Summary
Temos protocolos e desenvolvido um aparelho personalizado para permitir a inserção de espécimes de milímetro-escala. Apresentamos os procedimentos de preparação de amostra com ênfase na incorporação em resina acrílica e poliimida tubulação para alcançar a imobilização rígida e armazenamento a longo prazo de espécimes para o interrogatório de morfologia de arquitetura e células de tecidos por micro-CT.
Abstract
Há mais de cem anos, o estudo histológico dos tecidos tem sido o padrão-ouro para o diagnóstico médico porque histologia permite todos os tipos de células em cada tecido para ser identificado e caracterizado. Nosso laboratório está trabalhando ativamente para tornar os avanços tecnológicos em raio-x microtomografia computadorizada (micro-CT) que trará o poder diagnóstico da histologia para o estudo de volumes de tecido cheia no celular resolução (i. e., um raio-x Modalidade de histo-tomography). Para este fim, nós fizemos melhorias orientadas para o pipeline de preparação de amostra. Uma otimização de chave e o foco do presente trabalho, é um método simples para a incorporação de rígida das amostras de milímetro-escala fixa e manchados. Muitos dos métodos publicados para imobilização de amostra e correlativa micro-CT imagens dependem de colocação das amostras em parafina, agarose ou líquidos como álcool. Nossa abordagem estende-se este trabalho com procedimentos personalizados e o design de um aparato printable 3-dimensional para incorporar as amostras em uma resina acrílica diretamente em poliimida tubulação, que é relativamente transparente aos raios x. Neste documento, os procedimentos de preparação de amostra são descritos para as amostras de 0,5 a 10 mm de diâmetro, o que seria adequado para toda zebrafish larvas e juvenis ou outros animais e amostras de tecido de dimensões semelhantes. Como prova de conceito, temos incorporado os espécimes de Danio, drosófila, Daphniae um embrião de rato; imagens representativas de 3-dimensional scans para três destas amostras são mostradas. Importante, nossa metodologia leva a vários benefícios, incluindo imobilização rígida, preservação a longo prazo dos recursos criados laboriosamente e a capacidade de re-interrogar amostras.
Introduction
Fenótipos são características observáveis de um organismo que representam as consequências de interações únicas entre seu fundo genético e o ambiente. Estas características podem incluir propriedades comportamentais, bioquímicas, morfológicas, no desenvolvimento e/ou fisiológicas. Importante, diferenças de características entre os organismos de tipo selvagem e mutantes genéticos podem fornecer a introspecção chave dos mecanismos e funções dos genes afetados. No que diz respeito a morfologia, histopatologia é o padrão ouro para avaliar fenótipos a nível celular, mas sofre de artefatos mecânicos e não permite a análise precisa de quantitativa volumétrica1. Nosso laboratório está motivado para superar as barreiras para a aplicação do poder diagnóstico da histologia para volumes de tecido completo em resolução de submicron.
Um levantamento de tecnologias disponíveis sugere que imagem por raio x micro computado-tomografia computadorizada (micro-CT) pode fornecer ideais capacidades necessárias para a histologia do milímetro-escala todo-animal 3-dimensional (3D). Micro-CT permite a visualização não-destrutivos, isotrópica, 3D e a capacidade de realizar a análise quantitativa de tecido arquitetura1,2. Nos últimos anos, a imagem em 3D de zebrafish imaculado e manchada de metal por micro-CT ganhou tração crescente e tem sido utilizada para análise volumétrica de vários tecidos, incluindo muscular, dentes, ossos e tecidos adiposo3,4 ,5,6,7,8,9,10. Outros organismos-modelo e amostras de tecido também são aptos para micro-CT imagem. Por exemplo, foi introduzido um pipeline para quantificar a neuroanatomia de mesoescala densa de cérebro de rato fotografada através de de micro-CT síncrotron11. Da mesma forma, um protocolo de coloração eosina-based tem demonstrado ser adequado para a imagem latente de micro-CT de tecidos moles de rato todo órgãos12. Análise morfométrica das vértebras de L3 humanas inocente e a visualização de pulmões humanos prata manchada usando micro-CT demonstraram a utilidade desta tecnologia para humanos amostras de13,14.
Para realizar a grande promessa de micro-CT para fenotipagem morfológica completa de intactos pequenos animais e amostras de tecido, uma série de obstáculos precisa ser superados em relação a taxa de transferência, resolução, campo de visão abrangente pilha que mancha, e a preservação a longo prazo. Enquanto cada um desses aspectos é criticamente importante, o foco do presente manuscrito é a otimização dos procedimentos de incorporação, com notas adicionais na amostra fixação e coloração. Heavy metal coloração é útil porque o contraste inerente entre diferentes tecidos moles em micro-CT imagens é baixo. A potência de metal várias manchas, tais como o tetróxido de ósmio, iodo, ácido fosfotúngstico (PTA) e galocianina-chromalum realçar o contraste para a imagem latente de micro-CT tem sido estudadas15,16,17. Acetato de uranilo também tem sido usado como um agente de contraste para a imagem latente de micro-CT dos ossos e cartilagens18,19. PTA como usado em nosso protocolo leva à coloração consistente de quase todos os tecidos e células em espécimes de zebrafish inteiro, produzindo imagens que são potencialmente compatíveis com estudos de histologia, como através de volumes completos de tecido.
Durante a aquisição de imagens de micro-CT, uma projeção de 2-dimensional (2D) é tomada como a amostra é girada por uma fração de um grau e repetida até que a amostra foi concluída uma rotação de 180° ou 360°, gerando uma série de milhares de projeções 2D utilizadas para o reconstrução do volume 3D20. Neste processo, qualquer perturbação da amostra fará com que as projecções 2D correspondentes desalinhados, resultando em volumes 3D mal reconstruídos. Imobilização de amostra é uma forma de corrigir este problema e algumas estratégias atuais envolvem submergindo a amostra em álcool ou incorporação em agarose em tubos de polipropileno ou micropipeta dicas3,5,15, 16 , 21 , 22. métodos de imersão em líquidos não são ideais, pois o movimento da amostra durante a aquisição de imagens pode ocorrer entre conjuntos de imagens, resultando em reconstruções deslocadas de volumes 3D23. Além disso, é sabido que a estabilidade física de amostras de tecido líquido armazenado é pobre em escalas de tempo de meses a anos, como resultado de instabilidade química e abrasão superficial associado com o movimento dos pontos de contacto entre a amostra e o recipiente (de parede observações pessoais com amostras de tecido humano e animal fixo).
Para reduzir o potencial de movimento da amostra durante a imagem latente, as amostras podem ser incorporadas em agarose24,25,26, mas esta prática é associada com o risco da mancha de difusão em agarose, reduzindo assim a imagem contraste,26. Além disso, o líquido ou agarose preparações são propensas a danos físicos e degradam ao longo do tempo, tornando-os impróprios para o armazenamento de amostra a longo prazo. Nós raciocinou que um método de imobilização potencialmente bem-sucedido e simples amostra poderia ser adaptado do utilizado para amostras de microscopia eletrônica. Resinas polimerizadas como EPON 812 (descontinuado e substituído por incorporar 812) são comumente usadas para fornecer a dureza necessária para gerar seções ultra-finas para microscopia eletrônica27,28. De fato, vários estudos comparativos entre a imagem de raio x e microscopia eletrônica têm demonstrado que as amostras embutidas resina podem ser fotografadas por microscopia de raios-x29,30. No entanto, algumas das práticas padrão de microscopia eletrônica não se traduzem diretamente em micro-CT imagem. Por exemplo, micro-CT imagens de amostras com quadrado resina bordas dos blocos de resina típica e amostras de blocos é associado com artefatos de difração de borda que podem interferir na imagem. Suavização de bordas de resina, enquanto possível, é trabalhoso e demorado.
Enquanto uma variedade de resinas plásticas de incorporação são empregados em microscopia eletrônica, o fundo elevado associado com resinas mais difícil como incorporar 812 levou-na testar os outros. Nós escolhemos LR White devido a sua baixa viscosidade, baixo encolhimento, baixa tendência para formar bolhas durante a polimerização e mais baixo fundo. Para criar exemplos de borda-livre e para minimizar a quantidade de resina em torno da amostra, nós desenvolvemos os protocolos para desenhar espécimes em resina líquida para tubo de poliimida antes da polimerização. Poliimida foi escolhida por sua alta estabilidade térmica e transmittance elevado de raio-x para que a remoção do tubo não é necessária para a imagem latente. Finalmente, nós projetamos um adaptador personalizado micropipeta para nossa amostra incorporação técnica para confiantemente segurar o tubo e impedir a contaminação de micropipetas. O adaptador pode ser 3D imprimido a partir de um arquivo de imagem de CAD. Tomados em conjunto, o objetivo dos métodos de preparação de amostra apresentada aqui é fazer a incorporação de pequenas amostras mais simples, conseguir reforçada coloração de contraste, imobilização rígida e armazenamento a longo prazo de espécimes de milímetro-escala intacta.
Protocol
Todos os procedimentos em animais vivos foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) na Universidade Estadual da Pensilvânia.
1. dia 1: fixação
- Para melhorar a fixação e reduzir o volume do conteúdo do intestino, os juvenis pelo menos 24 h para uma amostra de 10 mm ou mais para os espécimes maiores de fome (EG., 72 h para uma amostra de 14 mm).
- Pre-calma 10% neutro tamponado formalina (NBF) e 2 x tricaina-S (MS-222, 400 mg/L) no gelo a 4 ° C.
- Dobro o peixe de água volume com refrigerada 2 x MS-222 por eutanásia rápida e humana.
- Espere por 30 s (larvas) para 60 s (juvenis), depois o peixe para de se mover.
- Mergulhe o peixe refrigerados 10% NBF por 10 min.
- Consertar o peixe em solução NBF refrigerada 10% durante a noite em recipientes de fundo chato em temperatura ambiente.
Nota: Empregue recipientes são necessárias para minimizar a flexão da amostra. Soluções de todas as etapas subsequentes e o volume de fixador devem ser pelo menos 20 vezes o volume da amostra, a menos que especificado de outra forma. Para 1-5 zebrafish larval, o volume de solução recomendada é pelo menos 1 mL. Resultados insuficientes de fixador na fixação pobre e um excesso de volume de reagente não afetar negativamente o resultado do procedimento descrito. Para a fixação completa de peixes maiores, corte a barriga começando ligeiramente à frente do poro anal. Use a penetração mínima de tesoura ou faca e aplicar força suave longe o peixe durante os cortes para minimizar danos nos órgãos internos. Protocolos de fixação têm sido descritas por outros31,32,33.
2. dia 2: Desidratação & coloração
- Enxague espécimes fixos 3 vezes em 1x tamponado fosfato salino (PBS) pH 7,4 por 10 min.
- Mergulhe as amostras em 35% de álcool etílico (EtOH) por 20 min em temperatura ambiente com agitação suave.
Nota: Para todas as etapas de agitação suave, utilize um agitador do tabletop e definida para um efeito de mistura, evitando cuidadosamente batendo e roçando as superfícies do recipiente da amostra. - Mergulhe as amostras em 50% EtOH por 20 min em temperatura ambiente com agitação suave.
- Dissolva o pó de (PTA) ácido fosfotúngstico em água para preparar uma solução de reserva de 1% w/v.
- Diluir a solução-mãe 1% PTA 3:7 em 100% EtOH para obter uma solução de coloração de PTA de 0,3%.
- Manche as amostras durante a noite na solução de PTA de 0,3% em temperatura ambiente com agitação suave.
3. dia 3: infiltração
- Preparar a mistura de 1:1 v/v de 100% EtOH e LR branco resina acrílica e reserve.
- Lave 3 vezes em 70% EtOH por 10 min.
- Mergulhe as amostras em 90% EtOH durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave.
- Mergulhe as amostras em 95% EtOH durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave.
- Mergulhe as amostras duas vezes em 100% EtOH durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave.
- Mergulhe as amostras na mistura de 1:1 EtOH e LR branco da resina acrílica durante a noite em temperatura ambiente com agitação suave.
4. dia 4: incorporação
- Mergulhe as amostras em 100% LR White resina para 2 h à temperatura ambiente com agitação suave.
- Substitua a resina na etapa 4.1 fresco 100% LR branco resina e incube por 1h à temperatura ambiente com agitação suave.
- Monte o aparelho encastre (Figura 1).
- Corte a tubulação de poliimida de comprimento e diâmetro adequado.
Nota: Recomenda-se o tubo com um diâmetro interno é maior que o diâmetro da amostra pelo menos 0,1 mm. Para espécimes típicos, um comprimento padrão de 30 mm do tubo é usado para cada amostra. Quando desejado, alongadas espécimes podem ser acomodados usando tubos mais longos.- Anexar uma micropipeta P1000 para a extremidade larga do adaptador de encaixe e inserir o tubo de poliamida para a extremidade estreita (Figura 1). Se o adaptador de encaixe não estiver disponível, vá para a etapa 4.3.3. Caso contrário, continue a etapa 4.4.
- Clip a extremidade de uma ponta da micropipeta em frente tal que a tubagem de poliimida se encaixa perfeitamente. Cortar a 44 mm da extremidade larga de uma dica de amarelo micropipeta de 200 µ l para o 0,0403" tubulação e 59 mm da parte inferior da ponta azul 1 mL para o 0,105" tubulação. Guarnição conforme necessário.
- Conecte a ponta de corte micropipeta para uma micropipeta.
- Transferir as amostras para um barco pequeno pesar ou bacia de solução em forma de V e submergir totalmente as amostras em 100% resina LR White.
- Com o aparelho de incorporação de passo 4.3, mirar o tubo na extremidade larga da amostra fixa (ou na direcção da cabeça no caso de espécimes animais) e pipetar amostra lentamente para a tubulação. Coloque a amostra no meio da tubulação e certifique-se do que tubo acima e abaixo o espécime é preenchido com resina.
- Pipete a amostra para o tubo de tal que a amostra está se movendo na direção natural, para a frente.
Nota: Pipetagem lenta evita bolhas de ar e danos de espécime causados pela abrasão contra a extremidade de tubulação. Movimento para trás para o tubo pode facilmente danificar extremidades (Membros, asas, barbatanas, etc.). É recomendável permitir algum estouro de resina no aparelho de incorporação para que, mais tarde, ar não entra a tubulação durante a remoção.
- Pipete a amostra para o tubo de tal que a amostra está se movendo na direção natural, para a frente.
- Feche imediatamente a extremidade aberta com argila de modelagem suave à base de óleo.
- Achate a argila em uma folha de 1 mm de espessura.
- Estabilize o tubo entre os dedos indicador e médio.
- Pressione lentamente o barro contra a extremidade do tubo com o polegar.
- Remova o barro em excesso.
- Retire o aparelho de encastre a micropipeta.
- Puxe o tubo pela rotação suave e selar a outra extremidade com o barro.
- Segure um dedo contra a extremidade selada para impedir a ejeção da argila.
- Empurre lentamente a sem lacre das extremidades do tubo para dentro da argila.
- Colocar o tubo na horizontal e polimerizar a resina para 24 h a 65 ° C.
Nota: A colocação Horizontal evita o movimento de amostra durante a polimerização. Se uma pequena quantidade de ar foi preso numa etapa 4.8, o fim com a bolha de ar pode ser elevado ligeiramente para impedir a movimentação de bolha de ar em direção ao modelo. Importante, demasiado elevação durante a polimerização pode causar o espécime a cair no final baixo devido à gravidade. Uma amostra devidamente incorporada é mostrada em comparação com um com uma bolha de ar, que deve ser evitada por refração de interfaces ar/resina pode degradar a qualidade da imagem (Figura 2).
5. dia 5: coleção
- Colete as amostras para aquisição de imagem no final do dia 5.
Nota: A remoção do tubo de poliimida é possível mas não é necessário para a imagem latente. Imagens de micro-CT síncrotron-baseado para a amostra de zebrafish foi realizada na trajetória 2-BM no Advanced Photon Source (APS) no Argonne National Laboratory (Lemont, IL, EUA). Para PTA-manchado zebrafish, determinou-se uma gama óptima de energia de raios-x de 5-30 keV, e uma energia de raio-x de 13,8 keV foi usado para geração de imagens. 1501 projeções foram obtidas em 13,8 keV mais de 180 graus (1 projeção de todos os graus de 0,12) com uma câmera de 2048 2048-por pixel. Além disso, duas imagens de apartamento-campo (ganho) (uma no início) e outra no final da aquisição e uma imagem de campo escuro também foram adquiridos. Correções de apartamento-campo e campo escuro, redução de artefato anel e reconstrução de imagem foram feitos usando o open source TomoPy toolkit34. Amostras de Daphnia e Drosophila PTA-manchado foram fotografadas em um microscópio de raios-x12,35. Configurações específicas de micro-CT dependem do objeto e a qualidade da mancha. Por exemplo, a amostra de drosófila foi digitalizada em 40 kVp, 74 mA e 15 s em uma resolução de voxel de 3.10 × 3,10 × 3,10 µm3.
Representative Results
O protocolo descrito acima detalhes o procedimento de preparação de amostra para toda zebrafish larvas e juvenis para a imagem latente de micro-CT. Notavelmente, esse método é facilmente adaptado para outros tipos de amostras (EG., drosófila, Daphnia, Arabidopsis, órgãos de rato). Tempos de incubação em várias etapas que são apropriados para zebrafish larvas e amostras de tamanho similar; amostras maiores podem exigir mais tempo incubação. Para ajudar com a amostra incorporação passos, nós projetamos um adaptador que atribui a uma micropipeta de 1 mL e pode ser personalizado para vários tamanhos de poliimida tubulação (Figura 1). Este adaptador personalizado foi imprimido a partir de um arquivo de CAD que está associado com este manuscrito e disponível para download a partir http://publications.chenglab.com/LinEtAlJOVE/ 3D. Desde que todos os leitores podem não ter acesso a uma impressora 3D, montagem de um aparato de encastre caseiro usando pontas de micropipeta é descrita no protocolo (passo 4.3). Uma larva de zebrafish incorporado com sucesso é mostrada em comparação a amostra com uma bolha de ar (Figura 2), que provavelmente irá degradar a qualidade da imagem. Para demonstrar a versatilidade do processo de incorporação, mostramos os espécimes de vários organismos-modelo (IE., Danio, drosófila, Daphnia, embrião de rato) que passaram a (de gasoduto de preparação de amostra A Figura 3). Volumes 3D reconstruídas de espécimes de Danio, Daphniae Drosophila toda fotografadas por micro-CT são mostrados (Figura 4). Importante, como demonstrado pelo exemplo Danio , estes espécimes podem ser armazenados por um longo período de tempo e reutilizados para várias sessões de imagem (Figura 5).
Figura 1. Aparelho de incorporação. (A) um adaptador foi concebido para facilitar a incorporação usando ferramentas comuns de laboratório. (B) uma ilustração transversal do adaptador. (C) a incorporação de aparelho após a inserção do tubo de poliamida no adaptador alínea a e anexar a micropipeta no adaptador alínea c. Segmento do adaptador (b) é uma câmara de estouro, projetada para acomodar o excesso de resina e proteger a micropipeta de contaminação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Incorporado com sucesso espécimes são desprovidas de bolhas de ar. (A) um dia 3 incorporado pós fertilização (dpf) zebrafish larval sem bolha de ar. (B) um zebrafish 3 dpf incorporado com uma bolha de ar. O ar preso durante o processo de incorporação pode mover em direção a amostra se a amostra não é colocada na horizontal durante a polimerização. Barras de escala = 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Uma grande variedade de espécimes pode ser encaixada com nosso protocolo. (A) 7 dpf zebrafish larva. (B) adultos drosófila. (C) adulto Daphnia. (D) embrião de rato. Amostras maiores tais como o embrião de rato são acomodadas por algumas modificações no protocolo. Brevemente, o tubo de poliimida estava cheio até 1/3 do seu comprimento com resina e polimerizado antes da incorporação. Fixa e manchada de amostra foi colocada em cima da resina pré-polimerizada. O tubo então foi preenchido com resina não-polimerizada, seguida por uma segunda polimerização. A tubagem de poliimida foi removida antes da fotografia para permitir a melhor visualização da amostra nesta figura. A remoção do tubo não é necessária para aquisição de imagem bem sucedida por barras de escala micro-CT.: imagens de amostra, 5 mm; ampliado as inserções, 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. 3-dimensional renderizações de espécimes incorporados. (A) reconstruída 3 larva de zebrafish dpf em 0.743 × 0.743 × 0.743 µm3 resolução voxel. (B) reconstruída adulto Daphnia (3 × 3 × 3 µm3 voxel resolução). (C) reconstruída adulto drosófila (3,1 × 3,1 × 3,1 µm3 voxel resolução). Secções transversais Digitas podem ser gerados em qualquer ângulo, como mostrado na coluna da esquerda. Renderizações de superfície são mostradas à direita, processados usando o software comercial. Incorporação da resina pode ser visto em todos os exames fora a amostra (observado por *), mas não interfere com a amostra em si. A larva de zebrafish foi fotografada no Argonne National Laboratory na fonte de fótons avançada que é baseado em síncrotron. As Daphnia ou Drosophila espécimes foram fotografados com um microscópio de raios-x comercial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Incorporado com nosso protocolo de amostras podem ser re-imagens com micro-CT. A larva de zebrafish 5 dpf mesmo foi fotografada em 2011 (A) e (B) 2013, apresentada como projeções de intensidade média da vista sagital. Comparação de imagens entre as varreduras após o armazenamento mostra a preservação das características anatômicas. (C) um close-up de músculo de ambos os exames é apresentado, com as linhas segmentadas indicando regiões correspondentes utilizadas na geração de perfil de intensidade (D). Perfis de intensidade normalizadas para seus correspondentes médias ao longo de ambas as linhas mostram correspondência espacialmente picos locais em ambos os exames. (E) intensidade os valores médios para regiões selecionadas na e B pertencentes ao fundo (Bg, roxo), núcleos neuronais (N, verde), matéria branca (W, azul) e o músculo (M, laranja) estavam dividido por uma média de fundo (branco) e usado para gerar o sinal-ruído rácios (SNR), que corresponde bem entre as varreduras. Barras de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Neste manuscrito, apresentamos um protocolo detalhado para a imobilização rígida de milímetro-escala fixa e manchado de espécimes (0,5 a 2,5 mm de diâmetro) para a imagem latente de micro-CT. Dado o rápido avanço da tecnologia de micro-CT, no que se refere a resolução e velocidade, um método de preservação permanente da amostra com re-imaging capacidades é altamente desejável. Tradicionalmente, resina de encastre densa são comumente usados em microscopia electrónica para fornecer suporte estrutural para cortar seções ultra-finas e minimizar o dano ao modelo. Nosso método adaptado a sua utilização para a imobilização rígida durante a imagem latente não-destrutivos. Para minimizar os artefatos de imagem da presença do excesso de resina, implantamos o uso de tubos de poliimida transparente de raio-x para criar amostras redondas, sem arestas e para restringir o volume de resina ao redor da amostra.
Resultado ideal do procedimento de incorporação está subordinado a execução cuidadosa das várias etapas críticas e atenção à integridade da amostra durante o procedimento. Com efeito, danificar o espécime resultará em uma imagem final comprometida independentemente do sucesso da execução das imagens. Desde que a refrigeração contribui para uma diminuição das respostas de dor, e não fixado tecido degrada mais rapidamente em temperaturas mais altas, usamos reagentes previamente refrigerados. Grandes espécimes podem precisar de ser cortadas para permitir a entrada de fixador no interior da amostra, de modo que órgãos internos como fígado, pâncreas e intestino são completamente fixos. Tecidos não fixados se deteriorar e perdem a integridade estrutural, destruindo a estrutura biológica. Outro passo fundamental é manter a amostra em seu alinhamento natural. Portanto, defendemos a utilização de recipientes de fundo chato, que usamos durante todo o procedimento e são particularmente importante durante a fixação. Fixação em polipropileno tubos ou tubos cónicos que geralmente têm um fundo em forma de V devem ser evitados porque podem causar alongadas amostras de dobrar, que distorce a morfologia natural do espécime. Além disso, para minimizar o uso de resina, o diâmetro interno do tubo de poliimida é apenas ligeiramente maior que a largura da amostra. Flexão da amostra também pode resultar em danos para o espécime que entra a tubulação. Também é aconselhável transferir a amostra para o tubo de forma natural para a frente para evitar danificar extremidades. Desidratação adequada é outro passo fundamental. Isso é realizado com pequenos incrementos de aumentar as concentrações de EtOH lentamente substituir água com EtOH, que é mais miscível com a resina. Grandes aumentos na concentração de EtOH estão associados com encolhimento de tecido e podem ser amenizados por incrementos adicionais de incubação de EtOH, tornar a transição mais gradual. Finalmente, para minimizar o movimento do espécime ou bolsas de ar, se houver algum, as amostras são colocadas horizontalmente durante a polimerização da resina (final do dia 4). Bolsões de ar ou selante ao lado da amostra provoca artefatos ópticos com imagem de raio x associada com difração de borda, reduzindo a qualidade da imagem.
Com relação a possíveis modificações do protocolo, outras resinas incorporação e metal manchas podem ser usadas no lugar de acrílico branco LR e PTA, respectivamente. Embed812, uma resina de cola epoxy comumente usada em microscopia eletrônica, é altamente viscoso, mais difícil de transferir, pode causar a distorção dos espécimes e está associado com o fundo mais elevado do que as resinas acrílicas ou glicol metacrilato. Enquanto JB4 Plus, um metacrilato de glicol, é menos viscoso do que EMbed812 e tem mais baixo fundo, formação aleatória de bolsões de ar aparecem com frequência nas proximidades do espécime. Como mencionado, os bolsos de ar degradar a qualidade da imagem e são particularmente problemáticos para amostras preciosas. É interessante notar que Technovit 7100, outro metacrilato de glicol, interfere com a coloração de PTA, resultando em pobre contraste na imagem final. Comparativamente, acrílico branco LR tem água-como viscosidade, baixo fundo e não interfere com a coloração do PTA. Em nossas mãos, a taxa de sucesso de incorporação em LR branco sem bolhas de ar ou danos de amostra é superior a 95%. Por estas razões, defendemos o seu uso como a incorporação de resina para tecido micro-CT. Com relação a manchas, o resultado de metal várias manchas como tetróxido de ósmio, iodo, e PTA em micro-CT imagem tem sido comparados e discutidos em outra parte15,16,17 e está fora do escopo do presente manuscrito.
O tamanho da amostra é uma limitação importante para nosso protocolo atual. Desde que nós empregamos sucção para transferir as amostras para o tubo, a capacidade de ver o espécime é fundamental para a orientação e a garantia que é de facto na tubulação de. Como resultado, milímetro sub amostras como Tardigrada (i. e., água ursos) são extremamente difíceis de incorporar porque eles exigem o uso de um microscópio para ser visualizado. Uma vez que a sucção é aplicada, amostras microscópicas são facilmente perdidas do plano focal e tornar-se desafiante redescobrir, tornando-se difícil determinar se passaram longe demais a anexo das extremidades do tubo. Amostras maiores, tais como embriões do rato, (3-10 mm) podem ser encaixadas com pequenas modificações no protocolo de incorporação (Figura 4). Em particular, a tubagem de poliimida foi preenchida com 1/3 com resina líquida, que foi polimerizada antes da incorporação. A amostra fixa e manchada foi colocada em cima da resina pré-polimerizada. O tubo foi então totalmente preenchido com resina não-polimerizada e seguido por uma segunda polimerização.
O significado do nosso protocolo de incorporação é múltiplo. Rigidamente imobilizadas espécimes de animais ou tecido inteiro são desejáveis por razões incluindo: (1) criação de repositórios de longo prazo das amostras que são difíceis de gerar ou preparar; (2) re-aquisição de dados; (3) permitindo a série de imagens usando múltiplas modalidades de imagem; e (4) fornecendo padrões para calibração e tecnologia de desenvolvimento. Amostras preparadas com nosso procedimento de incorporação são encerradas em resina sólida, que é resistente contra danos e podem, portanto, ser facilmente armazenadas talvez indefinidamente. Armazenamento a longo prazo é particularmente útil para amostras raras ou laboriosamente geradas, tais como aqueles associados com phenome projetos. Além disso, no caso em que os dados digitais são perdidos, os dados podem ser gerados da amostra original. A capacidade de re-imagem latente durante um longo período de tempo potencialmente permite que a mesma amostra ser interrogado com mais avançadas modalidades de imagem no futuro. Uma vez que as amostras são fisicamente estáveis entre instâncias de imagens, imagens são adquiridas do mesmo espécime na mesma orientação, facilitando o registro entre conjuntos de dados anteriores e posteriores. Por exemplo, uma imagem de baixa resolução apenas pode permitir segmentação de tecidos em uma larva de peixe-zebra. A mesma larva pode mais tarde ser re-imaginada em alta resolução para que mais detalhadas análises computacionais na resolução de celular. Esta capacidade para comparação directa entre as varreduras registradas sugere amostras de resina-incorporado como um potencial padrão para desenvolvimento de tecnologia de micro-CT. Os efeitos de qualquer alteração para o método de imagem podem ser avaliados pela imagem da mesma amostra, para que todas as variáveis na etapa de preparação de amostra são controladas. Finalmente, uma amostra-padrão resina embutido pode ser usada para calibração de instrumento para testar a consistência da imagem latente.
Nosso trabalho anterior, examinando a histologia de peixes mutantes e doentes mostrou que celular resolução permite a detecção de anormalidades sutis na estrutura do tecido que são negligenciados na análise bruta usando o microscópio dissecação36, ou um baixo consumo de energia Microscópio estéreo. Queremos expandir nossas análises de alta resolução para amostras humanas. Zebrafish as larvas, que compõem o assunto principal do nosso trabalho de desenvolvimento, são semelhantes a biópsias de agulha humano na sua fragilidade, heterogeneidade do tecido celular e intercelular, tamanho (1-3 mm de diâmetro) e forma alongada. Com base em nossa extensa experiência com zebrafish e outros trabalhos mostrando aquele micro-CT com sucesso manchado e digitalizados no tecido humano, embora a baixa resolução37, esperamos que nossas abordagens para trazer valor acrescentado para geração de imagens e análise de biópsias de agulha. Que estimado que a montagem de um kit suficiente para uma preparação de até 20 amostras da mesma condição ao ser potencialmente menos de 30 USD. As amostras preparadas pelo nosso método de incorporação são resistente a danos físicos e, portanto, fácil de transportar. O baixo custo e facilidade de transporte sugerem a possibilidade de coleta de amostras de todo o mundo, particularmente áreas em que a imagem de celular resolução com micro-CT não é prontamente acessível. Nossa visão é para arquivos digitais de alta resolução de biópsias de agulha (variando de 0,1 a vários terabytes) permitem a criação de um atlas digital de tecidos humanos, e ao mesmo tempo permitir que os pesquisadores refinar e melhorar o atual encanamentos de análise para localização e caracterização quantitativa da arquitetura celular e tecidos dentro do contexto 3D cheio dos tecidos digitalizados.
Disclosures
Todos os autores declaram que não há nenhum conflito de interesses.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer Roland Myers para gentilmente fornecer os protocolos TEM originais. Além disso, gostaríamos de agradecer o Dr. John Colbourne para fornecer a amostra de Daphnia , Dr. Santhosh Girirajan para fornecer a amostra de Drosophila e Dr. Fadia Kamal para fornecer o embrião de rato. Os investigadores reconhecem o apoio financeiro de NIH (1R24OD18559-01-A2, PI: KCC), o Jake Gittlen laboratórios para pesquisa do câncer e do prêmio piloto financiamento da PSU Huck institutos de Ciências da vida e do Instituto para CyberScience.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Phosphotunstic Acid | VWR | MK282402 | |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | MS-222 | |
| LR White | Electron Microscopy Sciences | 14380 | |
| Polyimide tubing (ID 0.04") | Nordson Medical | 141-0065 | The exact polyimide tubings described in the manuscript are no longer available. A close match is provided here. Tubing with custom diameter can be manufactured upon request. |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Oil-based soft modeling clay | Sculpey | S302 001 | |
| Micropipette P200 | Gilson | F123601 | |
| Micropipette P1000 | Gilson | F123502 | |
| Glass vials | VWR | 66015-042 | |
| V-shaped basin | VWR | 89094-676 | |
| Weigh boats | VWR | 10803-148 | |
| 200 μL yellow micropipette tip | Fisher Scientific | 02-707-500 | |
| 1 mL blue micropipette tip | Fisher Scientific | 02-681-163 | |
| Tabletop shaker | Thermolyne | M71735 | |
| Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 CCD | |
| X-ray microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa |
References
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