Summary
Vi utviklet protokoller og laget en tilpasset apparater aktivere innebygging av millimeter skala. Vi presenterer eksempel forberedelse prosedyrer med vekt på innebygging i akryl harpiks og polyimid (pi) rør for å oppnå stive immobilisering og langsiktig oppbevaring av prøver for avhør av vev arkitektur og celle morfologi av mikro-CT.
Abstract
I over hundre år er histologiske studier av vev gullstandarden for medisinsk diagnose fordi histology tillater alle celletyper i hver vev identifiseres og preget. Vårt laboratorium arbeider aktivt for å gjøre teknologiske fremskritt i X-ray mikro-beregnet tomografi (mikro-CT) som vil bringe histology diagnostiske makt til studiet av full vev volumer på mobilnettet oppløsning (dvs., et røntgenbilde Histo-Tomography modalitet). Mot dette formål, har vi gjort målrettet forbedringer eksempel forberedelse rørledningen. En nøkkel optimalisering, og fokus for den nåværende arbeidet, er en enkel metode for stive innebygging av faste og farget millimeter skala prøver. Mange av de publiserte metodene for eksempel immobilisering og correlative mikro-CT bildebehandling stole på å plassere prøvene i parafinvoks, agarose eller væsker som alkohol. Vår tilnærming utvider dette arbeidet med tilpassede prosedyrer og utformingen av en 3-dimensjonal utskrivbar apparat å innebygge prøvene i en akryl harpiks direkte i polyimid (pi) rør, som er relativt synlig for røntgenstråler. Her, er eksempel forberedelse prosedyrer beskrevet for prøvene fra 0,5 til 10 mm i diameter, som ville være egnet for hele sebrafisk larver og yngel, eller andre dyr og vevsprøver lignende dimensjoner. Som bevis på konseptet, har vi innebygde prøver fra Danio, Drosophila, Daphniaog en mus embryoet; representant bilder fra 3-dimensjonale skanner for tre av disse prøvene vises. Viktigst, fører vår metode til flere fordeler inkludert stive immobilisering, langtidsoppbevaring av møysommelig opprettet ressurser og muligheten til å forhøre re prøver.
Introduction
Fenotyper er observerbare trekk til en organisme som representerer konsekvensene av unike interaksjon mellom genetisk bakgrunn og miljø. Disse egenskapene kan omfatte opptreden, biokjemiske, morfologiske, utviklingsmessige og fysiologiske egenskaper. Viktigere, kan forskjeller i trekk mellom vill-type organismer og genetisk mutanter gi viktig innsikt i mekanismer og funksjoner av berørte gener. Med hensyn til morfologi, histopatologi er gull standard for å vurdere fenotyper på cellenivå men lider av mekaniske gjenstander og tillater ikke nøyaktig kvantitativ volumetric analyse1. Vårt laboratorium er motivert til å overvinne barrierer for bruk av diagnostiske makt histology til full vev volumer på submicron oppløsning.
En undersøkelse av tilgjengelige teknologier antyder at bildebehandling av X-ray mikro-beregnet tomografi (mikro-CT) kan gi ideelle evnene som trengs for millimeter skala hele-dyr 3-dimensjonale (3D) histology. Mikro-CT kan ikke-destruktiv, isotropic, 3D-visualisering og muligheten til å utføre kvantitativ analyse av vev arkitektur1,2. De siste årene, 3D-bildebehandling av unstained kvinne og metall-farget sebrafisk av mikro-CT har fått økende trekkraft og blitt benyttet for volumetric analyse av flere vev, inkludert muskel, tenner, bein og liggende under adipose vev3,4 ,5,6,7,8,9,10. Andre modellen organismer og vevsprøver er også mottakelig for mikro-CT bildebehandling. For eksempel har en rørledning blitt introdusert for kvantifisere tett mesoscale nevroanatomi musen hjerner fotografert via synchrotron mikro-CT11. Tilsvarende har en eosin-baserte fargeprotokoll vist å være egnet for bløtvev mikro-CT imaging hele musen organer12. Morphometric analyse av unstained kvinne menneskelige L3 ryggvirvlene og visualisering av sølv-farget menneskelige lungene ved hjelp av mikro-CT har vist nytten av denne teknologien for menneske prøver13,14.
For å aktualisere den store løftet av mikro-CT komplett morfologiske phenotyping intakt små dyr og vevsprøver, må en rekke hekk overvinnes i forhold til produksjon, oppløsning, felt-of-view, omfattende celle flekker, og langsiktig bevaring. Hver av disse aspektene er kritisk viktig, fokuserer nåværende manuskriptet på optimalisering av innebygging prosedyrer, med flere merknader på prøven fiksering og flekker. Heavy metal flekker er nyttig fordi iboende kontrasten mellom forskjellige bløtvev i mikro-CT-bilder er lav. Styrken på ulike metall flekker, som osmium tetroxide, jod, phosphotungstic syre (PTA) og gallocyanin-chromalum, for å forbedre kontrasten for mikro-CT bildebehandling har vært studert15,16,17. Uranyl acetate er også brukt som kontrasterende agent for mikro-CT bildebehandling bein og brusk18,19. PTA i våre protokollen fører til konsekvent farging av nesten alle vev og celler i hele sebrafisk prøver, gir bilder som er potensielt kompatible med histology-lignende studier gjennom hele mengder vev.
Under mikro-CT-bilde oppkjøpet, en 2-dimensjonal projeksjon (2D) er tatt som prøven roteres ved en brøkdel av en grad og gjentatt til prøven er fullført en 180° eller 360° rotasjon, generere en serie av 2D anslag brukes for den rekonstruksjon av 3D-volum20. I denne prosessen medfører noen forstyrrelsene av prøven tilsvarende 2D anslagene være justert, som resulterer i dårlig rekonstruerte 3D volumer. Eksempel immobilisering er en måte å rette opp dette problemet og noen gjeldende strategier innebærer submerging eksemplet i alkohol eller bygge i agarose i polypropylen rør eller brønnene tips3,5,15, 16 , 21 , 22. flytende nedsenking metoder er ikke ideelt fordi eksempel bevegelse under bildeopptak kan oppstå mellom tenkelig sett, noe som resulterer i skiftet rekonstruksjoner av 3D volumer23. Videre er det kjent at fysisk stabiliteten av væske lagret er dårlig i tidsskalaer måneder til år, kjemiske ustabilitet og overflate slitasje forbundet med bevegelse av kontaktpunkter populasjonsutvalg og beholder veggen ( personlige observasjoner med fast dyr og menneskelige vevsprøver).
For å redusere potensialet for eksempel bevegelse under bildebehandling, prøver kan bygges i agarose24,25,26, men denne praksisen er forbundet med risiko flekken spre i agarose dermed redusere bildet kontrast26. Videre væske eller agarose forberedelser er utsatt for skader og forringes over tid, noe som gjør dem uegnet for eksempel langtidslagring. Vi tenkte at potensielt vellykket og enkel immobilisering metode kan tilpasses fra som brukes for elektronmikroskop prøver. Polymerized harpiks som EPON 812 (avviklet og erstattet av bygge 812) brukes vanligvis til å gi hardheten å generere ultrathin seksjoner for elektronmikroskop27,28. Faktisk har flere komparative studier mellom X-ray bildebehandling og elektronmikroskop vist at prøvene i harpiks kan avbildes av X-ray mikroskopi29,30. Men oversette noen av standard praksis elektronmikroskop ikke direkte til mikro-CT bildebehandling. For eksempel mikro-CT avbilding av prøver med kvadrat harpiks kantene av typiske harpiks blokker og prøver kuttet fra disse blokkene er forbundet med kanten Diffraksjon gjenstander som kan forstyrre bildebehandling. Jevne harpiks kanter, mens mulig, er arbeidskrevende og tidkrevende.
Mens en rekke plast innebygging harpiks er ansatt i elektronmikroskop, førte høy bakgrunnen tilknyttet vanskeligere harpiks som bygge 812 oss å teste andre. Vi valgte LR hvit på grunn av sin lav viskositet, lav krymping, lav tendens til skjemaet bobler under polymerisasjon og lavere bakgrunn. Opprette kanten-gratis vareprøver og å minimere mengden av harpiks rundt prøven, utviklet vi protokoller for å trekke eksemplarer i flytende harpiks i polyimid (pi) rør før polymerisasjon. Polyimid (pi) ble valgt for høy temperaturstabilitet og høy X-ray transmisjon slik at fjerning av slangen ikke er nødvendig for bildebehandling. Til slutt, vi utviklet en egendefinert brønnene adapter for eksempel våre innebygging teknikk for å holde slangen og hindre forurensning av Mikropipetter pålitelig. Kortet kan være 3D skrives ut fra en CAD-bildefil. Samlet er målet av metodene for eksempel-forberedelse presenteres her å gjøre innebygging av små utvalg enkel, oppnå forbedret flekker kontrast, stive immobilisering og langvarig lagring av intakt millimeter skala.
Protocol
Alle prosedyrer på levende dyr ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Pennsylvania State University.
1. dag 1: fiksering
- For å forbedre fiksering og redusere volumet av tarmen innholdet, sulte juvenile fisken minst 24 h på et 10 mm prøven, eller lengre for større prøver (f.eks., 72 h på en 14 mm prøven).
- Pre chill 10% nøytrale fullbufrede Formalin (NBF) og 2 x Tricaine-S (MS-222, 400 mg/L) på is til 4 ° C.
- Dobbel fisken vann volumet med kjølt 2 x MS-222 for rask og Human euthanasia.
- Vent 30 s (Larvene) til 60 s (barn) etter fisken stopper flytter.
- Legg fisken i kjølt 10% NBF for 10 min.
- Fastsette fisken i kjølt 10% NBF løsning overnatter i flat bunn beholdere ved romtemperatur.
Merk: Flat bunn beholdere er pålagt å minimere bøying av prøven. Volumet av bindemiddel og løsninger for alle etterfølgende trinnene skal minst 20 ganger prøven volumet med mindre annet er angitt. For 1-5 larver sebrafisk er anbefalt løsning volumet minst 1 mL. Utilstrekkelig etappe, den stabiliserende resulterer i dårlig fiksering, og et overskudd av reagensvolum påvirker negativt ikke resultatet av beskrevet prosedyren. For komplett fiksering av større fisk, slit magen begynner litt anterior anal pore. Bruk minimal penetrasjon saks eller kniv og bruk milde kraft fra fisken stund klipping for å minimere skade indre organer. Fiksering protokollene er beskrevet av andre31,32,33.
2. dag 2: Dehydrering og flekker
- Skyll fast prøver 3 ganger i 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) pH 7.4 i 10 min.
- Senk eksemplene i 35% etylalkohol (EtOH) for 20 min ved romtemperatur med mild agitasjon.
NOTE For alle mild agitasjon trinnene, bruk en tabletop shaker og angi en blanding effekt og nøye unngå bumping og gni av prøven mot beholder overflater. - Senk eksemplene i 50% EtOH etter 20 min ved romtemperatur med mild agitasjon.
- Oppløse phosphotungstic syre (PTA) pulver i vannet for å forberede en 1% w/v lagerløsning.
- Fortynne 1% PTA lager løsning 3:7 i 100% EtOH å få en 0,3% PTA flekker løsning.
- Stain eksemplene over natten i 0,3% PTA løsningen ved romtemperatur med mild agitasjon.
3. dag 3: infiltrasjon
- Lag 1:1 v/v blanding av 100% EtOH og LR hvit akryl harpiks og sett til side.
- Skyll 3 ganger i 70% EtOH etter 10 min.
- Senk eksemplene i 90% EtOH i 30 min ved romtemperatur med mild agitasjon.
- Senk eksemplene i 95% EtOH i 30 min ved romtemperatur med mild agitasjon.
- Senk eksemplene to ganger i 100% EtOH i 30 min ved romtemperatur med mild agitasjon.
- Senk eksemplene i 1:1 EtOH og LR hvit akryl harpiks blandingen over natten i romtemperatur med mild agitasjon.
4. dag 4: bygge inn
- Senk eksemplene i 100% LR hvitt harpiks for 2 timer ved romtemperatur med mild agitasjon.
- Erstatte harpiks i trinn 4.1 med fersk 100% LR hvitt harpiks og Inkuber 1t ved romtemperatur med mild agitasjon.
- Samle innebygging apparatet (figur 1).
- Kuttet polyimid (pi) rør riktig diameter og lengde.
Merk: Anbefales slangen med en diameter som er minst 0,1 mm større enn diameteren på prøven. For typisk prøver brukes en standard lengde på 30 mm rør for hvert utvalg. Da ønskede, elongated prøver kan innpasses ved hjelp av lengre rør.- Knytte P1000 brønnene til den vide enden av innebygging kortet og sette inn polyimid (pi) slangen til smale enden (figur 1 c). Hvis innebygging kortet ikke er tilgjengelig, gå til trinn 4.3.3. Ellers fortsette til trinn 4.4.
- Klipp av slutten av et brønnene tips rett over slik at polyimid (pi) slangen sitter. Klipp på 44 mm fra den vide enden av et 200 µL gule brønnene tips for 0.0403" rør og 59 mm fra bunnen av 1 mL blå tips for 0.105" rør. Trim etter behov.
- Fest kuttet brønnene spissen til brønnene.
- Overføre prøvene til en liten veie båt eller V-formet løsning bassenget og dukke fullt ut eksemplene i 100% LR hvitt harpiks.
- Innebygging apparater fra trinn 4.3, målet slangen i den brede enden av fast prøven (eller mot hodet i dyr eksemplarer) og Pipetter prøven sakte i slangen. Plasser prøven i slangen og sikre slangen over og under prøven er fylt med harpiks.
- Pipetter prøven i slangen slik at prøven er går i naturlige, forover retning.
Merk: Langsom pipettering unngår luftbobler og prøven skade forårsaket av slitasje kant rør. Bakover bevegelse i slangen kan lett skade ekstremiteter (lemmer, vinger, svømmeføtter, etc.). Det anbefales å tillate noen harpiks overflyt i innebygging apparatet slik at senere, luften ikke inn slangen under fjerning.
- Pipetter prøven i slangen slik at prøven er går i naturlige, forover retning.
- Umiddelbart seal den åpne enden med oljebasert myk modellering leire.
- Flat leire i en 1 mm tykt ark.
- Stabilisere slangen mellom indeks og midtre fingre.
- Langsomt trykk leire mot slutten av slangen med tommelen.
- Fjern overflødig leire.
- Fjerne innebygging apparatet fra brønnene.
- Trekk ut slangen av mild rotasjon og forsegle den andre enden med leire.
- Hold en finger mot forseglet slutten å hindre utstøting av leire.
- Sakte skyve utette slutten av slangen inn i leiren.
- Plasser slangen horisontalt og danner harpiks 24 h på 65 ° C.
Merk: Horisontal plassering unngår eksempel bevegelse under polymerisasjon. Hvis en liten mengde luft ble fanget i trinn 4.8, kan til slutt med luftboble være forhøyet litt for å hindre luft boble bevegelse mot prøven. Viktigere, forårsake mye høyde under polymerisasjon å faller mot den lave enden på grunn av tyngdekraften. En riktig innebygd eksempler vises sammenlignet med en luftboble, som bør unngås fordi refraksjonen som oppstår fra luften/harpiks grensesnitt kan redusere bildekvaliteten (figur 2).
5. dag 5: samling
- Avhente eksemplar for bildeopptak på slutten av dag 5.
Merk: Fjerning av polyimid (pi) rør er mulig, men ikke nødvendig for bildebehandling. Synchrotron-baserte mikro-CT bildebehandling for sebrafisk prøven ble utført på Beamline 2-BM på Avansert Foton kilde (APS) i Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA). For PTA-farget sebrafisk, ble det bestemt et optimalt X-ray energi spekter av 5-30 keV, og en X-ray energi 13.8 keV ble brukt for bildebehandling. 1501 prognosene ble oppnådd på 13.8 keV over 180 grader (1 projeksjon hver 0,12 grader) med en 2048-av-2048 kamera. I tillegg ble to flat-feltet (gevinst) bilder (en i begynnelsen) og på slutten av oppkjøpet og en mørk-feltet bilde også kjøpt. Flat-feltet og mørke felt, ring artefakter reduksjon og bildet gjenoppbygging ble gjort benytter åpent kilde TomoPy toolkit34. PTA-farget Daphnia og Drosophila prøver ble fotografert på en X-ray mikroskop12,35. Mikro-CT innstillinger er avhengig av objektet og kvaliteten på flekken. For eksempel Drosophila prøven ble skannet på 40 kVp, 74 mA og 15 s voxel oppløsning 3,10 × 3.10 × 3.10 µm3.
Representative Results
Protokollen beskrevet ovenfor detaljer eksempel forberedelse prosedyren for hele sebrafisk larver og yngel for mikro-CT bildebehandling. Spesielt denne metoden er lett tilpasses andre prøver typer (f.eks., Drosophila, Daphnia, Arabidopsis, mus organer). Inkubasjon ganger trinnene på passer for sebrafisk larver og prøver av lignende størrelse; større prøver krever lengre inkubasjon. Hjelp med prøven innebygging trinn, utviklet vi en adapter som festes til 1 mL brønnene, og kan tilpasses ulike størrelser av polyimid (pi) rør (figur 1). Dette egendefinerte kortet var 3D skrives ut fra en CAD-fil som er knyttet til dette manuskriptet og tilgjengelig for nedlasting fra http://publications.chenglab.com/LinEtAlJOVE/. Siden alle lesere ikke kan ha en 3D skriver, er montering av en hjemmelaget innebygging apparater bruker brønnene tips beskrevet i protokollen (trinn 4.3). En vellykket innebygde sebrafisk Larven er vist i forhold til en prøve med en luftboble (figur 2), vil trolig redusere bildekvaliteten. For å demonstrere allsidigheten av innebygging prosedyren, viser vi prøver fra ulike modell organismer (dvs., Danio, Drosophila, Daphnia, musen embryoet) som har gått gjennom eksempel forberedelse rørledningen ( Figur 3). Rekonstruerte 3D volumer av hele Danio, Daphniaog Drosophila fotografert av mikro-CT vises (Figur 4). Viktigere, som demonstrert av Danio prøven, kan disse prøver lagres for en lengre periode og gjenbrukes for flere tenkelig økter (figur 5).
Figur 1. Innebygging apparater. (A) en kort ble utformet for å lette innebygging bruker vanlig laboratoriet verktøy. (B) en cross-sectional illustrasjon av kortet. (C) innebygging apparatet etter innsetting av polyimid (pi) slangen på kortet punkt (a) og feste brønnene på kortet punktet (c). Kortet er (b) en overflyt kammer designet for å imøtekomme overskytende resin og beskytte brønnene mot kontaminering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Vellykket innebygde prøver er fri for luftbobler. (A) en innebygd 3 dager etter befruktning (dpf) larver sebrafisk uten luftboble. (B) en innebygd 3 dpf sebrafisk med en luftboble. Luft fanget under innebygging prosessen kan flytte mot prøven utvalget ikke er plassert vannrett under polymerisasjon. Skalere barer = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. En rekke prøver kan bygges med våre protokollen. (A) 7 dpf sebrafisk larve. (B) voksen Drosophila. (C) voksen Daphnia. (D) musen fosteret. Større prøver som musen embryoet enhetsvisningene av noen modifikasjoner til protokollen. Kort, polyimid (pi) slangen var fylt til 1/3 av sin lengde med harpiks og polymerized før innebygging. Fast og farget ble plassert over pre polymerized harpiks. Slangen var så fylt med un polymerized harpiks etterfulgt av en andre polymerisasjon. Polyimid (pi) slangen var fjernet før fotografering tillate bedre visualisering av prøven i dette tallet. Fjerning av slangen er ikke nødvendig for vellykket bildeopptak ved mikro-CT. skala barer: prøven bilder, 5 mm; forstørret insets, 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. 3-dimensjonale gjengivelser av innebygde. (A) rekonstruert 3 dpf sebrafisk Larven 0.743 × 0.743 × 0.743 µm3 voxel oppløsning. (B) rekonstruert voksen Daphnia (3 × 3 × 3 µm3 voxel oppløsning). (C) rekonstruert voksen Drosophila (3.1 × 3.1 × 3.1 µm3 voxel oppløsning). Digital tverrsnitt kan genereres i alle vinkler som vises i venstre kolonne. Overflaten gjengivelser vises til høyre, gjengis ved hjelp av kommersiell programvare. Innebygging harpiks kan sees i alle skanner utenfor prøven (angitt av *), men forstyrrer ikke prøven seg. Sebrafisk Larven ble avbildet på Argonne National Laboratory på Avansert Foton kilden som er synchrotron-basert. Den Daphnia eller Drosophila prøver ble fotografert med kommersielle X-ray mikroskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Prøver innebygd med våre protokollen kan være nytt fotografert med mikro-CT. Samme 5 dpf sebrafisk Larven ble avbildet i 2011 (A) og (B) 2013, som gjennomsnittlig intensitet anslag av sagittal visningen. Bildet sammenligning mellom skanninger etter lagring viser bevaring av anatomiske funksjoner. (C) et nærbilde av muskel fra både skanner presenteres, med segmenterte linjer indikerer tilsvarende områder brukes til (D) intensitet profil generasjon. Intensitet profiler normalisert til deres tilsvarende gjennomsnitt langs begge linjer viser romlig matchende lokale toppene i begge skanninger. (E) gjennomsnittlig intensitetsverdiene for utvalgte regioner i A og B tilhører bakgrunn (Bg, lilla), neuronal kjerner (N, grønn), hvit substans (W, blå), og muskel (M, oransje) ble delt på gjennomsnittlig bakgrunnen (hvit) og brukes til å generere signal-til-støy ratio (SNR), som tilsvarer tillegg mellom skanninger. Skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
I dette manuskriptet presenterer vi en detaljert protokoll for stive immobilisering av faste og farget millimeter skala (0,5 til 2,5 mm diameter) prøver for mikro-CT bildebehandling. Gitt den raske fremskritt av mikro-CT teknologi med hensyn til oppløsning og hastighet, er en metode for fast prøven bevaring med re-tenkelig evnene svært ettertraktet. Tradisjonelt tett innebygging harpiks er ofte brukt i elektronmikroskop for å gi strukturell støtte for å kutte ultrathin deler og minimere skaden å prøven. Vår metode tilpasset bruk for stive immobilisering under ikke-destruktiv bildebehandling. For å minimere tenkelig gjenstander fra tilstedeværelsen av overskytende resin, har vi implementert bruk av X-ray gjennomsiktig polyimid (pi) rør lage runde prøver uten kanter, og å begrense mengden harpiks rundt prøven.
Optimal utfallet av innebygging prosedyren er betinget av forsiktig kjøring av flere avgjørende skritt og oppmerksomhet til eksempel integritet i hele denne prosedyren. Faktisk vil skade prøven resultere i en kompromittert endelige bildet uavhengig av suksessen til gjennomføring av tenkelig. Siden kjøling bidrar til en reduksjon av smerte svar og unfixed vev forringer raskere ved høyere temperaturer, bruker vi pre kjølt reagenser. Store prøver må kuttes for å tillate oppføring av bindemiddel på innsiden av prøven slik at interne organer som lever, bukspyttkjertel og gut er helt fast. Unfixed vev svekkes og miste strukturelle integritet, ødelegge biologiske struktur. Et annet viktig skritt er å opprettholde prøven i sin naturlig justering. Derfor argumentere vi for bruk av flat bunn containere, som vi bruker hele prosedyren og er spesielt viktig i fiksering. Fixation i polypropylen rør eller konisk rør som vanligvis har en V-formet bunn bør unngås fordi de kan forårsake langstrakt prøver å bøye, som forvrenger naturlig morfologi av prøven. I tillegg for å minimere bruken av harpiks, er polyimid (pi) slangen indre diameter bare litt større enn bredden på prøven. Bøye av prøven kan også resultere i skade å prøven som den kommer inn slangen. Det anbefales også å overføre prøven til slangen i en naturlig frem måte å unngå skadelige ekstremiteter. Riktig dehydration er et kritisk steg. Dette oppnås med små intervaller av økende EtOH konsentrasjoner sakte erstatte vann med EtOH, som er mer blandbar med harpiks. Stor økning i EtOH konsentrasjon er forbundet med vev krymping og kan ameliorated av flere trinn på EtOH inkubasjon gjøre overgangen mer gradvis. Til slutt, for å minimere bevegelse av prøven eller luftlommer, hvis det er noen, prøvene er plassert vannrett under harpiks polymerisasjon (slutten av dag 4). Luftlommer eller fugemasse ved prøven forårsaker optisk gjenstander med X-ray imaging forbundet med kanten Diffraksjon, redusere bildekvaliteten.
Med hensyn til mulige endringer i protokollen, andre innebygging harpiks og metall flekker kan brukes i stedet for LR White akryl og PTA, henholdsvis. Embed812, en epoxy harpiks brukt i elektronmikroskop, er svært tyktflytende, vanskeligere å overføre, kan forårsake forvrengning av de og er forbundet med høyere bakgrunn enn akryl eller glykol methacrylate harpiks. Mens JB4 Plus, en glykol methacrylate, er mindre tyktflytende enn EMbed812 og har lavere bakgrunn, vises tilfeldig dannelsen av luftlommer ofte i prøven. Som nevnt, luftlommer bildekvaliteten og er spesielt problematisk for dyrebare prøver. Det er verdt å merke seg at Technovit 7100, en annen glykol methacrylate, forstyrrer PTA flekker, noe som resulterer i dårlig kontrast i det endelige bildet. Relativt, LR White akryl har vann-lignende viskositet, lav bakgrunn, og forstyrrer ikke PTA flekker. I våre hender er suksessrate på innebygging i LR hvitt uten eksempel skade eller luft bobler større enn 95%. For disse grunner talsmann vi bruken som innebygging harpiks for vev mikro-CT. Med hensyn til flekker, utfallet av ulike metall flekker som osmium tetroxide, jod, og PTA i mikro-CT bildebehandling har vært forhold og diskutert andre steder15,16,17 og er utenfor omfanget av dette manuskriptet.
Utvalgsstørrelsen er en stor begrensning til våre gjeldende protokollen. Siden vi bruker sugekraft overføre prøver til slangen, er muligheten til å se prøven avgjørende for retning og sikre at det er faktisk slangen. Som et resultat, sub millimeter eksempler som Bjørnedyr (dvs., vann bjørn) er ekstremt vanskelig å bygge fordi de krever bruk et mikroskop for å bli visualisert. Når sugekraft brukes, mikroskopiske prøver er lett tapt fra fokalplanet og bli utfordrende å gjenoppdage, gjør det vanskelig å avgjøre hvis de gikk langt gjennom tilknyttet enden av slangen. Større utvalgene, for eksempel mus embryoer, (3-10 mm) kan bygges med små modifikasjoner for innebygging protokollen (Figur 4 d). Spesielt var polyimid (pi) slangen fylt til 1/3 med flytende harpiks, som var polymerized før innebygging. Fast og farget prøven ble plassert over pre polymerized harpiks. Slangen var så fullt fylt med un polymerized harpiks og etterfulgt av en andre polymerisasjon.
Betydningen av våre innebygging protokollen er mangfoldige. Strengt immobilisert hele dyr eller vev prøver er ønskelig for grunner inkludert: (1) opprette langsiktig repositories av prøver som er vanskelige å generere eller forberede; (2) re-erverv av data. (3) aktivere seriell imaging bruker flere tenkelig modaliteter; og (4) gir standarder for kalibrering og teknologiutvikling. Med vår innebygging prosedyre er innkapslet i solid harpiksen som er motstandsdyktige mot skade og kan derfor enkelt lagres kanskje på ubestemt tid. Langtidslagring er spesielt nyttig for sjeldne eller møysommelig genererte prøver som de phenome prosjekter. Videre, som de digitale dataene går tapt, dataene blir generert fra den opprinnelige prøven. Evnen til å re-tenkelig over lang tid potensielt kan samme prøven å bli forhørt med mer avansert bildeteknologi modaliteter i fremtiden. Siden prøvene er fysisk stabil mellom tenkelig forekomster, er bilder kjøpt fra samme prøven i samme retning, tilrettelegge registrering mellom tidligere og senere datasett. For eksempel kan et lavoppløselig bilde tillater bare segmentering av vev i en sebrafisk larve. Samme Larven kan senere bli re-fotografert i høyere oppløsning slik at mer detaljert beregningsformelen analyser på mobilnettet oppløsning. Denne funksjonen for direkte sammenligning mellom registrerte skanninger foreslår harpiks-innebygd eksempler som en potensiell standard for teknologiutvikling av mikro-CT. Effektene av endringer til bildebehandling metode kan vurderes av imaging på samme utvalget slik at alle variabler i prøven forberedelse trinn er kontrollert. Endelig kan en harpiks-innebygd standard prøve brukes for instrumentet kalibrering for å teste for konsistensen av tenkelig.
Våre tidligere arbeid undersøker mutant og syke fisk histology viste at mobilnettet oppløsning oppdages av subtile unormalt vev struktur som er oversett i brutto eksamen dissecting mikroskop36eller lavt strømforbruk stereo mikroskop. Vi ønsker å utvide vår høyoppløselig analyser til prøver fra mennesker. Sebrafisk larvene, som omfatter hovedmotivet av vårt utviklingsarbeid, kan sammenlignes med menneskelig nål biopsier i deres skjørhet, mobilnettet og intercellulære vev heterogenitet, størrelse (1-3 mm diameter) og avlang form. Basert på vår erfaring med sebrafisk og annet arbeid viser at mikro-CT er farget og skannet menneskelig vev, om enn på lavere oppløsning37, forventer vi at våre tilnærminger å gi merverdi til bildebehandling og analyse av nålen biopsier. Vi har beregnet at montering av en kit tilstrekkelig for en forberedelse av opptil 20 prøver av samme tilstand skal være mindre enn 30 USD. Prøvene utarbeidet av våre innebygging metoden er motstandsdyktig mot skader og derfor lett å transportere. Den lave kostnader og enkel transport antyder muligheten for samling av eksempler fra hele verden, spesielt områder der mobilnettet oppløsning bildebehandling med mikro-CT ikke er tilgjengelig. Vår visjon er for høy oppløsning digitale filer av nålen biopsier (alt fra 0,1 til flere terabyte) å muliggjøre etableringen av en digital atlas av menneskelig vev, og samtidig la forskerne å finpusse og forbedre gjeldende analyse rørledninger for lokalisering og kvantitative karakterisering av mobilnettet og vev arkitektur i full 3D konteksten av vev skannet.
Disclosures
Alle forfatterne erklærer at det ikke er noen konflikter av interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Roland Myers for vennlig å gi de opprinnelige TEM-protokollene. I tillegg vil vi gjerne takke Dr. John Colbourne for å gi Daphnia prøven, Dr. Santhosh Girirajan for å gi Drosophila prøven og Dr. Fadia Kamal for å gi musen fosteret. Etterforskerne erkjenner finansiering støtte fra NIH (1R24OD18559-01-A2, PI: KCC), Jake Gittlen laboratoriene for kreftforskning, og piloten prisen finansiering fra PSU Huck institutter av biovitenskap og Institutt for CyberScience.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Phosphotunstic Acid | VWR | MK282402 | |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | MS-222 | |
| LR White | Electron Microscopy Sciences | 14380 | |
| Polyimide tubing (ID 0.04") | Nordson Medical | 141-0065 | The exact polyimide tubings described in the manuscript are no longer available. A close match is provided here. Tubing with custom diameter can be manufactured upon request. |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Oil-based soft modeling clay | Sculpey | S302 001 | |
| Micropipette P200 | Gilson | F123601 | |
| Micropipette P1000 | Gilson | F123502 | |
| Glass vials | VWR | 66015-042 | |
| V-shaped basin | VWR | 89094-676 | |
| Weigh boats | VWR | 10803-148 | |
| 200 μL yellow micropipette tip | Fisher Scientific | 02-707-500 | |
| 1 mL blue micropipette tip | Fisher Scientific | 02-681-163 | |
| Tabletop shaker | Thermolyne | M71735 | |
| Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 CCD | |
| X-ray microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa |
References
- Cheng, K. C., Katz, S. R., Lin, A. Y., Xin, X., Ding, Y. Whole-organism cellular pathology: a systems approach to phenomics. Advances in Genetics. 95, 89-115 (2016).
- Cheng, K. C., Xin, X., Clark, D., La Riviere, P. Whole-animal imaging, gene function, and the zebrafish phenome project. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 620-629 (2011).
- Vågberg, W., Larsson, D. H., Li, M., Arner, A., Hertz, H. M. X-ray phase-contrast tomography for high-spatial-resolution zebrafish muscle imaging. Scientific Reports. 5, 16625 (2015).
- Bruneel, B., et al. Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies. Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).
- Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
- Silvent, J., et al. Zebrafish skeleton development: High resolution micro-CT and FIB-SEM block surface serial imaging for phenotype identification. PLoS One. 12 (12), e0177731 (2017).
- Hur, M., et al. MicroCT-based phenomics in the zebrafish skeleton reveals virtues of deep phenotyping in a distributed organ system. eLife. 6, e26014 (2017).
- J, S. Whole-body imaging of a hypercholesterolemic female zebrafish by using synchrotron X-ray micro-CT. Zebrafish. 12 (1), 11-20 (2015).
- Hasamura, T., et al. Green tea extract suppresses adiposity and affects the expression of lipid metabolism genes in diet-induced obese zebrafish. Nutrition and Metabolism. 9 (1), 73 (2012).
- Meguro, S., Hasumura, T., Hase, T. Body fat accumulation in zebrafish is induced by a diet rich in fat and reduced by supplementation with green tea extract. PLoS One. 10 (3), e0120142 (2015).
- Dyer, E. L., et al. Quantifying mesoscale neuroanatomy using X-ray microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Perilli, E., Parkinson, I. H., Reynolds, K. J. Micro-CT examination of human bone: from biopsies towards the entire organ. Ann Inst Super Sanita. 48 (1), 75-82 (2012).
- Watz, H., Breithecker, A., Rau, W. S., Kriete, A. Micro-CT of the human lung: imaging of alveoli and virtual endoscopy of an alveolar duct in a normal lung and in a lung with centrilobular emphysema - initial observations. Radiology. 236 (3), 1053-1058 (2005).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Pauwels, E., Van Loo, D., Cornillie, P., Brabant, L., Van Hoorebeke, L. An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250 (1), 21-31 (2013).
- Kün-Darbois, J. D., Manero, F., Rony, L., Chappard, D. Contrast enhancement with uranyl acetate allows quantitative analysis of the articular cartilage by microCT: Application to mandibular condyles in the BTX rat model of disuse. Micro. 97, 35-40 (2017).
- Tang, S. Y., Vashishth, D. A non-invasive in vitro technique for the three-dimensional quantification of microdamage in trabecular. Bone. 40 (5), 1259-1264 (2007).
- Elliott, J. C., Dover, S. D. X-ray microtomography. Journal of Microscopy. 126 (Pt 2), 211-213 (1982).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping). PLoS Genetics. 2 (4), e61 (2006).
- Larsson, D. H., Vågberg, W., Yaroshenko, A., Yildirim, A. Ö, Hertz, H. M. High-resolution short-exposure small-animal laboratory x-ray phase-contrast tomography. Scientific Reports. 6, 39074 (2016).
- Pleissis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 5, 1011 (2017).
- Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321 (2013).
- Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, L. P., Henkelman, R. M. Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-CT. Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).
- Hsu, C. W., et al. Three-dimensional microCT imaging of mouse development from early post-implantation to early postnatal stages. Developmental Biology. 419 (2), 229-236 (2017).
- Luft, J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 409-414 (1961).
- Hayat, M. A., Giaquinta, R. Rapid fixation and embedding for electron microscopy. Tissue Cell. 2 (2), 191-195 (1970).
- Handschuh, S., Baeumler, N., Schwaha, T., Ruthensteiner, B. A correlative approach for combining microCT, light and transmission electron microscopy in a single 3D scenario. Frontiers in Zoology. 10, 44 (2013).
- Bushong, E. A., et al. X-ray microscopy as an approach to increasing accuracy and efficiency of serial block-face imaging for correlated light and electron microscopy of biological specimens. Microscopy and Microanalysis. 21 (1), 231-238 (2015).
- Tsao-Wu, G. S., Weber, C. H., Budgeon, L. R., Cheng, K. C. Agarose-embedded tissue arrays for histologic and genetic analysis. Biotechniques. 25 (4), 614-618 (1998).
- Sabaliauskas, N. A., et al. High-throughput zebrafish histology. Methods. 39 (3), 246-254 (2006).
- Copper, J. E., et al. Comparative analysis of fixation and embedding techniques for optimized histological preparation of zebrafish. Comparative Biochemistry and Physiology. 208, 38-46 (2018).
- Gürsoy, D., De Carlo, F., Xiao, X., Jacobsen, C. TomoPy: a framework for the analysis of synchrotron tomographic data. J Synchrotron Radiat. 21 (Pt 5), 1188-1193 (2014).
- Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21 (2), 10-15 (2013).
- Thomas, G. K. A molecular and systems biology analysis of pleiotropic vertebrate phenotypes (Doctoral dissertation). , Retrieved from the Penn State Electronic Theses and Dissertations Database (2009).
- Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano- tomography. Scientific Reports. 5, 10074 (2015).
