Summary
אנחנו פיתח פרוטוקולים ועוצב מנגנון מותאם אישית כדי לאפשר הטבעה של מילימטר-סולם דגימות. אנו מציגים מדגם הכנת נהלים תוך שימת דגש על הטמעת שרף אקרילי, פוליאימיד אבובים להשיג הנייח נוקשה, אחסון לטווח ארוך של דגימות לחקירה הרקמה תא ואדריכלות מורפולוגיה של מיקרו-טי
Abstract
במשך יותר ממאה שנים, המחקר היסטולוגית של רקמות כבר תקן זהב עבור אבחון רפואי כי היסטולוגיה מאפשר כל סוגי תאים ברקמת כל להיות מזוהה, מאופיין. המעבדה שלנו פועלת באופן פעיל כדי להפוך ההתקדמות הטכנולוגית רנטגן שחושב מיקרו טומוגרפיה (מיקרו-CT זה יביא את הכוח אבחון של היסטולוגיה במחקר של אמצעי אחסון רקמות מלאה ברזולוציה הסלולר) (כלומר., רנטגן מודאליות Histo-tomography). לצורך כך עשינו שיפורים יישוב הצינור הכנת המדגם. אופטימיזציה מפתח אחד, המוקד של העבודה הנוכחית, היא שיטה פשוטה להטבעת נוקשה של דגימות מילימטר-סולם קבוע ומוכתמים. רבים מן השיטות שפורסמו עבור מדגם הנייח והדמיה מיקרו-CT correlative להסתמך על הצבת הדגימות פרפין, agarose או נוזלים כגון אלכוהול. הגישה שלנו מרחיב זה לעבוד עם שגרות מותאמות אישית ובעיצוב של מנגנון להדפסה תלת-ממדי כדי להטביע את הדגימות בתוך שרף אקרילי ישירות לתוך פוליאימיד אבובים, אשר יחסית שקופה לרנטגן. במסמך זה, דוגמת הכנת נהלים מתוארים הדגימות מ- 0.5 עד 10 מ מ קוטר, אשר יהיה מתאים דג זברה כל הזחלים של קטינים, או אחרים בעלי חיים, דגימות רקמה של ממדים דומים. כמו הוכחת הרעיון, אנחנו שהטבעת דגימות רזבורה, דרוזופילה, דפניה, העובר על העכבר; נציג תמונות סריקות תלת-ממדי של שלוש הדוגמאות הללו מוצגים. חשוב לציין, המתודולוגיה שלנו מוביל יתרונות רבים לרבות הנייח נוקשה, שימור לטווח ארוך של משאבים שנוצר בעמל רב וכן היכולת לחקור מחדש את דגימות.
Introduction
פנוטיפים הן תכונות הנצפה של אורגניזם המייצגים את ההשלכות של אינטראקציות ייחודי בין הרקע הגנטי שלו לסביבה. מאפיינים אלה יכולים לכלול מאפיינים התנהגותיים, הביוכימי, מורפולוגיים, התפתחותית, ו/או פיזיולוגית. חשוב, הבדלים בין התכונות בין אורגניזמים פראי-סוג מוטציות גנטיות יכול לספק תובנה מפתח מנגנוני והפונקציות של גנים המושפעת. לגבי מורפולוגיה, histopathology הוא תקן זהב להערכת פנוטיפים ברמה התאית אבל סובל חפצים מכני, אינה מאפשרת ניתוח מדויק volumetric כמותי1. מעבדה שלנו הוא מוטיבציה כדי להתגבר על חסמי היישום של הכוח אבחון של היסטולוגיה לאמצעי אחסון של רקמות מלאה ברזולוציה כחיוניים.
סקר של טכנולוגיות זמינות מרמז כי הדמיה על ידי צילום רנטגן מיקרו-שחושב טומוגרפיה (מיקרו-CT) עשוי לספק יכולות אידיאלי לצורך מילימטר בקנה מידה כל-בעלי חיים תלת-ממדי (3D) היסטולוגיה. מיקרו-CT מאפשר הרסניות, איזוטרופיות, 3D להדמיה ואת היכולת לערוך ניתוח כמותי של רקמות-אדריכלות-1,-2. בשנים האחרונות, הדמיה תלת-ממדית של דג זברה וללא רבב, מוכתם מתכת על ידי מיקרו-CT צברה המתיחה הולך וגדל, יש נעזרו volumetric ניתוח של מספר רקמות, כולל שריר, שיניים, עצמות, רקמות adipose3,4 ,5,6,7,8,9,10. מודל אורגניזמים אחרים, דגימות רקמה נתונות גם מיקרו-CT הדמיה. למשל, כבר הציג קו צינור לכימות תנועת נוירואנטומיה mesoscale צפופה של מוח העכבר עם תמונה באמצעות מיקרו-CT סינכרוטרון11. באופן דומה, פרוטוקול מכתימים מבוסס-אאוזין הוכח להיות מתאים רקמות רכות מיקרו-CT הדמיה של העכבר כל האיברים12. ניתוח Morphometric של חוליות L3 אנושית וללא רבב והדמיה של ריאות האדם שהוכתמו כסף באמצעות מיקרו-CT הראו התועלת של טכנולוגיה זו עבור האדם דגימות13,14.
על מנת לממש את ההבטחה הגדולה של מיקרו-CT עבור מלאה מורפולוגיים phenotyping של חיות קטנות ללא פגע, דגימות רקמה, מספר משוכות צריך להתגבר ביחס תפוקה, רזולוציה, שדה-of-view, מקיף תא מכתים, שימור לטווח ארוך. בעוד כל אחד מהיבטים אלה היא חשובה ביותר, המוקד בכתב היד הוא אופטימיזציה של נהלים ההטבעה, הערות נוספות על קיבוע הדגימה, מכתים. צביעת מתכות כבדות שימושית בגלל הניגוד הטבועה בין רקמות רכות שונות בתמונות מיקרו-CT הוא נמוך. כתמי בעצמת מתכת שונים, כגון אוסמיום ארבע-חמצני, יוד, חומצה phosphotungstic (PTA) ו- gallocyanin-chromalum, כדי לשפר את הניגודיות עבור מיקרו-CT הדמיה כבר למדה15,16,17. Uranyl אצטט גם שימש כסוכן מנוגדים עבור מיקרו-CT הדמיה של עצם, סחוס18,19. ועד ההורים כמו בשימוש פרוטוקול שלנו מוביל מכתים עקבית של כמעט כל הרקמות, תאים דגימות כל דג זברה, מניב תמונות זה שעשוי להיות תואם עם היסטולוגיה כמו מחקרים באמצעות אמצעי אחסון מלאה של רקמות.
במהלך ייבוא תמונות מיקרו-CT, הקרנה (2D) 2-ממדי הוא נלקח כפי המדגם מסובבת על ידי חלקיק תואר וחזר עד המדגם השלים סיבוב 180° או 360°, הפקת סדרה של אלפי התחזיות 2D המשמש שחזור מתוך20תלת-ממדי. בתהליך זה, יגרום בכל ההפרעות של הדגימה ההשתקפויות 2D המתאימים להיות לא מיושרים, וכתוצאה מכך כרכים 3D לקוי המשוחזרת. לדוגמה הנייח היא דרך לתיקון בעיה זו ולערב כמה אסטרטגיות הנוכחי השוקע המדגם באלכוהול או הטבעה של agarose צינורות פוליפרופילן או micropipette טיפים3,5,15, 16 , 21 , 22. טבילה נוזלי שיטות אינן אידיאלי כי דגימת תנועה במהלך ייבוא תמונות יכול להתרחש בין מערכות הדמיה, וכתוצאה מכך שהוסטו שחזורים של אמצעי אחסון 3D23. יתרה מכך, זה ידוע כי יציבותו הפיזית של דגימות רקמה המאוחסנות בנוזל הוא עני פרקי זמן של חודשים עד שנים, עקב חוסר יציבות כימית ושחיקה השטח המזוהים עם התנועה של נקודות מגע בין מדגם לבין (קיר של מיכל אישי תצפיות עם דגימות רקמה חיה ואנושית קבוע).
כדי להפחית את האפשרות לתנועה מדגם במהלך דימות, דוגמאות ניתן להטביע את agarose24,25,26, אך נוהג זה מזוהה עם הסיכון של הכתם לשדר לתוך agarose ובכך להקטין תמונה לעומת זאת26. יתר על כן, תכשירים נוזליים או agarose הם נוטים נזק פיזי ולבזות את לאורך זמן, שהופך אותם מתאימים לאחסון מדגם לטווח ארוך. אנחנו הסיק כי שיטה הנייח דוגמה מוצלחת וישירה באופן פוטנציאלי יכול להיות ממאמרו של שימוש עבור דגימות מיקרוסקופ אלקטרונים. שרפים polymerized כגון 812 EPON (הופסק והוחלף להטביע 812) משמשים כדי לספק את הקשיות הנדרש להפקת מקטעים ודק במיוחד עבור מיקרוסקופ אלקטרונים27,28. ואכן, מספר מחקרים השוואתיים בין דימות רנטגן ואלקטרון הראו כי הדגימות נעוץ שרף יכול לדימות על ידי רנטגן-מיקרוסקופיה-29,-30. עם זאת, חלק נוהלי סטנדרטי של מיקרוסקופ אלקטרונים לא לתרגם ישירות על מיקרו-CT הדמיה. לדוגמה, מיקרו-CT הדמיה של דגימות עם בריבוע שרף קצוות גושי שרף טיפוסי, דגימות של אלה בלוקים מזוהה עם קצה עקיפה חפצים יכולים להפריע הדמיה. החלקת קצוות שרף, בעוד זה אפשרי, זה מפרך ולגזול.
בעוד מגוון רחב של פלסטיק שרפים ההטבעה מועסקות מיקרוסקופ אלקטרונים, רקע גבוה המשויך שרפים קשה כגון 812 להטביע הוביל אותנו לבחון את האחרים. בחרנו LR לבן שלו צמיגות נמוכה, התכווצות נמוך, נטייה נמוכה טופס בועות בזמן הפילמור ורקע נמוכה יותר. כדי ליצור דוגמאות ללא קצה, וכדי לצמצם את הכמות של שרף המקיפים את הדגימה, פיתחנו הפרוטוקולים למשוך דגימות נוזל שרף לתוך פוליאימיד אבובים לפני הפילמור. פוליאימיד נבחר שלו יציבות תרמית גבוהה, גבוהה רנטגן להדמיה כך ההסרה של הצנרת אינו הכרחי עבור הדמיה. בסופו של דבר, תיכננו מתאם micropipette מותאם אישית עבור הדגימה הטבעה טכניקה כדי להחזיק את הצנרור ולמנוע הזיהום של micropipettes באופן אמין. המתאם יכול להיות מודפס מקובץ התמונה CAD תלת-ממד. יחדיו, המטרה של שיטות הכנה מדגם המובאת כאן היא לבצע הטבעה של דוגמאות קטנות יותר הגונים, להשיג משופרת מכתים ניגודיות הנייח נוקשה, אחסון לטווח ארוך של מילימטר שלם-סולם דגימות.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC)-אוניברסיטת המדינה של פנסילבניה.
1. יום 1: קיבוע
- כדי לשפר את הפיקסציה להפחית את עוצמת הקול של תוכן הבטן, להרעיב את הדג לנוער לפחות 24 h עבור דגימה 10 מ מ או יותר עבור דגימות גדולות יותר (למשל., 72 h עבור דגימה 14 מ מ).
- מראש להירגע 10% פורמלין Buffered נייטרלי (NBF) ו- 2 x Tricaine-S (MS-222, 400 מ ג/ליטר) על הקרח עד 4 ° C.
- להכפיל את הדגים למים נפח עם 2 צוננת x MS-222 על המתת חסד מהירה והומאני.
- לחכות 30 s (הזחלים) כדי 60 s (קטינים) אחרי הדג יפסיק לזוז.
- לטבול את הדג צוננת 10% NBF למשך 10 דקות.
- לתקן את הדג צוננת 10% הפתרון NBF בין לילה במיכלים שהונעו בטמפרטורת החדר.
הערה: מכולות שהונעו נדרשים כדי למזער את הכיפוף של הדגימה. היקף מקבע ופתרונות של כל השלבים הבאים צריך להיות לפחות 20 פעמים האחסון מדגם אלא אם צוין אחרת. עבור 1-5 דרגות זחל דג זברה, האחסון הפתרון המומלץ הוא לפחות 1 מ"ל. תוצאות לא מספיקות מקבע קיבוע המסכן, עודף של ריאגנט נפח לא להשפיע לרעה על תוצאות ההליך המתואר. עבור קיבוע מוחלט של דגים גדולים, לשסף את הבטן מתחילה מעט והשתרשה עמוק בלבה הנקבובית אנאלי. להשתמש חדירה מינימאלית של מספריים או סכין, הפעלת כוח עדין מן הדג בעת חיתוך כדי למזער את הנזק לאיברים פנימיים. קיבוע פרוטוקולים היו שתוארו על-ידי אחרים31,32,33.
2. יום 2: התייבשות & מכתים
- לשטוף דגימות קבוע 3 פעמים ב 1 x פוספט buffered מלוחים (PBS) pH 7.4 10 דקות.
- להטביע את הדגימות ב- 35% אתיל אלכוהול (EtOH) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין.
הערה: עבור כל השלבים עצבנות עדין, השתמש מטרף השולחן והגדר לקבלת אפקט ערבוב תוך הימנעות מתנגשות ומשפשף המדגם נגד משטחים מיכל. - להטביע את הדגימות ב- 50% EtOH למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין.
- להמיס חומצה phosphotungstic (PTA) אבקת במים כדי להכין פתרון מניות של w/v 1%.
- לדלל הפתרון מניות של ועד ההורים 1% 3:7 ב 100% EtOH כדי להשיג פתרון ההגדלה של ועד ההורים 0.3%.
- כתם הדגימות לילה בהפתרון ועד ההורים 0.3% בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין.
3. יום 3: הסתננות
- להכין תערובת 1:1 v/v של 100% EtOH ולבן LR שרף אקרילי, מניחים בצד.
- שטיפה 3 פעמים ב 70% EtOH למשך 10 דקות.
- להטביע את הדגימות ב 90% EtOH למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין.
- להטביע את הדגימות ב 95% EtOH למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין.
- להטביע את הדגימות פעמיים ב-100% EtOH למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין.
- להטביע את הדגימות בתערובת 1:1 EtOH ולבן LR שרף אקרילי ללילה בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין.
4. יום ד': הטמעה
- להטביע את הדגימות 100% לבן LR שרף כבר שעתיים בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין.
- להחליף את השרף בשלב 4.1 טריים LR 100% לבן שרף, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין.
- להרכיב את המנגנון ההטבעה (איור 1).
- חותכים פוליאימיד לצנרת בקוטר המתאים ואת אורך.
הערה: מומלץ לאורך צינור בקוטר פנימי זה לפחות 0.1 מ מ גדול יותר מקוטר הדגימה. עבור דגימות טיפוסי, באורך סטנדרטי של 30 מ מ של אבובים משמש עבור כל דגימה. בעת הצורך, ניתן לאכלס דגימות מוארך באמצעות צינורות ארוכים יותר.- לצרף micropipette P1000 לקצה רחב של המתאם ההטבעה והכנס את הצנרור פוליאימיד עד הסוף צר (איור 1C). אם המתאם ההטבעה אינו זמין, עבור לשלב 4.3.3. אחרת, המשך שלב 4.4.
- קליפ לבטל הקצה של טיפ micropipette ישר מעבר כזו הצנרת פוליאימיד מתאימה. חותכים 44 מ מ מקצה רחב של קצה צהוב micropipette 200 µL עבור 0.0403" צנור ו- 59 מ מ מתחתית כחול 1 מ"ל עצה עבור 0.105" אבובים. חתוך לפי הצורך.
- לצרף micropipette לחתוך את הקצה micropipette.
- להעביר את הדגימות שוקלים קטן סירה או פתרון בצורת V אגן ויציפו באופן מלא את הדגימות 100% לבן LR שרף.
- עם המנגנון ההטבעה של 4.3 שלב, לכוון את הצנרור בקצה רחב של המדגם קבוע (או לכיוון הראש במקרה של דגימות בעלי חיים), pipette את הדגימה לאט לתוך הצנרת. מקם את הדגימה באמצע הצנרת ולהבטיח שהצנרור מעל ומתחת הדגימה מתמלא שרף.
- Pipette את הדגימה אל הצנרת כך המדגם הוא נע בכיוון טבעי, קדימה.
הערה: pipetting איטי מונע בועות אוויר, הדגימה הנזק שנגרם על ידי שחיקה כנגד הקצה אבובים. תנועה לאחור אל הצנרת בקלות עלול לגרום נזק הגפיים (גפיים, כנפיים, סנפירים, וכו '.). מומלץ לאפשר גלישה שרף חלק במנגנון ההטבעה כך, מאוחר יותר, האוויר אינו מזין את הצנרור במהלך ההסרה.
- Pipette את הדגימה אל הצנרת כך המדגם הוא נע בכיוון טבעי, קדימה.
- מייד לאטום את הקצה הפתוח עם החומר המבוסס על שמן-עיצוב רך.
- לשטח החימר אל גליון מ מ בעובי 1.
- לייצב את הצנרת בין אינדקס באצבעות.
- לאט לאט הקש החימר נגד בסוף הצנרור עם האגודל.
- הסר את קליי עודף.
- הסר את המנגנון ההטבעה micropipette.
- משוך החוצה את הצנרור שסיבוב עדין, לאטום את הקצה השני עם החימר.
- להחזיק אצבע נגד הסוף אטום כדי למנוע את הפליטה של החימר.
- לאט לאט לדחוף את הסוף יפתחו של הצנרת לתוך החימר.
- מקם את הצנרור אופקית, פולימריזציה השרף במשך 24 שעות ביממה ב- 65 מעלות צלזיוס.
הערה: מיקום אופקי מונע התנועה הדגימה בזמן הפילמור. אם כמות קטנה של אוויר היה לכוד בתוך 4.8 צעד, הסוף עם בועת האוויר עשוי להיות מוגבה מעט כדי למנוע אוויר בועה תנועה לכיוון הדגימה. חשוב לציין, מדי גובה בזמן הפילמור עלול לגרום הדגימה ליפול לקראת סוף נמוך בשל כוח המשיכה. מדגם כראוי מוטבעים מוצגים בהשוואה אחת עם בועת אוויר, אשר יש להימנע בגלל השבירה מממשקים אוויר/שרף עלולות לפגום באיכות התמונה (איור 2).
5. יום 5: אוסף
- לאסוף הדגימות עבור רכישת התמונה בסופו של יום 5.
הערה: הסרת פוליאימיד אבובים הוא אפשרי אבל לא הכרחי עבור הדמיה. סינכרוטרון מבוסס מיקרו-CT הדמיה עבור המדגם דג זברה בוצעה ב הפרעות לקרן החלקיקים 2-BM-מתקדם פוטון מקור (APS) ב Argonne National Laboratory (Lemont, איל, ארה ב). עבור דג זברה צבעונית-ועד ההורים, טווח אופטימלי של אנרגיה רנטגן של 5-30 קוו נקבע, אנרגיה רנטגן של 13.8 קוו שימש עבור הדמיה. 1501 תחזיות התקבלו ב 13.8 קוו מעל 180 מעלות (1 הקרנת כל מעלות 0.12) עם מצלמה pixel 2048-מאת-2048. בנוסף, שתי תמונות שטוח-שדה (רווח) (אחד בהתחלה) ואחד בסוף שנת הרכישה ותמונה כהה-שדה אחד גם נרכשו. תיקונים שטוח- והשדה כהה הפחתת החפץ טבעת, שחזור התמונה נעשו באמצעות פתח מקור TomoPy toolkit34. ועד ההורים שהוכתמו דפניה דרוזופילה דגימות היו עם תמונה של12,רנטגן מיקרוסקופ35. הגדרות ספציפיות של מיקרו-CT תלויים את האובייקט ואת האיכות של הכתם. לדוגמה, הדגימה דרוזופילה שנסרק ב 40 kVp, 74 mA ו- 15 s ברזולוציה voxel של 3.10 × 3.10 × 3.10 מיקרומטר3.
Representative Results
הפרוטוקול המתואר לעיל פרטי תהליך הכנה לדוגמה עבור דג זברה כל הזחלים ונוער עבור מיקרו-CT הדמיה. ראוי לציין, שיטה זו היא ברצון המותאמים לסוגי מדגמים אחרים (למשל., דרוזופילה דפניה, תודרנית, העכבר איברים). הדגירה פעמים בשלבים שונים מתאימים עבור הזחלים דג זברה ודוגמאות גודל דומה; דגימות גדולות יותר עשויות לדרוש יותר זמן הדגירה. כדי לסייע עם הדגימה הטבעה צעדים, תיכננו מתאם מייחסת micropipette 1 מ"ל, ולא יכול להיות מותאם אישית עבור גדלים שונים של פוליאימיד אבובים (איור 1). מתאם מותאם אישית זה היה 3D שהודפסו קובץ CAD הוא מזוהה עם כתב היד הזה זמין להורדה מ- http://publications.chenglab.com/LinEtAlJOVE/. מאז כל קוראי ייתכן אין גישה למדפסת תלת-ממד, הרכבה של מנגנון ההטבעה תוצרת בית באמצעות טיפים micropipette מתואר בפרוטוקול (שלב 4.3). זחל דג זברה בהצלחה מוטבע מוצג בהשוואה ל הדגימה עם בועת אוויר (איור 2), אשר סביר להניח תגרע מאיכות התמונה. כדי להדגים את הרב-גוניות של ההליך ההטבעה, אנו מראים דגימות של אורגניזמים שונים דגם (כלומר., רזבורה דרוזופילה, דפניה, העכבר העובר) אשר עברו את הדגימה הכנה צינור ( איור 3). המשוחזרת נפחי דגימות רזבורה דפניה, דרוזופילה כל תמונה על-ידי מיקרו-CT תלת-ממד מוצגים (איור 4). חשוב, כפי שמגלה את הדגימה רזבורה , דגימות אלה יכול להיות מאוחסנים לתקופה ממושכת של זמן, לעשות שימוש חוזר עבור הפעלות מרובות הדמיה (איור 5).
איור 1. הטבעה המנגנון. (א) מתאם נועד לקדם את הטמעת בעזרת כלי מעבדה נפוץ. (B) איור חתך הרוחב של המתאם. (ג) הטבעה המנגנון לאחר ההוספה של הצנרת פוליאימיד מתאם פוינט (א), צירוף של micropipette בנקודה מתאם (c). מתאם קטע (b) הוא חדר גלישה מתוכנן להכיל שרף עודף ולהגן על micropipette מפני זיהום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. דגימות בהצלחה מוטבע אין בועות אוויר. (א) מוטבעים 3 יום שלאחר ההפריה (dpf) זחל דג זברה ללא בועות האוויר. (B דג זברה) מוטבעים dpf 3 עם בועת אוויר. אוויר שנלכדו במהלך תהליך ההטבעה ניתן להזיז לכיוון הדגימה אם המדגם אינם ממוקמים אופקית במהלך הפילמור. גודל ברים = 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. מגוון רחב של דגימות יכול להיות מוטבע עם פרוטוקול שלנו. (א) זחל דג זברה 7 dpf. (ב) למבוגרים דרוזופילה. (ג) מבוגר דפניה. (ד) העכבר העובר. דגימות גדולות כגון העובר העכבר נגבית על ידי מספר שינויים בפרוטוקול. בקצרה, הצנרת פוליאימיד היה מלא כדי 1/3 אורכו של שרף, polymerized לפני הטבעה. מדגם קבוע, מיטה הונח על גבי שרף polymerized מראש. הצנרת התמלא ואז שרף polymerized האו ם ואחריו פלמור השני. הצנרת פוליאימיד הוסרה לפני הצילום כדי לאפשר כאחראית המדגם באיור זה. ההסרה של הצנרת אינו נחוץ לצורך ייבוא תמונות מוצלחות על ידי מיקרו-טי ברים בקנה מידה: תמונות הדגימה, 5 מ מ; מוגדלים כניסות, 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4. הדמיות תלת-ממדי של דגימות מוטבע. (א) 3 זחל דג זברה dpf ב 0.743 × 0.743 × 0.743 מיקרומטר3 voxel רזולוציה שיחזר. (ב) שיחזר למבוגרים דפניה (3 × 3 × 3 מיקרומטר3 voxel רזולוציה). (ג) שיחזר למבוגרים דרוזופילה (3.1 × 3.1 × 3.1 מיקרומטר3 voxel רזולוציה). ניתן להפיק חתכים דיגיטלית בכל זווית כפי שמוצג בעמודה הימנית. ייצוגים משטח מוצגים בצד הימין, מעובד באמצעות תוכנה מסחרית. הטבעה שרף ניתן לראות כל הסריקות מחוץ המדגם (צוין על-ידי *), אבל לא מפריע הדגימה עצמה. הזחל דג זברה צולמה ב Argonne National Laboratory הפוטון מתקדם במקור זה מבוסס סינכרוטרון. דגימות דפניה או דרוזופילה היו עם תמונה עם מיקרוסקופ צילום רנטגן מסחרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. דוגמאות מוטבע עם פרוטוקול שלנו יכול להיות מחדש תמונה עם מיקרו-טי הזחל דג זברה 5 dpf באותו צולמה ב 2011 (א) ו (ב) 2013, כפי בעוצמה ממוצע תחזיות של התצוגה הסאגיטלי שהוצגו. התמונה השוואה בין הסריקות לאחר האחסון מראה על שימור תכונות אנטומיות. (ג) תקריב של השריר של שתי סריקות מוצגת, מקוטע קווי המציין אזורים המתאימים לשימוש (D) עוצמת פרופיל הדור. עוצמת פרופילים מנורמל ל שלהם ממוצעים המתאימה לאורך שני הקווים מראים במרחב התאמת פסגות המקומית שתי סריקות. (ה) ממוצע ערכי העוצמה של אזורים שנבחרו ב- A ו- B השייכים רקע (Bg, סגול), גרעינים עצביים (N, ירוק), חומר לבן (W, כחול), השריר (מ', כתום) היו מחולק בממוצע עבור רקע (לבן) המשמש ליצירת אות לרעש יחסי גודל (SNR), התואם היטב בין הסריקות. גודל ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
כתב יד זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור קיבעון נוקשה של מילימטר-סולם קבוע, מיטה דגימות (0.5-2.5 מ"מ קוטר) עבור מיקרו-CT הדמיה. לאור התקדמות מהירה טכנולוגיית מיקרו-CT מבחינת רזולוציה ומהירות, שיטת שימור מדגם קבוע עם יכולות הדמיה מחדש רצוי מאוד. באופן מסורתי, שרף ההטבעה צפופה משמשות בדרך כלל מיקרוסקופ כדי לספק תמיכה מבנית כדי למזער את הנזק הדגימה גזורה מקטעים ודק במיוחד. השיטה שלנו הותאם לשימוש בטקטיקות נוקשה במהלך דימות בלתי הרסניות. כדי למזער את החפצים הדמיה של הנוכחות של שרף עודף, יישמנו את השימוש אבובים פוליאימיד שקוף רנטגן כדי ליצור דוגמאות עגולה ללא קצוות, וכדי להגביל את עוצמת הקול של שרף סביב המדגם.
תוצאה אופטימלית של ההליך ההטבעה זה מקצוע ביצוע זהיר של מספר שלבים קריטיים ותשומת מדגם שלמות לאורך כל ההליך. אכן, פגיעה הדגימה יביא תמונה סופית פרוץ ללא קשר להצלחת ביצוע הדמיה. כיוון מצמרר תורם הצטמצמות של התגובות כאב, רקמות מבולבל מדרדרת במהירות רבה יותר בטמפרטורות גבוהות יותר, אנו משתמשים ריאגנטים מראש צוננת. דגימות גדולות ייתכן שתצטרך לחתוך כדי לאפשר את כניסתם של מקבע לתוך החלק הפנימי של הדגימה כך איברים פנימיים כגון כבד, לבלב בטן קבועים לחלוטין. רקמות מבולבל להידרדר ולאבד המבנית, להרוס את המבנה הביולוגי. עוד צעד המפתח היא לשמור את הדגימה במערך הטבעי שלה. לכן, אנו עו ד לשימוש של מכולות שהונעו, שבהם נשתמש ברחבי הליך חשובות במיוחד במהלך קיבעון. קיבוע פוליפרופילן צינורות או צינורות חרוט אשר בדרך כלל יש חלק תחתון בצורת V להימנע כי הם יכולים לגרום דגימות מוארך לכופף, אשר חולקה על המורפולוגיה הטבעי של הדגימה. בנוסף, כדי לצמצם את השימוש שרף, הקוטר הפנימי של הצנרת פוליאימיד הוא רק מעט גדול יותר מאשר הרוחב של הדגימה. כיפוף של הדגימה יכול גם לגרום לנזק הדגימה המתאוששת הצנרת. כמו כן מומלץ להעביר את הדגימה אל הצנרת באופן טבעי קדימה כדי למנוע נזק הגפיים. התייבשות נכונה היא עוד צעד קריטי. זו מושגת עם במרווחים קטנים של ריכוז EtOH לאט להחליף מים עם EtOH, וזה יותר miscible עם השרף. בעליות גדולה בריכוז EtOH קשורים עם רקמת הצטמקות של יכולים להשתפר על ידי נוספים בהפרשים של דגירה EtOH לעשות את המעבר יותר הדרגתית. לבסוף, כדי למזער את התנועה של הדגימה או כיסי אוויר, אם יש כאלה, הדגימות ממוקמים אופקית במהלך פלמור שרף (סוף יום 4). כיסי אוויר או איטום ליד הדגימה גורם חפצים אופטי עם דימות רנטגן הקשורים עם קצה עקיפה, הפחתת איכות התמונה.
לגבי שינויים אפשריים הפרוטוקול אחרים ההטבעה שרפים, מתכת כתמי יכול לשמש במקום אקריליק לבן LR ו- PTA, בהתאמה. Embed812, שרף אפוקסי נפוץ מיקרוסקופ אלקטרונים, בעלי צמיגות גבוהה, קשה יותר להעביר, עלול לגרום העיוות של דגימות, והיא קשורה עם רקע גבוה יותר מאשר שרפים methacrylate אקריליק או גליקול. בעוד JB4 פלוס, methacrylate גליקול, הוא פחות צמיגה יותר EMbed812 ויש לו רקע נמוך יותר, אקראי היווצרות כיסי אוויר מופיעים לעתים קרובות באזור הדגימה. כאמור, כיסי אוויר לבזות את איכות התמונה, בעייתיים במיוחד עבור דגימות היקר. ראוי לציין כי Technovit 7100, עוד methacrylate גליקול, מפריע PTA מכתים, וכתוצאה מכך המסכן הניגודיות בתמונה הסופית. יחסית, אקריליק לבן LR יש כמו מים צמיגות, רקע נמוך, והוא אינו מפריע PTA מכתים. בידיים שלנו, שיעור ההצלחה של הטמעת LR-לבן ללא בועות נזק או אוויר מדגם גדול מ- 95%. מסיבות אלו, אנו עו ד את השימוש בשם השרף ההטבעה בשביל לרקמות מיקרו-טי לגבי כתמים, התוצאה של מתכת שונים כתמים כגון אוסמיום ארבע-חמצני, יוד, ואת בישיבת מיקרו-CT הדמיה כבר בהשוואה ולא במקומות אחרים שנדונו15,16,17 מההיקף של זה כתב היד.
גודל המדגם הוא מגבלה משמעותית את הפרוטוקול הנוכחי שלנו. מאז אנו מעסיקים שאיבה להעביר דגימות לתוך הצנרת, היכולת לראות את הדגימה הוא קריטי עבור כיוון ולהבטיח כי זה אכן בתוך הצנרת. כתוצאה מכך, מילימטר דוגמאות כגון דובוני מים (כלומר., דובוני מים) קשים מאוד להטביע מכיוון שהן דורשות השימוש מיקרוסקופ כדי ניתן לאבחן. לאחר שאיבה מוחל, דגימות מיקרוסקופיים אובדים בקלות מהמטוס מוקד ולהיות מאתגר לגלות מחדש, ולכן קשה לקבוע אם הם עברו רחוק מדי עד הסוף המצורפת של הצנרת. במדגמים גדולים, כגון עכבר עוברי (3-10 מ מ) יכול להיות מוטבע עם שינויים קלים פרוטוקול ההטבעה (איור 4D). בפרט, הצנרת פוליאימיד היה מלא 1/3 עם שרף נוזלי, אשר היה polymerized לפני הטבעה. המדגם קבוע, מיטה הונח על גבי שרף polymerized מראש. הצנרת ואז מלא מלא עם שרף polymerized האו ם, ואחריו פלמור השני.
המשמעות של פרוטוקול ההטבעה שלנו הוא סעפת. קיבוע נוקשה כל דגימות חיים או רקמות הם רצויים מסיבות כולל: (1) יצירת מאגרים לטווח ארוך של דגימות שקשה ליצור או להכין; (2) רכישה מחדש של נתונים; (3) הפעלת באמצעות הדמיה טורי שיטות הדמיה מרובים; (4) מתן סטנדרטים כיול ופיתוח טכנולוגיה. המוכנים שלנו תהליך ההטבעה נארזים שרף מוצק זה גמיש מפני נזק ודוגמאות ולכן ניתן בקלות לאחסן אולי ללא הגבלת זמן. אחסון לטווח ארוך שימושי במיוחד עבור דגימות נדירות או שנוצר בעמל רב כגון אלה הקשורים phenome פרויקטים. עוד יותר, בכל מקרה שבו הנתונים דיגיטלי הולכים לאיבוד, ניתן להפיק את הנתונים של המדגם המקורי. היכולת של תמונה חדשה על פני תקופה ארוכה של זמן פוטנציאלי מאפשר באותה דגימת זרע להיחקר עם יותר הדמיה בעתיד שיטות מתקדמות. מאז הדגימות יציבים מבחינה פיזית בין המופעים הדמיה, תמונות נרכשים מן הדגימה זהה באותו הכיוון, הקלת רישום בין ערכות נתונים קודמת, ומאוחר יותר. לדוגמה, תמונה ברזולוציה נמוכה עשוי לאפשר רק פילוח של רקמות בזחל דג זברה. הזחל באותו יכול מאוחר יותר מחדש תמונה ברזולוציה גבוהה יותר כך מפורט יותר ניתוחים חישובית ברזולוציה הסלולר. יכולת זו לשם השוואה ישירה בין הסריקות רשום מרמזת על דגימות שרף-מוטבע פוטנציאל סטנדרטי לפיתוח טכנולוגיה מיקרו-טי ההשפעות של שינוי כלשהו לשיטת הדימות יכול להיות מוערך על ידי הדמיה של המדגם אותו כך כל המשתנים בשלב הכנת המדגם נשלטים. לבסוף, מדגם רגיל שרף-מוטבע ניתן לצורך כיול מכשיר לבדיקת עקביות של הדמיה.
העבודות הקודמות שלנו בחינת דגים מוטנטים וחולים היסטולוגיה הראה כי הרזולוציה הסלולר מאפשר זיהוי של חריגות עדינים בתוך מבנה רקמות שדילגה בבדיקה מגעיל באמצעות מיקרוסקופ ויבתר36או של צריכת חשמל נמוכה סטריאו מיקרוסקופ. אנחנו רוצים להרחיב את הבדיקות שלנו ברזולוציה גבוהה דגימות אנושי. דג זברה הזחלים, המהווים את הנושא העיקרי של עבודת פיתוח שלנו, דומים ביופסיות מחט האנושי שלהם השבריריות, רקמות הסלולר ואת המערכת הטרוגניות, (1-3 מ מ קוטר) בגודל צורה מוארכת. על סמך ניסיוננו עם דג זברה, והעבודה אחרים מראה המיקרו-סריקת צבעונית בהצלחה וייסרק רקמה אנושית, גם אם בכל רזולוציה נמוכה יותר37, אנו מצפים שלנו גישות להביא ערך מוסף הדמיה וניתוח של ביופסיות מחט. אנו משוער זה מכלול של ערכת מספיק עבור בתכשיר אחד עד 20 דוגמאות באותו המצב של להיות פוטנציאל פחות מ 30 דולר ארה ב. הדגימות שהוכנו על ידי שיטת ההטבעה שלנו הינם עמידים יותר בפני נזק פיזי ולכן קל להעביר. עלות נמוכה וקלות התחבורה מציע את האפשרות של איסוף דגימות ברחבי העולם, במיוחד באזורים בהם הדמיה ברזולוציה הסלולר עם מיקרו-CT אינו נגיש בקלות. החזון שלנו הוא עבור קבצים דיגיטליים ברזולוציה גבוהה של ביופסיות מחט (החל מ- 0.1 ועד כמה טרה-בתים) מאפשרות היצירה של אטלס דיגיטלי של רקמות אנושיות, ולאפשר במקביל החוקרים לשכלל ולשפר את צינורות ניתוח הנוכחי עבור לוקליזציה ואפיון כמותי של אדריכלות הסלולר ורקמות בתוך ההקשר 3D מלא של הרקמות שנסרקו.
Disclosures
כל המחברים מצהירים כי ישנם אין קונפליקטים של אינטרסים.
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות רולנד מאיירס מתבקשים לספק את הפרוטוקולים TEM המקורי. בנוסף, ברצוננו להודות ד ר ג'ון Colbourne על מתן הדגימה דפניה , ד ר ענבר שוב Girirajan על מתן הדגימה דרוזופילה ו ד ר כמאל Fadia למתן העובר העכבר. החוקרים לאשר תמיכה NIH במימון (1R24OD18559-01-A2, PI: KCC), מעבדות Gittlen ג'ייק לחקר הסרטן, ומתוך פרס פיילוט מימון מכוני האק כח של מדעי החיים, מכון CyberScience.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Phosphotunstic Acid | VWR | MK282402 | |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | MS-222 | |
| LR White | Electron Microscopy Sciences | 14380 | |
| Polyimide tubing (ID 0.04") | Nordson Medical | 141-0065 | The exact polyimide tubings described in the manuscript are no longer available. A close match is provided here. Tubing with custom diameter can be manufactured upon request. |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Oil-based soft modeling clay | Sculpey | S302 001 | |
| Micropipette P200 | Gilson | F123601 | |
| Micropipette P1000 | Gilson | F123502 | |
| Glass vials | VWR | 66015-042 | |
| V-shaped basin | VWR | 89094-676 | |
| Weigh boats | VWR | 10803-148 | |
| 200 μL yellow micropipette tip | Fisher Scientific | 02-707-500 | |
| 1 mL blue micropipette tip | Fisher Scientific | 02-681-163 | |
| Tabletop shaker | Thermolyne | M71735 | |
| Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 CCD | |
| X-ray microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa |
References
- Cheng, K. C., Katz, S. R., Lin, A. Y., Xin, X., Ding, Y. Whole-organism cellular pathology: a systems approach to phenomics. Advances in Genetics. 95, 89-115 (2016).
- Cheng, K. C., Xin, X., Clark, D., La Riviere, P. Whole-animal imaging, gene function, and the zebrafish phenome project. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 620-629 (2011).
- Vågberg, W., Larsson, D. H., Li, M., Arner, A., Hertz, H. M. X-ray phase-contrast tomography for high-spatial-resolution zebrafish muscle imaging. Scientific Reports. 5, 16625 (2015).
- Bruneel, B., et al. Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies. Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).
- Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
- Silvent, J., et al. Zebrafish skeleton development: High resolution micro-CT and FIB-SEM block surface serial imaging for phenotype identification. PLoS One. 12 (12), e0177731 (2017).
- Hur, M., et al. MicroCT-based phenomics in the zebrafish skeleton reveals virtues of deep phenotyping in a distributed organ system. eLife. 6, e26014 (2017).
- J, S. Whole-body imaging of a hypercholesterolemic female zebrafish by using synchrotron X-ray micro-CT. Zebrafish. 12 (1), 11-20 (2015).
- Hasamura, T., et al. Green tea extract suppresses adiposity and affects the expression of lipid metabolism genes in diet-induced obese zebrafish. Nutrition and Metabolism. 9 (1), 73 (2012).
- Meguro, S., Hasumura, T., Hase, T. Body fat accumulation in zebrafish is induced by a diet rich in fat and reduced by supplementation with green tea extract. PLoS One. 10 (3), e0120142 (2015).
- Dyer, E. L., et al. Quantifying mesoscale neuroanatomy using X-ray microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Perilli, E., Parkinson, I. H., Reynolds, K. J. Micro-CT examination of human bone: from biopsies towards the entire organ. Ann Inst Super Sanita. 48 (1), 75-82 (2012).
- Watz, H., Breithecker, A., Rau, W. S., Kriete, A. Micro-CT of the human lung: imaging of alveoli and virtual endoscopy of an alveolar duct in a normal lung and in a lung with centrilobular emphysema - initial observations. Radiology. 236 (3), 1053-1058 (2005).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Pauwels, E., Van Loo, D., Cornillie, P., Brabant, L., Van Hoorebeke, L. An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250 (1), 21-31 (2013).
- Kün-Darbois, J. D., Manero, F., Rony, L., Chappard, D. Contrast enhancement with uranyl acetate allows quantitative analysis of the articular cartilage by microCT: Application to mandibular condyles in the BTX rat model of disuse. Micro. 97, 35-40 (2017).
- Tang, S. Y., Vashishth, D. A non-invasive in vitro technique for the three-dimensional quantification of microdamage in trabecular. Bone. 40 (5), 1259-1264 (2007).
- Elliott, J. C., Dover, S. D. X-ray microtomography. Journal of Microscopy. 126 (Pt 2), 211-213 (1982).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping). PLoS Genetics. 2 (4), e61 (2006).
- Larsson, D. H., Vågberg, W., Yaroshenko, A., Yildirim, A. Ö, Hertz, H. M. High-resolution short-exposure small-animal laboratory x-ray phase-contrast tomography. Scientific Reports. 6, 39074 (2016).
- Pleissis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 5, 1011 (2017).
- Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321 (2013).
- Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, L. P., Henkelman, R. M. Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-CT. Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).
- Hsu, C. W., et al. Three-dimensional microCT imaging of mouse development from early post-implantation to early postnatal stages. Developmental Biology. 419 (2), 229-236 (2017).
- Luft, J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 409-414 (1961).
- Hayat, M. A., Giaquinta, R. Rapid fixation and embedding for electron microscopy. Tissue Cell. 2 (2), 191-195 (1970).
- Handschuh, S., Baeumler, N., Schwaha, T., Ruthensteiner, B. A correlative approach for combining microCT, light and transmission electron microscopy in a single 3D scenario. Frontiers in Zoology. 10, 44 (2013).
- Bushong, E. A., et al. X-ray microscopy as an approach to increasing accuracy and efficiency of serial block-face imaging for correlated light and electron microscopy of biological specimens. Microscopy and Microanalysis. 21 (1), 231-238 (2015).
- Tsao-Wu, G. S., Weber, C. H., Budgeon, L. R., Cheng, K. C. Agarose-embedded tissue arrays for histologic and genetic analysis. Biotechniques. 25 (4), 614-618 (1998).
- Sabaliauskas, N. A., et al. High-throughput zebrafish histology. Methods. 39 (3), 246-254 (2006).
- Copper, J. E., et al. Comparative analysis of fixation and embedding techniques for optimized histological preparation of zebrafish. Comparative Biochemistry and Physiology. 208, 38-46 (2018).
- Gürsoy, D., De Carlo, F., Xiao, X., Jacobsen, C. TomoPy: a framework for the analysis of synchrotron tomographic data. J Synchrotron Radiat. 21 (Pt 5), 1188-1193 (2014).
- Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21 (2), 10-15 (2013).
- Thomas, G. K. A molecular and systems biology analysis of pleiotropic vertebrate phenotypes (Doctoral dissertation). , Retrieved from the Penn State Electronic Theses and Dissertations Database (2009).
- Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano- tomography. Scientific Reports. 5, 10074 (2015).
