping in a distributed organ system. eLife. 6, e26014 (2017).
- J, S. Whole-body imaging of a hypercholesterolemic female zebrafish by using synchrotron X-ray micro-CT. Zebrafish. 12 (1), 11-20 (2015).
- Hasamura, T., et al. Green tea extract suppresses adiposity and affects the expression of lipid metabolism genes in diet-induced obese zebrafish. Nutrition and Metabolism. 9 (1), 73 (2012).
- Meguro, S., Hasumura, T., Hase, T. Body fat accumulation in zebrafish is induced by a diet rich in fat and reduced by supplementation with green tea extract. PLoS One. 10 (3), e0120142 (2015).
- Dyer, E. L., et al. Quantifying mesoscale neuroanatomy using X-ray microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Perilli, E., Parkinson, I. H., Reynolds, K. J. Micro-CT examination of human bone: from biopsies towards the entire organ. Ann Inst Super Sanita. 48 (1), 75-82 (2012).
- Watz, H., Breithecker, A., Rau, W. S., Kriete, A. Micro-CT of the human lung: imaging of alveoli and virtual endoscopy of an alveolar duct in a normal lung and in a lung with centrilobular emphysema - initial observations. Radiology. 236 (3), 1053-1058 (2005).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Pauwels, E., Van Loo, D., Cornillie, P., Brabant, L., Van Hoorebeke, L. An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250 (1), 21-31 (2013).
- Kün-Darbois, J. D., Manero, F., Rony, L., Chappard, D. Contrast enhancement with uranyl acetate allows quantitative analysis of the articular cartilage by microCT: Application to mandibular condyles in the BTX rat model of disuse. Micro. 97, 35-40 (2017).
- Tang, S. Y., Vashishth, D. A non-invasive in vitro technique for the three-dimensional quantification of microdamage in trabecular. Bone. 40 (5), 1259-1264 (2007).
- Elliott, J. C., Dover, S. D. X-ray microtomography. Journal of Microscopy. 126 (Pt 2), 211-213 (1982).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping). PLoS Genetics. 2 (4), e61 (2006).
- Larsson, D. H., Vågberg, W., Yaroshenko, A., Yildirim, A. Ö, Hertz, H. M. High-resolution short-exposure small-animal laboratory x-ray phase-contrast tomography. Scientific Reports. 6, 39074 (2016).
- Pleissis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 5, 1011 (2017).
- Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321 (2013).
- Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, L. P., Henkelman, R. M. Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-CT. Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).
- Hsu, C. W., et al. Three-dimensional microCT imaging of mouse development from early post-implantation to early postnatal stages. Developmental Biology. 419 (2), 229-236 (2017).
- Luft, J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 409-414 (1961).
- Hayat, M. A., Giaquinta, R. Rapid fixation and embedding for electron microscopy. Tissue Cell. 2 (2), 191-195 (1970).
- Handschuh, S., Baeumler, N., Schwaha, T., Ruthensteiner, B. A correlative approach for combining microCT, light and transmission electron microscopy in a single 3D scenario. Frontiers in Zoology. 10, 44 (2013).
- Bushong, E. A., et al. X-ray microscopy as an approach to increasing accuracy and efficiency of serial block-face imaging for correlated light and electron microscopy of biological specimens. Microscopy and Microanalysis. 21 (1), 231-238 (2015).
- Tsao-Wu, G. S., Weber, C. H., Budgeon, L. R., Cheng, K. C. Agarose-embedded tissue arrays for histologic and genetic analysis. Biotechniques. 25 (4), 614-618 (1998).
- Sabaliauskas, N. A., et al. High-throughput zebrafish histology. Methods. 39 (3), 246-254 (2006).
- Copper, J. E., et al. Comparative analysis of fixation and embedding techniques for optimized histological preparation of zebrafish. Comparative Biochemistry and Physiology. 208, 38-46 (2018).
- Gürsoy, D., De Carlo, F., Xiao, X., Jacobsen, C. TomoPy: a framework for the analysis of synchrotron tomographic data. J Synchrotron Radiat. 21 (Pt 5), 1188-1193 (2014).
- Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21 (2), 10-15 (2013).
- Thomas, G. K. A molecular and systems biology analysis of pleiotropic vertebrate phenotypes (Doctoral dissertation). , Retrieved from the Penn State Electronic Theses and Dissertations Database (2009).
- Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano- tomography. Scientific Reports. 5, 10074 (2015).
