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Bioengineering

सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी द्वारा धारा मुक्त 3 डी प्रोटोकॉल के लिए फिक्स्ड और दाग, पूरे, मिलीमीटर पैमाने पर नमूनों की कठोर embedding

Published: October 17, 2018 doi: 10.3791/58293
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 1,2,3, 1,2, 4, 5, 1,2, 1,2, 1,2
1The Jake Gittlen Laboratories for Cancer Research, Penn State College of Medicine, 2Division of Experimental Pathology, Department of Pathology, Penn State College of Medicine, 3Medical Scientist Training Program, Penn State College of Medicine, 4Center for In Vivo Microscopy, Duke University Medical Center, 5KTM Research

Summary

हम प्रोटोकॉल विकसित और मिलीमीटर पैमाने पर नमूनों की embedding सक्षम करने के लिए एक कस्टम तंत्र डिजाइन किए हैं । हम सूक्ष्म-सीटी द्वारा ऊतक वास्तुकला और कोशिका आकृति विज्ञान की पूछताछ के लिए कठोर स्थिरीकरण और नमूनों की लंबी अवधि के भंडारण को प्राप्त करने के लिए एक्रिलिक राल और polyimide टयूबिंग में embedding पर जोर देने के साथ नमूना तैयारी प्रक्रियाओं मौजूद है ।

Abstract

एक सौ से अधिक वर्षों के लिए, ऊतकों के ऊतकवैज्ञानिक अध्ययन चिकित्सा निदान के लिए सोने के मानक किया गया है क्योंकि प्रोटोकॉल हर ऊतक में सभी प्रकार के सेल की अनुमति देता है की पहचान की और विशेषता है । हमारी प्रयोगशाला सक्रिय रूप से एक्स-रे सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी (माइक्रो सीटी) है कि सेलुलर संकल्प पर पूर्ण ऊतक संस्करणों के अध्ययन के लिए प्रोटोकॉल के नैदानिक शक्ति लाएगा में तकनीकी प्रगति करने के लिए काम कर रहा है (यानी, एक एक्स-रे Histo-टोमोग्राफी मोडल) । इस अंत की ओर, हम नमूना तैयारी पाइप लाइन के लिए लक्षित सुधार किया है । एक प्रमुख अनुकूलन, और वर्तमान काम का ध्यान, निश्चित और सना हुआ मिलीमीटर पैमाने पर नमूनों की कठोर embedding के लिए एक सरल तरीका है । नमूना स्थिरीकरण और correlative माइक्रो सीटी इमेजिंग के लिए प्रकाशित तरीकों में से कई आयल मोम, agarose, या शराब के रूप में तरल पदार्थ में नमूने रखने पर निर्भर करते हैं । हमारे दृष्टिकोण कस्टम प्रक्रियाओं के साथ इस काम को बढ़ाता है और एक 3-आयामी मुद्रण योग्य उपकरण के डिजाइन के लिए सीधे polyimide टयूबिंग, जो एक्स-रे के लिए अपेक्षाकृत पारदर्शी है में एक एक्रिलिक राल में नमूने एंबेड । इस के साथ साथ, नमूना तैयारी प्रक्रियाओं ०.५ से 10 मिमी व्यास, जो पूरे zebrafish लार्वा और किशोर, या अन्य जानवरों और इसी तरह के आयामों के ऊतकों के नमूने के लिए उपयुक्त होगा के लिए नमूने के लिए वर्णित हैं । अवधारणा के सबूत के रूप में, हम ढाणियो, Drosophila, Daphnia, और एक चूहा भ्रूण से नमूनों एंबेडेड है; इन नमूनों में से तीन के लिए 3 आयामी स्कैन से प्रतिनिधि छवियों को दिखाया जाता है । महत्वपूर्ण बात, हमारी कार्यप्रणाली कठोर स्थिरीकरण सहित कई लाभों की ओर जाता है, laboriously के दीर्घकालिक संरक्षण-संसाधनों बनाया, और फिर से पूछताछ नमूनों की क्षमता ।

Introduction

Phenotypes एक जीव के अवलोकन लक्षण है कि अपनी आनुवंशिक पृष्ठभूमि और पर्यावरण के बीच अद्वितीय बातचीत के परिणामों का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । इन विशेषताओं में व्यवहार, जैव रासायनिक, रूपात्मक, विकास, और/या शारीरिक गुण शामिल हो सकते हैं । महत्वपूर्ण बात, जंगली प्रकार के जीवों और आनुवंशिक म्यूटेंट के बीच लक्षण में अंतर तंत्र और प्रभावित जीन के कार्यों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । आकृति विज्ञान के लिए सम्मान के साथ, histopathology सेलुलर स्तर पर phenotypes का आकलन करने के लिए सोने के मानक है, लेकिन यांत्रिक कलाकृतियों से ग्रस्त है और सटीक मात्रात्मक volumetric विश्लेषण1की अनुमति नहीं है. हमारी प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के नैदानिक शक्ति के आवेदन करने के लिए उपमाइक्रोन संकल्प पर पूर्ण ऊतक संस्करणों के लिए बाधाओं को दूर करने के लिए प्रेरित किया है ।

उपलब्ध प्रौद्योगिकियों के एक सर्वेक्षण से पता चलता है कि इमेजिंग द्वारा एक्स-रे माइक्रो गणना टोमोग्राफी (माइक्रो सीटी) आदर्श मिलीमीटर के लिए आवश्यक पैमाने पर पूरे पशु 3-आयामी (3 डी) प्रोटोकॉल प्रदान कर सकते हैं । माइक्रो-सीटी गैर विनाशकारी, आइसोट्रोपिक, 3 डी दृश्य और ऊतक वास्तुकला1,2के मात्रात्मक विश्लेषण का संचालन करने की क्षमता में सक्षम बनाता है । हाल के वर्षों में, दाग और धातु के 3d इमेजिंग-माइक्रो सीटी द्वारा दाग zebrafish बढ़ती कर्षण प्राप्त की है और कई ऊतकों के volumetric विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया है, मांसपेशी सहित, दांत, हड्डी, और वसा ऊतकों3,4 ,5,6,7,8,9,10. अन्य मॉडल जीवों और ऊतक नमूनों को भी माइक्रो सीटी इमेजिंग के लिए उत्तरदायी हैं. उदाहरण के लिए, एक पाइप लाइन सिंक्रोट्रॉन माइक्रो सीटी11के माध्यम से imaged माउस दिमाग के घने mesoscale neuroanatomy को बढ़ाता है के लिए शुरू किया गया है । इसी तरह, एक eosin आधारित दाग प्रोटोकॉल नरम ऊतक के लिए उपयुक्त होना दिखाया गया है माइक्रो-सीटी पूरे माउस अंगों की इमेजिंग12. unstain हुआ मानव L3 कशेरुकाओं के Morphometric विश्लेषण और चांदी से सना हुआ मानव फेफड़ों के दृश्य माइक्रो सीटी का उपयोग कर मानव नमूने13,14के लिए इस तकनीक की उपयोगिता को प्रदर्शित किया है ।

आदेश में बरकरार छोटे पशुओं और ऊतक नमूनों की पूरी रूपात्मक phenotyping के लिए माइक्रो-सीटी के महान वादा यथार्य करने के लिए, बाधा के प्रवाह के संबंध में दूर होने की जरूरत के एक नंबर, संकल्प, क्षेत्र के दृश्य, व्यापक सेल धुंधला, और दीर्घकालिक संरक्षण । हालांकि इन पहलुओं में से प्रत्येक महत्वपूर्ण है, वर्तमान पांडुलिपि का ध्यान नमूना निर्धारण और धुंधला पर अतिरिक्त नोटों के साथ, embedding प्रक्रियाओं का अनुकूलन है । भारी धातु धुंधला उपयोगी है क्योंकि माइक्रो-सीटी छवियों में विभिंन कोमल ऊतकों के बीच अंतर्निहित विपरीत कम है । इस तरह के आज़मियम tetroxide, आयोडीन, phosphotungstic एसिड (पीटीए) के रूप में विभिंन धातु दाग, की शक्ति, और gallocyanin-chromalum, माइक्रो सीटी इमेजिंग के लिए इसके विपरीत बढ़ाने के लिए15,16,17का अध्ययन किया गया है । Uranyl एसीटेट भी सूक्ष्म सीटी इमेजिंग की हड्डी और उपास्थि के लिए एक विषम एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया गया है18,19. पीटीए के रूप में हमारे प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया पूरे zebrafish नमूनों में लगभग सभी ऊतकों और कोशिकाओं के अनुरूप धुंधला हो जाता है, चित्र है कि संभावित ऊतक के पूर्ण मात्रा के माध्यम से प्रोटोकॉल की तरह अध्ययन के साथ संगत कर रहे है उपज ।

माइक्रो-सीटी छवि अधिग्रहण के दौरान, एक 2-आयामी (2d) प्रक्षेपण के रूप में नमूना लिया जाता है एक डिग्री के एक अंश से घुमाया जाता है और जब तक नमूना एक १८० ° या ३६० ° रोटेशन पूरा हो गया है, 2 डी के लिए इस्तेमाल किया अनुमानों के हजारों की एक श्रृंखला पैदा 3d वॉल्यूम20का पुनर्निर्माण । इस प्रक्रिया में, नमूना के किसी भी गड़बड़ी इसी 2d अनुमानों के कारण संरेखण से बाहर हो जाएगा, खराब 3 डी मात्रा खंगाला में जिसके परिणामस्वरूप । नमूना स्थिरीकरण इस मुद्दे के लिए सही करने के लिए एक तरीका है और कुछ मौजूदा रणनीतियों शराब में नमूना या agarose में एंबेडिंग में शामिल करने के लिए सुधार के रूप में-ट्यूब या micropipette टिप्स3,5,15, 16 , 21 , 22. तरल विसर्जन विधियों आदर्श नहीं हैं, क्योंकि छवि अधिग्रहण के दौरान नमूना आंदोलन इमेजिंग सेट के बीच हो सकता है, 3 डी की स्थानांतरित पुनर्निर्माण में जिसके परिणामस्वरूप23खंड । इसके अलावा, यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि तरल-संग्रहीत ऊतक नमूनों की शारीरिक स्थिरता के लिए महीनों के समय तराजू में गरीब है, रासायनिक अस्थिरता और सतह नमूना और कंटेनर दीवार के बीच संपर्क बिंदुओं के आंदोलन के साथ जुड़े घर्षण का एक परिणाम के रूप में ( निश्चित पशु और मानव ऊतक नमूनों के साथ व्यक्तिगत टिप्पणियों) ।

इमेजिंग के दौरान नमूना आंदोलन के लिए क्षमता को कम करने के लिए, नमूने agarose24,25,26में एंबेड किया जा सकता है, लेकिन इस अभ्यास agarose में इस प्रकार छवि को कम करने में फैलाना दाग के जोखिम के साथ जुड़ा हुआ है इसके विपरीत26. इसके अलावा, तरल या agarose तैयारी शारीरिक क्षति और समय के साथ नीचा, उंहें दीर्घकालिक नमूना भंडारण के लिए अनुपयुक्त बनाने के लिए प्रवण हैं । हम कारण है कि एक संभावित सफल और सीधा नमूना स्थिरीकरण विधि है कि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी नमूनों के लिए इस्तेमाल से अनुकूलित किया जा सकता है । ऐपण ८१२ के रूप में पॉलिमर रेजिन (बंद कर दिया और ८१२ एम्बेड द्वारा प्रतिस्थापित) सामान्यतः इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी27,28के लिए ultrathin वर्गों उत्पन्न करने के लिए आवश्यक कठोरता प्रदान करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. दरअसल, एक्स-रे इमेजिंग और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के बीच कई तुलनात्मक अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि राल में एंबेडेड नमूने एक्स-रे माइक्रोस्कोपी29,30द्वारा imaged किया जा सकता है । हालांकि, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के मानक प्रथाओं के कुछ माइक्रो सीटी इमेजिंग करने के लिए सीधे अनुवाद नहीं है । उदाहरण के लिए, ठेठ राल ब्लॉकों और उन ब्लॉकों से काट नमूनों की चुकता राल किनारों के साथ नमूनों की माइक्रो सीटी इमेजिंग एज विवर्तन कलाकृतियों है कि इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के साथ जुड़ा हुआ है । , जबकि संभव राल किनारों चिकनी, श्रमसाध्य और समय लेने वाली है ।

जबकि प्लास्टिक embedding रेजिन की एक किस्म इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में कार्यरत हैं, उच्च पृष्ठभूमि ऐसे एंबेड ८१२ के रूप में कठिन रेजिन के साथ जुड़े हमें दूसरों के परीक्षण के लिए नेतृत्व किया । हम अपने कम चिपचिपापन, कम संकोचन, कम बहुलकीकरण के दौरान बुलबुले फार्म की प्रवृत्ति के कारण LR सफेद चुना है, और कम पृष्ठभूमि । बढ़त मुक्त नमूनों बनाने के लिए, और नमूना आसपास राल की मात्रा को कम करने के लिए, हम बहुलकीकरण करने से पहले polyimide टयूबिंग में तरल राल में नमूनों को आकर्षित करने के लिए प्रोटोकॉल विकसित किया. Polyimide अपने उच्च थर्मल स्थिरता और उच्च एक्स-रे संप्रेषण के लिए चुना गया था ताकि टयूबिंग के हटाने इमेजिंग के लिए आवश्यक नहीं है । अंत में, हम मज़बूती से टयूबिंग पकड़ और micropipettes के संदूषण को रोकने के क्रम में हमारे नमूना embedding तकनीक के लिए एक कस्टम micropipette अनुकूलक बनाया. एडाप्टर 3d एक सीएडी छवि फ़ाइल से मुद्रित किया जा सकता है । एक साथ लिया, नमूना तैयारी तरीकों का लक्ष्य यहां प्रस्तुत छोटे नमूनों की embedding अधिक सरल बनाने के लिए है, बढ़ाया धुंधला इसके विपरीत, कठोर स्थिरीकरण प्राप्त करने, और बरकरार मिलीमीटर पैमाने पर नमूनों की लंबी अवधि के भंडारण ।

Protocol

जीवित पशुओं पर सभी प्रक्रियाओं पेंसिल्वेनिया राज्य विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. Day 1: निर्धारण

  1. निर्धारण में सुधार और आंत सामग्री की मात्रा को कम करने के लिए, एक 10 मिमी नमूना, या अब बड़े नमूनों के लिए के लिए कम से 24 ज के लिए किशोर मछली भूखे (जैसे, एक 14 मिमी नमूना के लिए ७२ एच) ।
  2. पूर्व चिल 10% तटस्थ बफर Formalin (NBF) और 2x Tricaine-एस (एमएस-२२२, ४०० mg/L) बर्फ पर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ।
  3. तेजी से और मानवीय इच्छामृत्यु के लिए ठंडा 2x MS-२२२ के साथ मछली पानी की मात्रा दोगुनी ।
  4. 30 एस (लार्वा) के लिए प्रतीक्षा करें ६० s (किशोर) के बाद मछली चलती बंद हो जाता है ।
  5. 10 मिनट के लिए ठंडा 10% NBF में मछली विसर्जित कर दिया ।
  6. ठंडा 10% NBF समाधान कमरे के तापमान पर फ्लैट में तली हुई कंटेनरों में रातोंरात मछली ठीक ।
    नोट: फ्लैट तली कंटेनरों नमूना के झुकने को कम करने के लिए आवश्यक हैं । निर्धारण और बाद में सभी चरणों के समाधान की मात्रा कम से 20 नमूना मात्रा जब तक अंयथा निर्दिष्ट किया जाना चाहिए । 1-5 लार्वा zebrafish के लिए, अनुशंसित समाधान वॉल्यूम कम से कम 1 मिलीलीटर है । गरीब निर्धारण में अपर्याप्त निर्धारण परिणाम, और एजेंट की मात्रा का एक अधिशेष नकारात्मक रूप से वर्णित प्रक्रिया के परिणाम को प्रभावित नहीं करता है । बड़ा मछली के पूर्ण निर्धारण के लिए, पेट गुदा ताकना करने के लिए थोड़ा पूर्वकाल शुरू । कैंची या चाकू के न्यूनतम प्रवेश का उपयोग करें और आंतरिक अंगों को नुकसान को कम करने के लिए काटने जबकि मछली से दूर कोमल बल लागू होते हैं । निर्धारण प्रोटोकॉल दूसरों के द्वारा वर्णित किया गया है31,३२,३३।

2. दिन 2: निर्जलीकरण और धुंधला

  1. 3 बार तय नमूनों को कुल्ला 1x फास्फेट में खारा (पंजाब) 10 मिनट के लिए पीएच ७.४ ।
  2. ३५% एथिल शराब (ेतोः) में नमूने कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए जलमग्न ।
    ध्यान दें: सभी कोमल आंदोलन कदम के लिए, एक तालिका के समान और एक मिश्रण प्रभाव के लिए सेट का उपयोग करें, जबकि ध्यान से bumping और कंटेनर सतहों के खिलाफ नमूना की मलाई से परहेज ।
  3. ५०% ेतोः में नमूने कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए जलमग्न ।
  4. पानी में phosphotungstic एसिड (पीटीए) पाउडर को भंग एक 1% डब्ल्यू/
  5. १००% ेतोः में 1% पीटीए शेयर समाधान 3:7 पतला एक ०.३% पीटीए धुंधला समाधान प्राप्त करने के लिए ।
  6. दाग कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर ०.३% पीटीए समाधान में रातोंरात नमूने ।

3. Day 3: घुसपैठ

  1. तैयार 1:1 v/v १००% ेतोः और LR सफेद एक्रिलिक राल और अलग सेट के मिश्रण ।
  2. कुल्ला 10 मिनट के लिए ७०% ेतोः में 3 बार ।
  3. ९०% ेतोः में नमूने कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए जलमग्न ।
  4. ९५% ेतोः में नमूने कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए जलमग्न ।
  5. दो बार कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए १००% ेतोः में नमूनों को जलमग्न ।
  6. 1:1 ेतोः और LR सफेद एक्रिलिक राल मिश्रण में नमूने कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर रातोंरात जलमग्न ।

4.4 दिन: embedding

  1. कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए १००% LR सफेद राल में नमूने जलमग्न ।
  2. ताजा १००% LR सफेद राल और कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए गर्मी के साथ ४.१ कदम में राल बदलें ।
  3. एंबेडिंग उपकरण (चित्रा 1) को इकट्ठा ।
  4. कट उपयुक्त व्यास और लंबाई के polyimide टयूबिंग ।
    नोट: एक भीतरी व्यास के साथ ट्यूबिंग कि कम से ०.१ mm नमूना के व्यास से बड़ा है की सिफारिश की है । ठेठ नमूनों के लिए, टयूबिंग के 30 मिमी की एक मानक लंबाई प्रत्येक नमूने के लिए प्रयोग किया जाता है । जब वांछित, लंबी नमूनों अब ट्यूबिंग का उपयोग करके समायोजित किया जा सकता है ।
    1. एंबेडिंग एडेप्टर के विस्तृत अंत में एक P1000 micropipette अनुलग्न करें और polyimide टयूबिंग को संकीर्ण अंत (चित्र 1C) में डालें । यदि एंबेडिंग एडेप्टर उपलब्ध नहीं है, तो चरण 4.3.3 पर जाएं । अंयथा, चरण ४.४ के लिए जारी रखें ।
    2. एक micropipette टिप के अंत में ऐसी है कि polyimide टयूबिंग आराम से फिट बैठता है भर में सीधे क्लिप । ०.०४०३ "टयूबिंग के लिए एक २०० µ एल पीला micropipette टिप के व्यापक अंत से ४४ mm में कट और ५९ mm ०.१०५" टयूबिंग के लिए 1 मिलीलीटर नीले टिप के नीचे से । आवश्यकतानुसार ट्रिम कर दीजिए.
    3. कट micropipette टिप को एक micropipette में अटैच करें ।
  5. एक छोटे से वजन नाव या वी के आकार का समाधान बेसिन के लिए नमूनों स्थानांतरण और पूरी तरह से १००% LR सफेद राल में नमूनों को जलमग्न ।
  6. ४.३ कदम से embedding उपकरण के साथ, तय नमूना के व्यापक अंत में टयूबिंग उद्देश्य (या पशु नमूनों के मामले में सिर की ओर) और पिपेट धीरे टयूबिंग में नमूना । टयूबिंग के बीच में नमूना स्थिति और ऊपर और नीचे नमूना ट्यूब सुनिश्चित राल से भर जाता है ।
    1. पिपेट टयूबिंग में नमूना है कि नमूना प्राकृतिक, आगे दिशा में बढ़ रहा है ।
      नोट: धीमी गति से pipetting हवा बुलबुले और नमूना ट्यूबिंग एज के खिलाफ घर्षण की वजह से नुकसान से बचा जाता है । टयूबिंग में पिछड़े आंदोलन आसानी से उग्रवाद (अंग, पंख, पंख, आदि) को नुकसान पहुंचा सकते हैं । यह embedding उपकरण में कुछ राल ओवरफ़्लो की अनुमति देने के लिए सिफारिश की है कि, बाद में, हवा को हटाने के दौरान ट्यूबिंग दर्ज नहीं है ।
  7. तुरंत तेल आधारित नरम मॉडलिंग क्ले के साथ खुले अंत सील ।
    1. एक 1 मिमी मोटी चादर में मिट्टी समतल ।
    2. सूचकांक और मध्यम उंगलियों के बीच टयूबिंग स्थिर ।
    3. धीरे अंगूठे के साथ टयूबिंग के अंत के खिलाफ मिट्टी प्रेस ।
    4. अतिरिक्त क्ले निकालें ।
  8. micropipette से एंबेडिंग उपकरण निकालें ।
  9. कोमल रोटेशन से टयूबिंग बाहर खींचो और मिट्टी के साथ दूसरे छोर सील ।
    1. सील अंत के खिलाफ एक उंगली पकड़ो मिट्टी के इंजेक्शन को रोकने के लिए ।
    2. धीरे से मिट्टी में ट्यूबिंग के सील अंत धक्का ।
  10. टयूबिंग क्षैतिज प्लेस और ६५ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए राल polymerize ।
    नोट: क्षैतिज प्लेसमेंट बहुलकीकरण के दौरान नमूना आंदोलन से बचा जाता है । यदि हवा की एक छोटी राशि के चरण ४.८ में फंस गया था, हवा बुलबुला के साथ अंत थोड़ा उठाया जा सकता है नमूना की ओर हवा बुलबुला आंदोलन को रोकने के लिए । महत्वपूर्ण बात, बहुलकीकरण के दौरान बहुत अधिक पदोंनति के कारण कम गुरुत्वाकर्षण के कारण अंत की ओर गिर करने के लिए नमूना हो सकता है । एक ठीक से एंबेडेड नमूना एक हवा बुलबुला है, जो से बचना चाहिए क्योंकि हवा से अपवर्तन/छवि गुणवत्ता (चित्रा 2) नीचा कर सकते है के साथ एक की तुलना में दिखाया गया है ।

5. Day 5: कलेक् टर

  1. 5 दिन के अंत में छवि अधिग्रहण के लिए नमूने ले लीजिए ।
    नोट: polyimide टयूबिंग के हटाने संभव है, लेकिन इमेजिंग के लिए आवश्यक नहीं है । zebrafish नमूना के लिए सिंक्रोट्रॉन आधारित माइक्रो-सीटी इमेजिंग Argonne राष्ट्रीय प्रयोगशाला (Lemont, आईएल, यूएसए) में एडवांस्ड फोटॉन सोर्स (एपीएस) में Beamline 2-बीएम पर प्रदर्शन किया गया । पीटीए के लिए सना हुआ zebrafish, एक इष्टतम एक्स-रे ऊर्जा रेंज के 5-30 कीव निर्धारित किया गया था, और एक एक्स-रे ऊर्जा की १३.८ कीव इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था. १५०१ अनुमानों में प्राप्त किए गए १३.८ कीव पर १८० डिग्री (1 प्रक्षेपण हर ०.१२ डिग्री) के साथ एक २०४८-by-२०४८ पिक्सेल कैमरा । इसके अतिरिक्त, दो फ्लैट क्षेत्र (लाभ) छवियों (शुरुआत में एक और अधिग्रहण के अंत में एक) और एक काले क्षेत्र की छवि भी प्राप्त कर लिया गया । फ्लैट क्षेत्र और अंधेरे क्षेत्र में सुधार, अंगूठी विरूपण साक्ष्य में कमी, और छवि पुनर्निर्माण खुला स्रोत TomoPy toolkit३४का उपयोग किया गया । पीटीए-सना Daphnia और Drosophila नमूने एक एक्स-रे माइक्रोस्कोप12,३५पर imaged थे । विशिष्ट माइक्रो-सीटी सेटिंग्स वस्तु और दाग की गुणवत्ता पर निर्भर हैं । उदाहरण के लिए, Drosophila नमूना ४० kVp, ७४ mA पर स्कैन किया गया था, और 15 एस ३.१० × ३.१० × ३.१० µm3के एक voxel संकल्प पर ।

Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल पूरी zebrafish लार्वा और माइक्रो सीटी इमेजिंग के लिए किशोरों के लिए नमूना तैयारी प्रक्रिया का विवरण । विशेष रूप से, इस विधि आसानी से अंय नमूनों प्रकार (जैसे, Drosophila, Daphnia, Arabidopsis, माउस अंगों) के लिए अनुकूलित है । विभिन्न चरणों में मशीन समय zebrafish लार्वा और समान आकार के नमूनों के लिए उपयुक्त हैं; बड़े नमूनों अब गर्मी की आवश्यकता हो सकती है । नमूना एंबेडिंग चरणों के साथ सहायता करने के लिए, हम एक एडाप्टर है कि एक 1 मिलीलीटर micropipette के लिए देता है डिजाइन, और polyimide टयूबिंग (चित्रा 1) के विभिंन आकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इस कस्टम एडेप्टर 3 डी एक सीएडी फ़ाइल है कि इस पांडुलिपि के साथ जुड़ा हुआ है और http://publications.chenglab.com/LinEtAlJOVE/से डाउनलोड के लिए उपलब्ध से मुद्रित किया गया । के बाद से सभी पाठकों को एक 3 डी प्रिंटर के लिए उपयोग नहीं हो सकता है, एक घर का बना एंबेडिंग उपकरण micropipette युक्तियों का उपयोग की विधानसभा प्रोटोकॉल में वर्णित है (चरण ४.३) । एक सफलतापूर्वक एंबेडेड zebrafish लार्वा एक हवा बुलबुला (चित्रा 2) है, जो की संभावना छवि गुणवत्ता नीचा होगा के साथ एक नमूना की तुलना में दिखाया गया है । को एंबेडिंग प्रक्रिया के बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन, हम विभिंन मॉडल जीवों (यानी, ढाणियो, Drosophila, Daphnia, माउस भ्रूण) है कि नमूना तैयारी पाइपलाइन के माध्यम से चले गए है से नमूनों को दिखाने ( चित्रा 3) । पूरे ढाणियो, Daphnia, और सूक्ष्म सीटी द्वारा imaged Drosophila नमूनों की 3 डी मात्रा को खंगाला (चित्रा 4) दिखाया गया है । महत्वपूर्ण बात, के रूप में ढाणियो नमूना द्वारा प्रदर्शित, इन नमूनों समय की एक विस्तारित अवधि के लिए संग्रहीत किया जा सकता है और कई इमेजिंग सत्र (चित्रा 5) के लिए reused ।

Figure 1
चित्र 1. उपकरण एंबेडिंग । (A) एक एडेप्टर एंबेडिंग सामांय प्रयोगशाला उपकरण का उपयोग करने की सुविधा के लिए डिज़ाइन किया गया था । (B) एडेप्टर का एक क्रॉस-अनुभागीय चित्रण. (ग) एडेप्टर बिंदु पर polyimide टयूबिंग की प्रविष्टि के बाद embedding उपकरण (a) और micropipette एडेप्टर बिंदु (c) पर अनुलग्न करें । एडाप्टर खंड (ख) एक ओवरफ्लो करने के लिए अतिरिक्त राल को समायोजित और संदूषण से micropipette की रक्षा के लिए डिज़ाइन चैंबर है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. सफलतापूर्वक एंबेडेड नमूनों हवा बुलबुले से रहित हैं । (क) एक एंबेडेड 3 दिन के बाद निषेचन (dpf) लार्वा zebrafish बिना हवा बुलबुला । (ख) एक हवाई बुलबुले के साथ एक एंबेडेड 3 dpf zebrafish । एंबेडिंग प्रक्रिया के दौरान फंसे हवा नमूना की ओर स्थानांतरित कर सकते है यदि नमूने क्षैतिज बहुलकीकरण के दौरान नहीं रखा है । स्केल पट्टियां = 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3. नमूनों की एक विस्तृत विविधता हमारे प्रोटोकॉल के साथ एंबेड किया जा सकता है । (क) ७ dpf zebrafish लार्वा. (ख) प्रौढ Drosophila। (ग) प्रौढ़ Daphnia। (घ) चूहा भ्रूण. इस तरह के माउस भ्रूण के रूप में बड़े नमूनों प्रोटोकॉल के लिए कुछ संशोधनों द्वारा समायोजित कर रहे हैं । संक्षेप में, polyimide ट्यूबिंग राल और embedding से पहले पॉलिमर के साथ अपनी लंबाई के 1/3 के लिए भर गया था । फिक्स्ड और दाग नमूना पूर्व पॉलिमर राल के शीर्ष पर रखा गया था । टयूबिंग तो संयुक्त राष्ट्र के साथ भरा था-बहुलक एक दूसरे बहुलकीकरण द्वारा पीछा राल । polyimide टयूबिंग फोटोग्राफी से पहले हटा दिया गया था इस आंकड़े में नमूने के बेहतर दृश्य की अनुमति । टयूबिंग के हटाने के लिए आवश्यक नहीं है माइक्रो सीटी द्वारा सफल छवि अधिग्रहण के लिए । स्केल सलाखों: नमूना छवियां, 5 मिमी; बढ़े हुए presets, 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4 .3-एंबेडेड नमूनों की आयामी renderings । (क) ०.७४३ × ०.७४३ × ०.७४३ µm3 voxel संकल्प में 3 dpf zebrafish लार्वा को खंगाला । (ख) (३ × ३ × ३ µm३ voxel संकल्प) वयस्क Daphnia को खंगाला. (ग) ने प्रौढ़ Drosophila (३.१ × ३.१ × ३.१ µm3 voxel संकल्प) को खंगाला । डिजिटल क्रॉस-अनुभागों को बाएँ स्तंभ पर दिखाए गए अनुसार किसी भी कोण पर जेनरेट किया जा सकता है. सतह renderings सही पर दिखाए जाते हैं, वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदान की । राल embedding नमूने के बाहर सभी स्कैन में देखा जा सकता है (* द्वारा नोट), लेकिन नमूना ही हस्तक्षेप नहीं करता है । zebrafish लार्वा Argonne राष्ट्रीय प्रयोगशाला में उंनत फोटॉन स्रोत है कि सिंक्रोट्रॉन आधारित है पर छवि थी । Daphnia या Drosophila नमूनों एक वाणिज्यिक एक्स-रे माइक्रोस्कोप के साथ छवि थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. हमारे प्रोटोकॉल के साथ एंबेडेड नमूनों फिर से किया जा सकता है माइक्रो सीटी के साथ छवि । एक ही 5 dpf zebrafish लार्वा (A) २०११ और (B) २०१३, sagittal दृश्य के औसत तीव्रता अनुमानों के रूप में प्रस्तुत में imaged था । भंडारण के बाद स्कैन के बीच छवि तुलना संरचनात्मक सुविधाओं के संरक्षण से पता चलता है । (ग) दोनों स्कैन से पेशी के करीब-ऊपर प्रस्तुत किया जाता है, के साथ विभाजित लाइनों का संकेत इसी क्षेत्रों के लिए इस्तेमाल किया (डी) तीव्रता प्रोफ़ाइल पीढ़ी. तीव्रता दोनों लाइनों के साथ उनके इसी औसत को सामान्यीकृत प्रोफाइल स्थानिक दोनों स्कैन में स्थानीय चोटियों मिलान दिखा । (ङ) A और B में चयनित क्षेत्रों के लिए औसत तीव्रता मान पृष्ठभूमि से संबंधित (Bg, बैंगनी), न्यूरॉन नाभिक (एन, ग्रीन), सफेद बात (डब्ल्यू, ब्लू), और मांसपेशी (एम, ऑरेंज) पृष्ठभूमि के लिए एक औसत से विभाजित किया गया था (सफेद) और संकेत करने के लिए शोर उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल अनुपात (SNR), जो स्कैन के बीच अच्छी तरह से मेल खाती है । स्केल बार्स = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस पांडुलिपि में, हम सूक्ष्म सीटी इमेजिंग के लिए फिक्स्ड और सना हुआ मिलीमीटर पैमाने पर (०.५ २.५ mm व्यास) नमूनों के कठोर स्थिरीकरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । संकल्प और गति के संबंध में माइक्रो-सीटी प्रौद्योगिकी के तेजी से अग्रिम को देखते हुए, पुनः इमेजिंग क्षमताओं के साथ स्थायी नमूना संरक्षण की एक विधि अत्यधिक वांछनीय है. परंपरागत रूप से, घने embedding राल सामांयतः इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में प्रयोग किया जाता है ultrathin वर्गों में कटौती और नमूना को नुकसान को कम करने के लिए संरचनात्मक समर्थन प्रदान करते हैं । हमारे विधि गैर विनाशकारी इमेजिंग के दौरान कठोर स्थिरीकरण के लिए इसके उपयोग को अनुकूलित । अधिक राल की उपस्थिति से इमेजिंग कलाकृतियों को कम करने के लिए, हम एक्स-रे पारदर्शी polyimide टयूबिंग का उपयोग लागू किया है किनारों के बिना गोल नमूने बनाने के लिए, और नमूने के आसपास राल की मात्रा को सीमित करने के लिए ।

एंबेडिंग प्रक्रिया के इष्टतम परिणाम कई महत्वपूर्ण कदम और प्रक्रिया भर में नमूना अखंडता के लिए ध्यान के सावधान निष्पादन पर आकस्मिक है । दरअसल, नमूना हानिकारक एक समझौता अंतिम छवि में परिणाम होगा चाहे इमेजिंग के निष्पादन की सफलता की । द्रुतशीतन के बाद से दर्द प्रतिक्रियाओं के एक diminution के लिए योगदान देता है, और स्थिर ऊतक उच्च तापमान पर और अधिक तेजी से नीचा, हम पूर्व ठंडा रिएजेंट का उपयोग करें । बड़े नमूनों के लिए नमूने के अंदर में निर्धारण के प्रवेश की अनुमति इतनी कटौती की आवश्यकता हो सकती है कि जिगर के रूप में आंतरिक अंगों, अग्ंयाशय, और आंत पूरी तरह से तय कर रहे हैं । स्थिर ऊतकों खराब और संरचनात्मक अखंडता खो, जैविक संरचना को नष्ट करने । एक अंय महत्वपूर्ण कदम के लिए अपनी प्राकृतिक संरेखण में नमूना बनाए रखने के लिए है । इसलिए, हम फ्लैट तली कंटेनरों, जो हम प्रक्रिया भर में उपयोग करते है और निर्धारण के दौरान विशेष रूप से महत्वपूर्ण है के उपयोग के लिए वकील । के रूप में वे लम्बा नमूने जो नमूना की प्राकृतिक आकृति विकृतियों मोड़ करने के लिए कारण हो सकता है कि आम तौर पर एक वी के आकार का नीचे है, या शंकु ट्यूब में निर्धारण से बचना चाहिए । इसके अलावा, राल के उपयोग को कम करने के लिए, polyimide टयूबिंग के भीतरी व्यास केवल थोड़ा नमूना की चौड़ाई से भी बड़ा है । नमूना के झुकने भी नमूना को नुकसान में परिणाम के रूप में यह ट्यूबिंग में प्रवेश कर सकते हैं । यह भी एक प्राकृतिक आगे तरीके से टयूबिंग में नमूना हस्तांतरण करने के लिए हानिकारक उग्रवाद से बचने की सिफारिश की है । उचित निर्जलीकरण एक और महत्वपूर्ण कदम है । इस ेतोः सांद्रता बढ़ाने के छोटे वेतन वृद्धि के साथ पूरा करने धीरे ेतोः, जो राल के साथ और अधिक मिश्रणीय है के साथ पानी की जगह है । ेतोः एकाग्रता में बड़ी वृद्धि ऊतक संकोचन के साथ जुड़े रहे है और संक्रमण और अधिक क्रमिक बनाने के लिए ेतोः मशीन के अतिरिक्त वेतन वृद्धि द्वारा उन्नत किया जा सकता है । अंत में, नमूना या हवा जेब के आंदोलन को कम करने के लिए, अगर कोई कर रहे हैं, नमूने क्षैतिज राल बहुलकीकरण के दौरान (4 दिन के अंत) रखा जाता है । हवा की जेब या सीलेंट नमूना के बगल में एक्स-रे इमेजिंग एज विवर्तन के साथ जुड़े, छवि गुणवत्ता को कम करने के साथ ऑप्टिकल कलाकृतियों का कारण बनता है ।

प्रोटोकॉल के लिए संभव संशोधनों के संबंध में, अंय embedding रेजिन और धातु दाग LR सफेद एक्रिलिक और पीटीए, क्रमशः के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता है । Embed812, एक epoxy आमतौर पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में इस्तेमाल किया, अत्यधिक चिपचिपा है, और अधिक हस्तांतरण के लिए मुश्किल है, नमूनों की विकृति का कारण हो सकता है, और एक्रिलिक या ग्लाइकोल methacrylate रेजिन से उच्च पृष्ठभूमि के साथ जुड़ा हुआ है । जबकि JB4 प्लस, एक ग्लाइकोल methacrylate, EMbed812 की तुलना में कम चिपचिपा है और कम पृष्ठभूमि है, हवा जेब के यादृच्छिक गठन अक्सर नमूना के आसपास के क्षेत्र में दिखाई देते हैं । के रूप में उल्लेख किया है, हवा जेब छवि गुणवत्ता नीचा और कीमती नमूनों के लिए विशेष रूप से समस्याग्रस्त हैं । यह ध्यान देने योग्य बात है कि Technovit ७१००, एक और ग्लाइकोल methacrylate, पीटीए धुंधला, अंतिम छवि में गरीब विपरीत में जिसके परिणामस्वरूप के साथ हस्तक्षेप लायक है । तुलनात्मक रूप से, LR सफेद एक्रिलिक पानी की तरह चिपचिपापन, कम पृष्ठभूमि है, और पीटीए धुंधला के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है । हमारे हाथ में, LR सफेद में नमूना क्षति या हवा के बुलबुले के बिना embedding की सफलता की दर ९५% से अधिक है । इन कारणों के लिए, हम ऊतक माइक्रो के लिए embedding राल के रूप में इसके उपयोग की वकालत सीटी । दाग के संबंध में, इस तरह के आज़मियम tetroxide, आयोडीन के रूप में विभिंन धातु के दाग के परिणाम, और माइक्रो सीटी इमेजिंग में पीटीए की तुलना में किया गया है और कहीं चर्चा15,16,17 और इस के दायरे से बाहर है पांडुलिपि.

नमूना आकार हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए एक प्रमुख सीमा है । जब से हम को टयूबिंग में नमूनों हस्तांतरण को रोजगार, नमूना देखने की क्षमता उंमुखीकरण के लिए महत्वपूर्ण है और यह सुनिश्चित करना है कि यह टयूबिंग में वास्तव में है । एक परिणाम के रूप में, Tardigrade (यानी, पानी भालू) के रूप में उप मिलीमीटर नमूने बहुत मुश्किल से एंबेड क्योंकि वे एक खुर्दबीन का उपयोग की आवश्यकता को visualized हो रहे हैं । एक बार सक्शन लागू किया जाता है, सूक्ष्म नमूनों आसानी से फोकल विमान से खो रहे हैं और फिर से खोज करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो, यह मुश्किल है कि वे बहुत दूर टयूबिंग के संलग्न अंत के माध्यम से पारित निर्धारित करने के लिए बना रही है । बड़े नमूनों, जैसे माउस भ्रूण, (3-10 mm) embedding प्रोटोकॉल (चित्रा 4d) के लिए मामूली संशोधनों के साथ एंबेड किया जा सकता है । विशेष रूप से, polyimide टयूबिंग तरल राल, जो embedding से पहले पॉलिमर था के साथ 1/3 के लिए भर गया था । फिक्स्ड और दाग नमूना पूर्व पॉलिमर राल के शीर्ष पर रखा गया था । टयूबिंग तो पूरी तरह से संयुक्त राष्ट्र के साथ भरा था-बहुलक राल और एक दूसरे बहुलकीकरण द्वारा पीछा किया ।

हमारे एंबेडिंग प्रोटोकॉल का महत्व कई गुना है । कठोर मैटीरियल पूरे जानवर या ऊतक नमूनों सहित कारणों के लिए वांछनीय हैं: (1) नमूने है कि उत्पंन या तैयार करने के लिए मुश्किल कर रहे है की लंबी अवधि के खजाने बनाना; (2) डेटा का पुनः अधिग्रहण; (3) एकाधिक इमेजिंग मोडलों का उपयोग कर धारावाहिक इमेजिंग सक्षम करना; और (4) अंशांकन और प्रौद्योगिकी विकास के लिए मानक प्रदान करना । हमारे embedding प्रक्रिया के साथ तैयार नमूनों में ठोस राल है कि क्षति के खिलाफ लचीला है और इसलिए आसानी से शायद अनिश्चित काल के लिए संग्रहीत किया जा सकता है । लंबी अवधि के भंडारण phenome परियोजनाओं के साथ जुड़े लोगों के रूप में दुर्लभ या laboriously उत्पन्न नमूनों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. इसके अलावा, घटना में है कि डिजिटल डेटा खो रहे हैं, डेटा मूल नमूना से उत्पंन किया जा सकता है । समय की एक लंबी अवधि में पुन: इमेजिंग की क्षमता संभावित एक ही नमूना भविष्य में और अधिक उन्नत इमेजिंग मोडल के साथ पूछताछ करने के लिए अनुमति देता है. चूंकि नमूनों इमेजिंग उदाहरणों के बीच शारीरिक रूप से स्थिर हैं, छवियों को एक ही अभिविंयास में एक ही नमूना से प्राप्त कर रहे हैं, पहले और बाद में डेटा सेट के बीच पंजीकरण की सुविधा । उदाहरण के लिए, एक कम संकल्प छवि केवल एक zebrafish लार्वा में ऊतकों के विभाजन की अनुमति हो सकती है । एक ही लार्वा बाद में उच्च-रिज़ॉल्यूशन पर पुन: imaged हो सकता है ताकि सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर अधिक विस्तृत गणनात्मक विश्लेषण किया जा सके । पंजीकृत स्कैन के बीच सीधी तुलना के लिए यह क्षमता माइक्रो सीटी के प्रौद्योगिकी विकास के लिए एक संभावित मानक के रूप में राल-एंबेडेड नमूनों का पता चलता है । सभी चर नमूना तैयारी चरण में नियंत्रित होते हैं ताकि इमेजिंग विधि करने के लिए किसी भी परिवर्तन का प्रभाव एक ही नमूने की इमेजिंग द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । अंत में, एक राल-एंबेडेड मानक नमूना यंत्र अंशांकन इमेजिंग की निरंतरता के लिए परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

हमारे पिछले काम उत्परिवर्ती और रोगग्रस्त मछली प्रोटोकॉल का परीक्षण करने से पता चला कि सेलुलर संकल्प ऊतक संरचना है कि सकल परीक्षा में अनदेखी कर रहे है में सूक्ष्म विषमताओं का पता लगाने की अनुमति देता है विदारक माइक्रोस्कोप३६, या एक कम शक्ति का उपयोग स्टीरियो माइक्रोस्कोप । हम मानव नमूनों के लिए हमारे उच्च संकल्प विश्लेषण का विस्तार करना चाहते हैं । Zebrafish लार्वा, जो हमारे विकास कार्य के प्राथमिक विषय शामिल हैं, उनकी कमजोरी, सेलुलर और सेलुलर ऊतक विविधता, आकार (1-3 मिमी व्यास), और लंबी आकार में मानव सुई बायोप्सी के समान हैं । zebrafish के साथ हमारे व्यापक अनुभव के आधार पर, और अंय दिखा रहा है कि माइक्रो-सीटी सफलतापूर्वक सना हुआ है और मानव ऊतक स्कैन, हालांकि कम संकल्प३७पर, हम अपने दृष्टिकोण इमेजिंग और सुई बायोप्सी के विश्लेषण के लिए मूल्य जोड़ा लाने की उंमीद है । हमने अनुमान लगाया है कि एक किट के विधानसभा एक ही शर्त के 20 नमूनों के लिए पर्याप्त से कम 30 अमरीकी डालर होने की तैयारी के लिए । हमारे embedding विधि द्वारा तैयार नमूनों शारीरिक क्षति के लिए प्रतिरोधी रहे है और इसलिए परिवहन के लिए आसान है । कम लागत और परिवहन की आसानी दुनिया भर से नमूनों के संग्रह की संभावना का सुझाव, विशेष रूप से क्षेत्रों में माइक्रो सीटी के साथ सेलुलर संकल्प इमेजिंग आसानी से सुलभ नहीं है. हमारी दृष्टि सुई बायोप्सी के उच्च संकल्प डिजिटल फ़ाइलों के लिए है (०.१ से कई टेराबाइट्स से लेकर) मानव ऊतकों के एक डिजिटल एटलस के निर्माण को सक्षम करने के लिए, और एक ही समय में शोधकर्ताओं को परिष्कृत करने के लिए और वर्तमान विश्लेषण पाइपलाइन को बढ़ाने के लिए अनुमति स्थानीयकरण और सेलुलर और ऊतक स्थापत्य कला का पूर्ण 3 डी संदर्भ में ऊतकों को स्कैन के भीतर मात्रात्मक लक्षण वर्णन ।

Disclosures

सभी लेखक यह घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक कृपया मूल उनि प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए रोलाण्ड मायर्स शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इसके अलावा, हम Daphnia नमूना प्रदान करने के लिए डॉ जॉन Colbourne शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, डॉ संतोश Girirajan Drosophila नमूना प्रदान करने के लिए, और डॉ फाडिया कमल माउस भ्रूण प्रदान करने के लिए । जांचकर्ताओं NIH (1R24OD18559-01-A2, PI: केसीसी), कैंसर अनुसंधान के लिए जेक Gittlen प्रयोगशालाओं, और जीवन विज्ञान के पीएसयू Huck संस्थानों से पायलट पुरस्कार अनुदान से और CyberScience के लिए संस्थान से धन समर्थन स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X Neutral buffered formalin Fisher Scientific SF100-4
Phosphotunstic Acid VWR MK282402
Tricaine-S (MS-222) Western Chemical MS-222
LR White Electron Microscopy Sciences 14380
Polyimide tubing (ID 0.04") Nordson Medical 141-0065 The exact polyimide tubings described in the manuscript are no longer available. A close match is provided here. Tubing with custom diameter can be manufactured upon request.
Ethyl Alcohol 200 Proof Pharmco-Aaper 111000200
Oil-based soft modeling clay Sculpey S302 001
Micropipette P200 Gilson F123601
Micropipette P1000 Gilson F123502
Glass vials VWR 66015-042
V-shaped basin VWR 89094-676
Weigh boats VWR 10803-148
200 μL yellow micropipette tip Fisher Scientific 02-707-500
1 mL blue micropipette tip Fisher Scientific 02-681-163
Tabletop shaker Thermolyne M71735
Camera Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD
X-ray microscope Zeiss Xradia 520 Versa

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सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी द्वारा धारा मुक्त 3 डी प्रोटोकॉल के लिए फिक्स्ड और दाग, पूरे, मिलीमीटर पैमाने पर नमूनों की कठोर embedding
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Lin, A. Y., Ding, Y., Vanselow, D. J., Katz, S. R., Yakovlev, M. A., Clark, D. P., Mandrell, D., Copper, J. E., van Rossum, D. B., Cheng, K. C. Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography. J. Vis. Exp. (140), e58293, doi:10.3791/58293 (2018).

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