Summary
Wir Protokolle entwickelt und konstruiert einen benutzerdefinierten Apparat zur Einbettung von Millimeter-Skala Proben zu ermöglichen. Wir präsentieren Probenaufbereitungsverfahren mit Betonung auf Einbettung in Acrylharz und Polyimid Schläuche um starre Ruhigstellung und langfristige Lagerung der Proben für die Vernehmung von Architektur und Zelle Morphologie der Gewebe durch Mikro-CT zu erreichen
Abstract
Seit über hundert Jahren wurde die histologische Untersuchung des Gewebes der Goldstandard für die medizinische Diagnose da Histologie kann alle Zelltypen in jedem Gewebe identifiziert und charakterisiert werden. Unser Labor arbeitet aktiv daran, technologische Fortschritte in x-ray Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) machen, die die Diagnose macht der Histologie zum Studium der vollen Gewebe Bände mit zellulären Auflösung bringen wird (zB., eine Röntgenaufnahme Histo-Tomography-Modalität). Zu diesem Zweck haben wir gezielte Verbesserungen zur Probe Vorbereitung Pipeline gemacht. Eine wichtige Optimierung, und der Fokus der vorliegenden Arbeit ist eine einfache Methode für die starre Einbettung von festen und voller Flecken Millimeter-Skala Proben. Viele der veröffentlichten Methoden zur Probe Immobilisierung und Korrelative Mikro-CT-Bildgebung verlassen sich bei der Platzierung der Proben in Paraffinwachs, Agarose oder Flüssigkeiten wie Alkohol. Unser Ansatz erstreckt sich diese Arbeit mit benutzerdefinierten Prozeduren und die Gestaltung von einem 3-dimensionalen druckbare Apparat Einbetten der Proben in einem Acrylharz direkt in Polyimid-Schlauch, die Röntgenstrahlen relativ transparent ist. Hier sind Probenaufbereitungsverfahren für die Proben von 0,5 bis 10 mm im Durchmesser, die geeignet für ganze zebrafischlarven und Jungfische, oder andere Tiere wären und Gewebeproben von ähnlichen Dimensionen beschrieben. Als Proof of Concept haben wir die Proben von Danio, Drosophila, Daphnienund eines Mausembryos eingebettet; Repräsentative Bilder von 3-dimensionalen Scans für drei dieser Proben werden angezeigt. Wichtig ist, führt unsere Methodik auf mehrere Leistungen einschließlich rigide Immobilisierung, Langzeitarchivierung mühsam erstellten Ressourcen und die Fähigkeit, Muster neu zu befragen.
Introduction
Phänotypen sind beobachtbare Merkmale eines Organismus, die die Folgen der einzigartige Interaktionen zwischen den genetischen Hintergrund und die Umwelt darstellen. Diese Eigenschaften können Verhaltensstörungen, biochemische, morphologische, Entwicklungsstörungen und/oder physiologischen Eigenschaften enthalten. Wichtiger ist, können Unterschiede in der Züge zwischen Wildtyp Organismen und genetische Mutanten wichtige Einblicke in die Mechanismen und Funktionen der betroffenen Gene bieten. Im Hinblick auf Morphologie Histopathologie ist der Goldstandard für die Beurteilung der Phänotypen auf zellulärer Ebene aber leidet an mechanische Artefakte und erlaubt keine genaue quantitative Volumetrische Analyse1. Unser Labor ist motiviert, die Hindernisse für die Anwendung der diagnostischen macht der Histologie auf volle Gewebe Bände mit Submikron-Auflösung zu überwinden.
Ein Überblick über verfügbare Technologien legt nahe, dass die Bildgebung durch x-ray Micro-berechnete Mikro-Computertomographie bieten ideale Möglichkeiten für Millimeter-Skala ganz Tier 3-dimensionale (3D) Histologie benötigt. Mikro-CT ermöglicht die zerstörungsfreie, isotrop, 3D Visualisierung und die Fähigkeit, Quantitative Analyse der Gewebe Architektur1,2. In den letzten Jahren hat 3D-Bildgebung ungefärbten und Metall-gefärbten Zebrafisch von Mikro-CT immer mehr Traktion und verwendet worden, für die volumetrische Analyse mehrere Gewebe, einschließlich Fettgewebe, Muskeln, Zähne und Knochen3,4 ,5,6,7,8,9,10. Andere Modellorganismen und Gewebemustern sind auch offen für Mikro-CT-Bildgebung. Zum Beispiel wurde eine Pipeline zur Quantifizierung der dichten Mesoskalige Neuroanatomie von mäusegehirnen abgebildet über Synchrotron Mikro-CT11eingeführt. In ähnlicher Weise hat sich eine Eosin-basiertes Färbung Protokoll für Weichgewebe Mikro-CT-Bildgebung ganze Maus Organe12geeignet gezeigt. Morphometrische Analyse der ungefärbten menschlichen L3-Wirbel und die Visualisierung der menschlichen Lunge Silber-gebeizt mit Mikro-CT haben gezeigt, dass der Nutzen dieser Technologie für den menschlichen13,14Proben.
Um das große Versprechen der Mikro-CT für vollständige morphologische Phänotypisierung von intakten Kleintiere und Gewebeproben zu verwirklichen, muss zahlreiche Hindernisse überwunden werden, in Bezug auf Durchsatz, Auflösung, Field of View, umfassende Zelle Färbung, und Langzeitarchivierung. Während jeder dieser Aspekte von entscheidender Bedeutung ist, liegt der Schwerpunkt des vorliegenden Manuskripts die Optimierung der einbettenden Verfahren mit zusätzlichen Notizen auf Probe Fixierung und Färbung. Heavy Metal Färbung ist nützlich, weil die innewohnende Kontrast zwischen verschiedenen Weichteile in Mikro-CT-Aufnahmen gering ist. Die Potenz der verschiedenen Metall Flecken wie Osmium ausgefällt, Jod, Phosphotungstic Acid (PTA) und Gallocyanin-Chromalum, um Kontrast für die Mikro-CT-Bildgebung zu verbessern wurde studierte15,16,17. Uranyl Acetat dient auch als kontrastreichen Agent für die Mikro-CT-Bildgebung von Knochen und Knorpel18,19. PTA in unserem Protokoll verwendete führt zu einheitliche Färbung von fast allen Geweben und Zellen im ganzen Zebrafisch Exemplare, mit Bildern, die potenziell mit Histologie-ähnliche Studien durch vollständige Bände des Gewebes kompatibel sind.
Während Mikro-CT Bildaufnahme, eine 2-dimensionale (2D) Projektion genommen, da die Probe durch ein Bruchteil eines Grades gedreht wird und wiederholt, bis die Probe, eine 180 ° oder 360° Rotation erzeugt eine Reihe von Tausenden von 2D Projektionen verwendet abgeschlossen ist für die Rekonstruktion der 3D-Volumen20. In diesem Prozess wird jede Störung der Probe die entsprechenden 2D Projektionen aus der Ausrichtung, was schlecht rekonstruierten 3D Volumen zu verursachen. Probe Immobilisierung ist ein Weg, um dieses Problem zu beheben und einige aktuelle Strategien beinhalten Eintauchen der Probe in Alkohol oder Einbettung in Agarose in Polypropylenröhrchen oder Mikropipette Tipps3,5,15, 16 , 21 , 22. Flüssigkeit eintauchen-Methoden sind nicht ideal, weil zwischen den bildgebenden Sätzen, was zu verschobenen Rekonstruktionen von 3D Volumen23Probe Bewegung während der Bildaufnahme auftreten kann. Darüber hinaus ist es bekannt, dass die physikalische Stabilität von Flüssigkeit gespeichert Gewebeproben in Zeitskalen von Monaten bis Jahren, als Folge der chemischen Instabilität und Oberfläche Abrieb, verbunden mit Bewegung der Kontaktstellen zwischen Probe und der Container-Wand (schlecht ist persönliche Beobachtungen mit festen tierischen und menschlichen Gewebeproben).
Um das Potenzial für Probe-Bewegung während der Aufnahme zu reduzieren, Proben in Agarose24,25,26eingebettet werden können, aber diese Praxis ist verbunden mit der Gefahr des Flecks diffundieren in Agarose wodurch Bild Kontrast-26. Darüber hinaus Flüssigkeit oder Agarose Zubereitungen sind anfällig für körperliche Schäden und beeinträchtigen im Laufe der Zeit macht sie ungeeignet für die langfristige Lagerung der Probe. Wir folgerte, dass eine potenziell erfolgreiche und unkomplizierte Beispielmethode Immobilisierung angepasst aus, die für Elektronenmikroskopie Proben verwendet werden könnte. Polymerisierte Harze wie Verfahrensweisen 812 (eingestellt und ersetzt durch Einbetten 812) sind häufig verwendet, um die Härte zum Generieren von ultradünnen Abschnitte für Elektronenmikroskopie27,28erforderlich zur Verfügung stellen. In der Tat haben einige Vergleichsstudien zwischen x-ray Imaging und Elektronenmikroskopie gezeigt, dass die Proben in Harz eingebettet von x-ray Microscopy29,30abgebildet werden können. Einige der standard-Praktiken der Elektronenmikroskopie übersetzen jedoch nicht direkt an Mikro-CT-Bildgebung. Z. B. Mikro-CT-Aufnahmen von Proben mit squared Harz Kanten typisch Harz Blöcke und Proben aus diesen Blöcken geschnitten ist verbunden mit Rand Beugung Artefakte, die Bildgebung stören können. Glättung von Kanten Harz, zwar möglich, ist mühsam und zeitaufwändig.
Während eine Vielzahl von Einbettungs Kunststoffgranulate werden eingesetzt in der Elektronenmikroskopie, führte hohe Hintergrund schwieriger Harze wie einbetten 812 zugeordnet uns, andere zu testen. Wir entschieden uns für LR weiß aufgrund seiner niedrigen Viskosität, geringe Schrumpfung, geringe Neigung zur Form Luftblasen während der Polymerisation und niedriger Hintergrund. Rand-freie Proben zu erstellen und die Menge des Harzes rund um die Probe zu minimieren, haben wir die Protokolle, um Proben in flüssiges Harz in Polyimid-Schlauch vor der Polymerisation zeichnen entwickelt. Polyimid wurde für seine hohe thermische Stabilität und hohe Röntgen Transmission gewählt, so dass die Entfernung des Schlauches nicht notwendig für die Bildgebung ist. Zu guter Letzt haben wir einen benutzerdefinierte Mikropipette Adapter für unser Beispiel Einbettung Technik um zuverlässig halten Sie den Schlauch und verhindern die Kontamination von Mikropipetten entwickelt. Der Adapter kann 3D aus einem CAD-Image-Datei gedruckt werden. Zusammengenommen ist das Ziel der hier vorgestellten probenvorbereitungsmethoden verbesserte Färbung Kontrast, starre Ruhigstellung und Langzeitlagerung von intakten Millimeter-Skala Exemplare zur Einbettung von kleinen Proben einfacher zu machen, zu erreichen.
Protocol
Alle Vorgänge an lebenden Tieren stimmten die institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der Pennsylvania State University.
1. Tag 1: Fixierung
- Zur Verbesserung der Fixierung und reduzieren Sie die Lautstärke der Darminhalt, verhungern die Jungfische für mindestens 24 h für eine Probe von 10 mm oder mehr für größere Exemplare (zB., 72 h für eine Probe 14 mm).
- Pre-chill 10 % Neutral gepufferte Formalin (NBF) und 2 x Tricaine-S (MS-222, 400 mg/L) auf dem Eis um 4 ° C.
- Verdoppeln die Fische Wasserinhalt mit gekühlten 2 x MS-222 für schnelle und humane Euthanasie.
- Warten Sie 30 (Larven) s bis 60 s (Jugendliche) nach den Fischen nicht mehr bewegt.
- Tauchen Sie die Fische im gekühlten 10 % NBF für 10 Minuten.
- Befestigen Sie den Fisch in gekühlten 10 % NBF Lösung über Nacht in flachen Behältern bei Raumtemperatur.
Hinweis: Behälter mit flachem Boden sind verpflichtet zu minimieren, die Biegung der Probe. Das Fixiermittel und Lösungen für alle weiteren Schritte sollten mindestens 20 Mal das Probenvolumen sein, sofern nicht anders angegeben. Für 1-5 Larven Zebrafisch ist die empfohlene Lösung mindestens 1 mL. Unzureichende Fixativ Ergebnisse in schlechte Fixierung und ein Überschuss an Reagenz Volumen beeinflusst negativ nicht das Ergebnis des beschriebenen Verfahrens. Für komplette Fixierung der größere Fische Schlitz, den Bauch leicht anterior anal Pore ab. Verwenden Sie minimal Eindringen von Schere oder Messer und sanfte Kraft Weg vom Fisch während des Schneidens zur Minimierung von Schäden an inneren Organen. Fixierung-Protokolle wurden von anderen31,32,33beschrieben.
(2) Tag 2: Austrocknung & Färbung
- Spülen Sie mit feste Proben 3 mal 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7.4 für 10 Minuten.
- Tauchen Sie die Proben in 35 % Ethanol (EtOH) für 20 min bei Raumtemperatur mit sanften Agitation.
Hinweis: Für alle sanfte Erregung Schritte verwenden Sie einen Tabletop Shaker und für einen Mischeffekt stoßen und Reiben der Probe gegen den Container Oberflächen sorgfältig zu vermeiden. - Tauchen Sie die Proben in 50 % EtOH für 20 min bei Raumtemperatur mit sanften Agitation.
- Phosphotungstic Acid (PTA) Pulver in Wasser eine 1 % w/V-Stammlösung vorbereiten zu lösen.
- Verdünnen Sie die PTA-Stammlösung 1 % 3:7 in 100 % EtOH, einer 0,3 % PTA Färbelösung zu erhalten.
- Färben Sie die Proben über Nacht in der 0,3 % PTA Lösung bei Raumtemperatur mit sanften Agitation.
3. Tag 3: Infiltration
- Bereiten Sie 1:1 V/V Mischung aus 100 % EtOH und LR weiß Acrylharz und beiseite stellen.
- Spülen Sie 3 Mal in 70 % EtOH für 10 Minuten.
- Tauchen Sie die Proben in 90 % EtOH für 30 min bei Raumtemperatur mit sanften Agitation.
- Tauchen Sie die Proben in 95 % EtOH für 30 min bei Raumtemperatur mit sanften Agitation.
- Tauchen Sie die Proben zweimal in 100 % EtOH für 30 min bei Raumtemperatur mit sanften Agitation.
- Tauchen Sie die Proben in der 1:1 EtOH und LR weiß Acrylharz Mischung über Nacht bei Raumtemperatur mit sanften Agitation.
4. Tag 4: Einbetten
- Tauchen Sie die Proben in 100 % LR White Harz für 2 h bei Raumtemperatur mit sanften Agitation.
- Ersetzen Sie das Harz im Schritt 4.1 mit frischen 100 % LR weiß Harz und 1 h bei Raumtemperatur unter schonenden rühren inkubieren.
- Montieren Sie die einbettende Apparatur (Abbildung 1).
- Geschnitten Sie Polyimid-Schlauch von entsprechendem Durchmesser und Länge.
Hinweis: Die Schläuche mit einem Innendurchmesser, der mindestens 0,1 mm größer als der Durchmesser der Probe wird empfohlen. Für typische Exemplare ist eine Standardlänge von 30 mm Schlauch für jede Probe verwendet. Wenn gewünscht, können die längliche Exemplare mit längeren Schlauch untergebracht werden.- Das breite Ende des Adapters einbetten beimessen Sie einer Mikropipette P1000 und einfügen Sie den Polyimid-Schlauch, das schmale Ende (Abbildung 1). Wenn die Einbettung Adapter nicht verfügbar ist, gehen Sie zu Schritt 4.3.3. Ansonsten weiterhin Schritt 4.4.
- Clip aus dem Ende einer Mikropipette Spitze quer über solche, die der Polyimid-Schlauch eng anliegt. Schneiden Sie bei 44 mm aus dem breiten Ende des 200 µL gelbe Mikropipette Tipp für die 0,0403" Schläuche und 59 mm vom unteren Rand blau 1 mL Tipp für 0,105" Schläuche. Schneiden Sie je nach Bedarf.
- Legen Sie die geschnittenen Mikropipette Spitze auf einer Mikropipette.
- Übertragen die Proben auf einen kleinen wiegen Boot oder v-förmige Lösung Becken und Tauchen Sie voll und ganz die Proben in 100 % LR White Harz.
- Richten Sie mit der Einbettung Apparat aus Schritt 4.3 den Schlauch am breiten Ende der festen Probe (oder in Richtung des Kopfes bei Tierpräparate) und pipette die Probe langsam in den Schlauch. Richten Sie den in der Mitte der Röhre und sicherzustellen Sie, dass das Rohr oberhalb und unterhalb der Probe mit Harz gefüllt ist.
- Pipette der Probenmaterials in den Schlauch, so dass die Probe in die natürliche, nach vorne Richtung bewegt.
Hinweis: Langsame pipettieren vermeidet Luftbläschen und Probe-Schäden, die durch Abrieb gegen den Schlauch Rand. Rückwärtsbewegung in den Schlauch beschädigen leicht Extremitäten (Gliedmaßen, Flügel, Flossen, etc.). Es wird empfohlen, einige Harz-Überlauf in die einbettende Apparat zu ermöglichen, damit Sie später Luft nicht den Schlauch bei der Entnahme tritt.
- Pipette der Probenmaterials in den Schlauch, so dass die Probe in die natürliche, nach vorne Richtung bewegt.
- Sofort verschließen Sie das offene Ende mit Öl-basierte soft Modelliermasse.
- Glätten Sie den Ton in einer 1 mm dicken Blech.
- Stabilisieren Sie den Schlauch zwischen Zeige- und Mittelfinger.
- Drücken Sie langsam den Ton gegen das Ende des Schlauches mit Daumen.
- Entfernen Sie überschüssigen Ton.
- Die Mikropipette entfernen Sie das Einbetten von Gerät.
- Ziehen Sie den Schlauch durch sanfte Drehung und versiegeln Sie das andere Ende mit dem Ton zu.
- Halten Sie einen Finger gegen das geschlossene Ende um das Auswerfen des Tons zu verhindern.
- Drücken Sie langsam das unversiegelte Ende des Schlauches in den Ton.
- Legen Sie den Schlauch horizontal und polymerisieren das Harz für 24 h bei 65 ° C.
Hinweis: Horizontale Platzierung verhindert die Probe während der Polymerisation. Wenn eine kleine Menge an Luft im Schritt 4.8 gefangen war, kann am Ende mit der Luftblase leicht angehoben werden, um Luftblase Bewegung in Richtung der Probe zu verhindern. Wichtig ist, kann zu viel Höhe während der Polymerisation die Probe in Richtung der low-End aufgrund der Schwerkraft fallen verursachen. Eine ordnungsgemäß eingebettete Probe zeigt im Vergleich zu einem mit einer Luftblase, was vermieden werden sollte, da die Brechung von Luft/Harz Schnittstellen Bildqualität (Abbildung 2) beeinträchtigen kann.
5. Tag 5: Sammlung
- Sammeln Sie die Proben für die Bildaufnahme am Ende des Tages 5.
Hinweis: Das Entfernen von Polyimid-Schlauch ist möglich aber nicht notwendig für die Bildgebung. Synchrotron-basierten Mikro-CT-Bildgebung für der Zebrafisch-Probe wurde am Strahlrohr 2-BM bei Advanced Photon Source (APS) im Argonne National Laboratory (Lemont, Illinois, USA) durchgeführt. Für PTA-gefärbten Zebrafisch, wurde eine optimale Energie Röntgenbereich von 5-30 keV festgelegt und ein Röntgenenergie von 13,8 keV diente zur Bildgebung. 1501 Projektionen wurden erzielt bei 13,8 keV über 180 Grad (1 Projektion alle 0,12 Grad) mit einer 2048 von 2048 Pixelkamera. Darüber hinaus wurden auch zwei flach-Feld (Gain) Bilder (am Anfang) und am Ende des Erwerbs und eine dunkel-Feldbild erworben. Wohnung-Felder und dunkel Korrekturen, Ring Artefakt Reduzierung und Bildrekonstruktion erfolgten Einsatz von der Open source TomoPy Toolkit34. PTA-gefärbten Daphnien und Drosophila Proben wurden auf einem Röntgenmikroskop12,35abgebildet. Spezielle Mikro-CT-Einstellungen sind auf das Objekt und die Qualität des Flecks angewiesen. Zum Beispiel die Drosophila -Probe bei 40 kVp, 74 gescannt wurde mA und 15 s bei einer Voxel-Auflösung von 3.10 3.10 × × 3.10 µm3.
Representative Results
Das Protokoll beschriebenen Details die Beispielprozedur Vorbereitung für ganze zebrafischlarven und Jungfische für die Mikro-CT-Bildgebung. Diese Methode ist insbesondere für andere Proben leicht angepasst (zB., Drosophila, Daphnien, Arabidopsis, Maus Organe). Inkubationszeiten in verschiedenen Stufen eignen sich für zebrafischlarven und Proben von ähnlicher Größe; größere Proben erfordern längere Inkubationszeit. Um mit der Probe einbetten Schritte zu unterstützen, gestalteten wir einen Adapter, der eine 1 mL Mikropipette misst, und kann für verschiedene Größen von Polyimid Schläuche (Abbildung 1) angepasst werden. Diese benutzerdefinierte Adapter war 3D gedruckt aus einer CAD-Datei, die diese Handschrift zugeordnet und auf http://publications.chenglab.com/LinEtAlJOVE/ zum Download verfügbar ist. Da alle Leser möglicherweise nicht Zugang zu einem 3D Drucker, ist die Montage von einem hausgemachten einbetten Apparat mit Mikropipette Tipps im Protokoll (Schritt 4.3) beschrieben. Ein erfolgreich eingebettete Zebrafisch-Larven im Vergleich ein Exemplar mit einer Luftblase (Abbildung 2), erscheint die wahrscheinlich die Bildqualität verschlechtern wird. Um die Vielseitigkeit des Verfahrens einbetten zu demonstrieren, zeigen wir die Proben aus verschiedenen Modellorganismen (i.e., Danio, Drosophila, Daphnien, Mausembryos), die durch die Probe Vorbereitung Pipeline (gegangen ( Abbildung 3). Rekonstruierte 3D Volumen der gesamten Danio, Daphnienund Drosophila Exemplare durch Mikro-CT abgebildet werden (Abbildung 4) angezeigt. Wichtig ist, wie die Danio Probe gezeigt haben, können für mehrere bildgebende Sitzungen (Abbildung 5) Diese Proben für eine längere Zeit gespeichert und wiederverwendet werden.
Abbildung 1: Einbetten von Apparat. (A) ein Adapter wurde entwickelt, um die Einbettung mit gemeinsamen Labor-Tools zu erleichtern. (B) eine Cross-Sectional Illustration des Adapters. (C) der Apparat nach dem Einsetzen der Polyimid-Schlauch am Adapter (Buchstabe a) einbetten und Anbringen der Mikropipette bei Adapter (c). Adapter-Segment (b) ist eine Überlauf-Kammer entwickelt, um überschüssiges Harz aufnehmen und die Mikropipette vor Verschmutzung zu schützen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Erfolgreich eingebettete Proben sind frei von Luftblasen. (A) eine eingebettete 3 Tag nach Befruchtung (Dpf) Larven Zebrafisch ohne Luftblase. (B) eine eingebettete 3 Dpf Zebrafisch mit einer Luftblase. Bei der Einbettung eingeschlossene Luft kann in Richtung der Probe verschieben, wenn die Probe während der Polymerisation nicht horizontal platziert ist. Skalieren von Balken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Eine Vielzahl von Proben mit unserem Protokoll eingebettet werden kann. (A) 7 Dpf Zebrafisch-Larven. (B) Erwachsenen Drosophila. (C) Erwachsenen Daphnien. (D) Maus-Embryo. Größere Proben wie der Maus-Embryo werden durch ein paar Änderungen des Protokolls untergebracht. Kurz, war der Polyimid-Schlauch, 1/3 seiner Länge mit Harz gefüllt und polymerisiert vor dem einbetten. Feste und gefärbten Probe wurde auf das Pre-polymerisierten Harz platziert. Der Schlauch wurde dann mit UN-polymerisierten Harz, gefolgt von einem zweiten Polymerisation gefüllt. Polyimid-Schlauch wurde vor der Fotografie ermöglicht bessere Visualisierung der Probe in dieser Figur entfernt. Die Entfernung des Schlauches ist nicht notwendig für die erfolgreiche Bildaufnahme von Mikro-CT Maßstabsleisten: Probe Bilder, 5 mm; Erweiterte Einsätze, 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. 3-dimensionale Darstellungen des eingebetteten Proben. (A) rekonstruiert 3 Dpf Zebrafisch-Larven in 0.743 × 0.743 × 0.743 µm3 Voxel Auflösung. (B) rekonstruiert Erwachsenen Daphnien (3 × 3 × 3 µm3 Voxel Auflösung). (C) rekonstruiert Erwachsenen Drosophila (3.1 × 3.1 × 3,1 µm3 Voxel Auflösung). Digitalen Querschnitte können in jedem beliebigen Winkel erzeugt werden, wie in der linken Spalte angezeigt. Oberfläche Darstellungen erscheinen auf der rechten Seite unter Verwendung von kommerzieller Software gerendert. Einbetten von Harz kann man in allen Scans außerhalb der Probe (festgestellt durch *), aber die Probe selbst nicht stört. Der Zebrafisch-Larven wurde am Argonne National Laboratory an der Advanced Photon Source abgebildet, die Synchrotron-basiert ist. Die Daphnien oder Drosophila Exemplare wurden mit einem kommerziellen Röntgenmikroskop abgebildet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5. Proben mit unserem Protokoll eingebettet werden können neu abgebildeten mit Mikro-CT Die gleichen 5 Dpf Zebrafisch Larve war 2011 (A) und (B) 2013, präsentiert als durchschnittliche Intensität Projektionen der sagittalen Ansicht abgebildet. Bildvergleich zwischen Scans nach die Speicherung die Erhaltung der anatomischen Merkmale zeigt. (C) eine Nahaufnahme der Muskel von beiden Scans ist mit segmentierten Linien, die entsprechende Regionen verwendet für (D) Intensität Profil Generation vorgestellt. Intensität profile normiert auf ihre entsprechenden Durchschnittswerte in beide Richtung zeigen räumlich passenden lokalen Gipfeln in beiden Scans. (E) durchschnittliche Intensitätswerte für ausgewählte Regionen in A und B gehören zum Hintergrund (Bg, lila), neuronale Kernen (N, grün), weißen Substanz (W, blau) und der Muskel (M, Orange) wurden durch einen Durchschnittswert für Hintergrund (weiß) geteilt und zur Erzeugung von Signal-Rausch- Verhältnis (SNR), die auch zwischen den Scans entspricht. Skalieren von Balken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
In diesem Manuskript präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für starre Immobilisierung fester und voller Flecken Millimeter-Skala (0,5 bis 2,5 mm Durchmesser) Proben für die Mikro-CT-Bildgebung. Angesichts der schnellen Vormarsch der Mikro-CT-Technologie in Bezug auf Auflösung und Geschwindigkeit, ist eine Methode der permanenten Probe Konservierung mit Re-imaging Funktionen höchst wünschenswert. Traditionell, dichten Einbettung Harz allgemein dienen in der Elektronenmikroskopie zur Strukturförderung zu ultradünnen Abschnitte schneiden und den Schaden auf die Probe zu minimieren. Unsere Methode angepasst seine Verwendung für starre Ruhigstellung während nicht-destruktive Bildbearbeitung. Um die bildgebenden Artefakte aus dem Vorhandensein von überschüssiges Harz zu minimieren, haben wir die Verwendung von x-ray transparent Polyimid Schläuche Runde Proben ohne Kanten zu erstellen, und das Volumen der Harz um die Probe beschränken implementiert.
Optimales Ergebnis des Verfahrens einbetten ist sorgfältige Ausführung mehrere wichtige Schritte und Liebe zum Beispiel Integrität während des Verfahrens abhängig. In der Tat, Beschädigung der Probekörpers eine kompromittierte Endbild unabhängig vom Erfolg der Ausführung der Bildgebung führen. Da kühlen zu einer Verminderung der Schmerz Antworten trägt und fixierten Gewebe verschlechtert sich bei höheren Temperaturen schneller, verwenden wir vorgekühlt Reagenzien. Große Exemplare müssen geschnitten werden, um den Eintrag Fixativ in das Innere der Probe zu ermöglichen, so dass innere Organe wie Leber, Bauchspeicheldrüse und Darm vollständig behoben sind. Fixierten Gewebe verschlechtern und strukturelle Integrität, Zerstörung der biologischen Struktur zu verlieren. Ein weiterer wichtiger Schritt ist, die Probe in seiner natürlichen Ausrichtung beizubehalten. Daher setzen wir uns für die Verwendung von flachen Behälter, die wir im gesamten Verfahren und sind besonders wichtig bei Fixierung verwenden. Fixierung in Polypropylen Röhrchen oder konische Rohre, die in der Regel einen v-förmigen Boden sollte vermieden werden da sie längliche Proben zu biegen, verursachen können die verzerrt der natürliche Morphologie der Probe. Darüber hinaus ist der Innendurchmesser des Polyimid-Schlauch um die Verwendung von Harz zu minimieren, nur etwas größer als die Breite der Probe. Biegen der Probe kann auch Schaden der Probe führen beim Eintritt in die Röhre. Es wird auch empfohlen, die Probe in den Schlauch auf natürliche Weise zur Vermeidung von schädlicher Extremitäten nach vorne übertragen. Ordnungsgemäße Entwässerung ist ein weiterer entscheidender Schritt. Dies geschieht mit kleinen Schritten EtOH Konzentrationen langsam ersetzt Wasser mit EtOH, das ist mehr mischbar mit dem Harz zu erhöhen. Starke Anstieg der Konzentration von EtOH Gewebe schrumpfen zugeordnet sind und durch zusätzlichen Schritten von EtOH Inkubation für die Umstellung schrittweise gelindert werden können. Zur Minimierung der Bewegung der Probe oder Lufteinschlüsse, wenn es welche gibt, sind schließlich die Proben während der Harz-Polymerisation (Ende 4. Tag) horizontal platziert. Lufteinschlüsse oder Versiegelung neben der Probe führt zu optischen Artefakte mit Röntgenbildgebung Rand Beugung, Verringerung der Bildqualität zugeordnet.
In Bezug auf eventuelle Änderungen des Protokolls, andere Einbetten von Harzen und Metall Flecken können anstelle von LR White Acryl und PTA, bzw. verwendet werden. Embed812, ein Epoxidharz, allgemein verwendet in der Elektronenmikroskopie, hochviskosen, schwieriger zu übertragen ist, kann dazu führen, dass die Verzerrung der Exemplare und ist verbunden mit höheren Hintergrund als Acryl- oder Glykol Methacrylat-Harze. Während JB4 Plus ein Glykol-Methacrylat ist dünnflüssiger als EMbed812 und untere Hintergrund hat, zufällige Entstehung von Lufteinschlüssen erscheinen häufig in der Nähe der Probe. Wie bereits erwähnt, Lufteinschlüsse verschlechtern die Bildqualität und sind besonders problematisch für wertvollen Proben. Es ist erwähnenswert, dass Technovit 7100, ein weiterer Glykol Methacrylat mit PTA Färbung, stört was zu schlechten Kontrast im endgültigen Bild. Vergleichsweise, LR White Acryl hat Wasser-wie Viskosität, niedrige Hintergrund und stört nicht mit PTA zu beflecken. In unseren Händen ist die Erfolgsquote bei der Einbettung in LR weiß ohne Probe Schaden oder Luftblasen mehr als 95 %. Aus diesen Gründen befürworten wir seine Verwendung als das Einbetten von Harz für Gewebe Mikro-CT. In Bezug auf Flecken die Ergebnisse der verschiedenen Metall Flecken wie Osmium ausgefällt, Jod, und PTA in Mikro-CT-Bildgebung wurde verglichen und diskutiert an anderer Stelle15,16,17 und ist nicht in den Anwendungsbereich dieser Manuskript.
Die Größe der Stichprobe ist eine große Einschränkung unserer aktuellen Protokolls. Da wir saugen beschäftigen, Proben in den Schlauch zu übertragen, ist die Fähigkeit zu sehen, die Probe für Orientierung und die Gewährleistung, die es in der Tat im Schlauch ist von entscheidender Bedeutung. Infolgedessen Submillimeter Proben wie Bärtierchen (i.e., Bärtierchen) sind extrem schwer zu integrieren, weil sie erfordern den Einsatz ein Mikroskops visualisiert werden. Sobald Absaugung angewendet wird, mikroskopische Präparate sind leicht von der Fokalebene verloren und werden schwierig zu entdecken, macht es schwierig, festzustellen, ob sie die angefügte Ende des Schlauches zu weit durchlaufen. Größere Proben, wie mäuseembryonen, (3-10 mm) können mit geringfügigen Änderungen zum Einbetten von Protokoll (Abbildung 4) eingebettet werden. Insbesondere wurde der Polyimid-Schlauch auf 1/3 mit Flüssigharz, die vor dem Einbetten polymerisiert war gefüllt. Die feste und gefärbte Probe wurde auf das Pre polymerisierten Harz platziert. Das Rohr war dann voll gefüllt mit UN-polymerisierten Harz und gefolgt von einem zweiten Polymerisation.
Die Bedeutung unserer einbetten Protokoll ist vielfältig. Starr immobilisierte ganze Tier oder Gewebe Proben aus Gründen einschließlich wünschenswert sind: (1) Schaffung von langfristigen Repositories von Proben, die schwer zu generieren oder vorzubereiten; (2) die Wiedererlangung von Daten; (3) aktivieren serielle Bildgebung mit mehreren bildgebender Verfahren; und (4) Bereitstellung von Standards für die Kalibrierung und Technologieentwicklung. Proben mit unserem einbetten Verfahren sind eingehüllt in festen Harz, das widerstandsfähig gegen Beschädigungen und können daher leicht gespeichert werden vielleicht auf unbestimmte Zeit. Langfristiger Lagerung eignet sich besonders für seltene oder mühsam erzeugte Exemplare wie die Phenome Projekten zugeordnet. Weiter, den Fall, dass die digitalen Daten verloren gegangen sind, können die Daten aus der ursprünglichen Probe generiert werden. Die Fähigkeit des Re-imaging über einen langen Zeitraum hinweg potenziell ermöglicht die gleiche Probe mit verhört werden erweiterte bildgebende Modalitäten in der Zukunft. Da die Proben körperlich stabil zwischen bildgebenden Instanzen sind, sind Bilder vom gleichen Muster in der gleichen Ausrichtung, Erleichterung der Registrierung zwischen früheren und späteren Datensätzen erworben. Beispielsweise kann eine Bild mit niedriger Auflösung nur Segmentierung der Gewebe in einem Zebrafisch-Larven. Die gleichen Larve kann später mit höherer Auflösung neu aufgespielt werden, so dass numerische Analysen mit zellulären Auflösung detaillierte. Diese Funktion zum direkten Vergleich zwischen den registrierten Scans schlägt Harz eingebettete Proben als möglicher standard für die Entwicklung von Mikro-CT. Die Auswirkungen der Änderungen auf das bildgebende Verfahren können beurteilt werden, von der gleichen Probe imaging, so dass alle Variablen in der Probe Vorbereitungsschritt gesteuert werden. Schließlich kann eine Harz eingebettet Standardprobe für Kalibrierung verwendet werden, für Konsistenz der Bildgebung zu testen.
Unsere bisherige Arbeit mutierten und erkrankten Fische Histologie Untersuchung zeigte, dass zelluläre Auflösung ermöglicht subtile Auffälligkeiten in der Gewebestruktur, die in grober Untersuchung mittels der sezierenden Mikroskop36oder ein Niederleistungs übersehen werden Stereo-Mikroskop. Wir möchten unsere hochauflösenden Analysen auf humanen Proben zu erweitern. Zebrafisch-Larven, die das primäre Thema unserer Entwicklungsarbeit umfassen, sind ähnlich wie menschliche Nadel Biopsien in ihrer Zerbrechlichkeit, zellulären und interzelluläre Gewebe Heterogenität, Größe (1-3 mm Durchmesser) und längliche Form. Basierend auf unserer langjährigen Erfahrung mit Zebrafisch und andere arbeiten, die zeigen, dass Mikro-CT erfolgreich gebeizt und gescannt von menschlichem Gewebe, wenn auch bei niedriger Auflösung37, erwarten wir unsere Ansätze zur Darstellung und Analyse der Nadel Biopsien Mehrwert verleihen. Wir haben geschätzt, dass die Montage ein Set reicht für eine Vorbereitung von bis zu 20 Proben der gleichen Bedingung, möglicherweise weniger als 30 US-Dollar. Die Proben vorbereitet durch unsere Einbettungs-Methode sind resistent gegen physischen Schaden und daher leicht zu transportieren. Die kostengünstigen und einfachen Transport empfehlen die Möglichkeit der Entnahme von Proben aus auf der ganzen Welt, insbesondere die Gebiete in denen zelluläre Auflösung Bildgebung mit Mikro-CT nicht leicht zugänglich ist. Unsere Vision ist, dass digitale Dateien mit hoher Auflösung der Nadel Biopsien (von 0,1 bis hin zu mehreren Terabyte) ermöglichen die Erstellung eines digitalen Atlas des menschlichen Geweben, und zur gleichen Zeit lassen die Forscher zu verfeinern und zu verbessern aktuelle Analyse Pipelines für Lokalisierung und quantitative Charakterisierung der zellulären und Gewebe Architektur 3D im Rahmen des Gewebes gescannt.
Disclosures
All die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte gibt.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Roland Myers danken, dass freundlicherweise die ursprüngliche TEM-Protokolle. Darüber hinaus möchten wir danken Dr. John Colbourne für die Bereitstellung der Daphnien -Probe, Dr. Santhosh Girirajan für die Bereitstellung der Drosophila -Probe und Dr. Fadia Kamal für die Bereitstellung des Mausembryos. Die Ermittler erkennen, finanzielle Unterstützung von der NIH (1R24OD18559-01-A2, PI: KCC), die Jake Gittlen Labore für die Krebsforschung und pilot Award Mittel aus der PSU Huck Instituten der Life Sciences und das Institut für CyberScience.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Phosphotunstic Acid | VWR | MK282402 | |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | MS-222 | |
| LR White | Electron Microscopy Sciences | 14380 | |
| Polyimide tubing (ID 0.04") | Nordson Medical | 141-0065 | The exact polyimide tubings described in the manuscript are no longer available. A close match is provided here. Tubing with custom diameter can be manufactured upon request. |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Oil-based soft modeling clay | Sculpey | S302 001 | |
| Micropipette P200 | Gilson | F123601 | |
| Micropipette P1000 | Gilson | F123502 | |
| Glass vials | VWR | 66015-042 | |
| V-shaped basin | VWR | 89094-676 | |
| Weigh boats | VWR | 10803-148 | |
| 200 μL yellow micropipette tip | Fisher Scientific | 02-707-500 | |
| 1 mL blue micropipette tip | Fisher Scientific | 02-681-163 | |
| Tabletop shaker | Thermolyne | M71735 | |
| Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 CCD | |
| X-ray microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa |
References
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