Summary
Biz protokolleri geliştirilen ve milimetre-ölçek örnekleri katıştırma etkinleştirmek için özel bir aparat tasarlanmış. Biz örnek hazırlama yordamları akrilik reçine ve katı immobilizasyon ve uzun süreli depolama örneklerin doku mimarisi ve hücre morfolojisi sorgulama için mikro-CT tarafından elde etmek için boru polimid gömme bir vurgu ile mevcut
Abstract
Histoloji her doku tespit ve karakterize tüm hücre tipleri verdiğinden yüz yıldır dokuların histolojik çalışma tıbbi tanı için altın standart olmuştur. Bizim Laboratuvar aktif Histoloji tanılama gücünü tam doku birimleri hücresel çözünürlükte çalışma getirecek X-ray mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-CT) teknolojik gelişmeler yapmaya çalışıyor (i.e., röntgen Histo-tomography modalite). Bu amaçla doğru örnek hazırlama boru hattı için hedeflenen yenilik yaptık. Bir anahtar optimizasyonu ve mevcut çalışma odak katı sabit ve lekeli milimetre ölçekli örnekler katıştırma için basit bir yöntem var. Örnek immobilizasyon ve bağdaşık mikro-CT görüntüleme için yayımlanmış yöntemlerin çoğu Parafin balmumu, özel veya alkol gibi sıvı örnekleri yerleştirme güveniyor. Bizim yaklaşım özel yordamlar ve x-ışınları için nispeten şeffaf olan örnekleri bir akrilik reçine doğrudan boru, polimid gömmek için bir 3 boyutlu yazdırılabilir aparatı tasarımı ile bu iş genişletir. Burada, örnek hazırlama yordamları 0,5 örneklerinden bütün zebra balığı larva ve gençlere, ya da hayvan için diğer uygun çapı 10 mm ve doku örnekleri ile benzer boyutlardadır için açıklanmıştır. Kavram kanıtı, Danio, Drosophila, Daphniave bir fare embriyo numuneler gömülü; 3 boyutlu inceden inceye gözden geçirmek için bu örnekler üçü temsilcisi görüntüleri gösterilir. Önemlisi, metodolojimiz katı immobilizasyon, yorucu oluşturulan kaynakları uzun vadeli korunması ve örnekleri yeniden sorguya yeteneği de dahil olmak üzere birden çok yarar için yol açar.
Introduction
Fenotipleri bir organizmanın genetik, arka plan ve çevre arasındaki benzersiz etkileşimler sonuçlarını temsil gözlemlenebilir özellikleri vardır. Bu özellikleri davranış, biyokimyasal, morfolojik, gelişimsel ve / fizyolojik özellikleri dahil edebilirsiniz. Önemlisi, özellikleri vahşi tipi organizmalar ve genetik mutantlar arasında farklılıklar mekanizmaları ve işlevleri etkilenen genlerin anahtar bilgi sağlayabilir. Morfoloji, saygı ile histopatoloji fenotipleri hücresel düzeyde değerlendirmek için altın standarttır ama mekanik yapılardan uğrar ve doğru nicel hacimsel Analizi1izin vermez. Bizim Laboratuvar Histoloji tanılama gücünü uygulamaya tam doku birimleri Mikronaltı çözünürlükte önündeki engelleri aşmak için motive.
Bir anket mevcut teknolojilerin görüntüleme X-ray tarafından mikro-tomografi (mikro-CT) ideal yetenekleri milimetre çaplı bütün hayvan 3 boyutlu (3D) Histoloji için gerekli sağlayabilir hesaplanan öneriyor. Mikro-CT non-yıkıcı, izotropik, 3D görselleştirme ve doku Mimarlık1,2kantitatif analizini yeteneği sağlar. Son yıllarda, günahı ve metal lekeli zebra balığı mikro-CT tarafından 3D görüntüleme artan çekiş kazanmıştır ve kas, diş, kemik ve yağ dokuları3,4 de dahil olmak üzere çeşitli dokuların hacimsel analiz için kullanılan ,5,6,7,8,9,10. Diğer model organizmalar ve doku örnekleri de mikro-CT görüntüleme için mükellef bulunmaktadır. Örneğin, bir boru hattı yoğun mesoscale nöroanatomi, via sinkrotron mikro-CT11görüntüsü fare beyinlerinin miktarının için getirilmiştir. Benzer şekilde, eozin tabanlı bir boyama protokol tüm fare organlar12yumuşak doku mikro-CT görüntüleme için uygun olarak gösterilmiştir. Günahı insan L3 vertebra xarakteristikaları Analizi ve görselleştirme insan akciğer gümüş lekeli mikro-CT istimal belgili tanımlık yarar, bu teknolojinin insan için13,14örnekleri göstermiştir.
Mikro-CT olduğu gibi küçük hayvan ve doku örnekleri tam morfolojik fenotipleme için büyük vaadi gerçekleştirmek için üretilen iş, çözünürlük, görünüm alanı, kapsamlı hücre boyama ile ilgili olarak aşılması gereken Engelli bir dizi gerekir, ve uzun vadeli koruma. Her biri bu yönleriyle kritik öneme sahip iken, örnek fiksasyon ve boyama ile ilgili ek notlar ile gömme yordamlar optimizasyonu mevcut el yazması odak noktasıdır. Mikro-CT görüntüler farklı yumuşak dokular arasındaki doğal kontrast düşük olduğundan heavy metal boyama faydalıdır. Osmiyum tetroxide, iyot, phosphotungstic asit (PTA) ve gallocyanin-chromalum gibi çeşitli metal potens lekeleri, mikro-CT görüntüleme için kontrastı artır okudu15,16,17olmuştur. Uranyl asetat, kemik ve kıkırdak18,19mikro-CT görüntüleme için zıt bir ajan olarak da kullanılmıştır. Bizim iletişim kuralında kullanılan okul aile birliği tutarlı neredeyse tüm dokuların boyama için yol açar ve tüm zebra balığı numuneler, görüntüleri bu verimli hücrelerinde potansiyel Histoloji benzeri çalışmalar sayesinde tam birimler doku ile uyumlu.
Mikro-CT resim alma sırasında bir 2-boyutlu (2D) projeksiyon örnek bir ölçüde bir kısmı tarafından döndürülmüş olarak alınan ve örnek binlerce 2D projeksiyonları için kullanılan bir dizi üreten bir 360 ° veya 180 ° dönüş tamamlanıncaya kadar tekrarlanan 3B cilt20yeniden inşası. Bu süreçte herhangi bir pertürbasyon örnek dışarı uyum, kötü yeniden oluşturulan 3B cilt olarak sonuçlanan olmak karşılık gelen 2D projeksiyonlar neden olur. Örnek immobilizasyon için bu sorunu gidermek için bir yoldur ve alkol örnekte batış veya özel polipropilen borular veya micropipette ipuçları3,5,15, içinde katıştırma geçerli bazı stratejiler içerir 16 , 21 , 22. örnek hareketi sırasında resim alma 3D birimleri23ötelenen rekonstrüksiyonlar içinde kaynaklanan görüntü kümesi arasındaki ortaya çıkabileceğinden sıvı daldırma yöntemleri ideal değildir. Ayrıca, sıvı saklanan doku örnekleri fiziksel kararlılığını zavallı zaman ölçeklerde ay yaş, kimyasal dengesizlik ve yüzey aşınma örnek ve konteyner duvar (arasında temas noktaları hareketi ile ilişkili bir sonucu olarak bilinen Kişisel gözlemler sabit hayvan ve insan doku örnekleri ile).
Görüntüleme sırasında örnek hareket olasılığını azaltmak için örnekleri özel24,25,26yılında katıştırılabilir, ancak bu uygulama böylece görüntü azaltarak özel difüzyon leke riski ile ilişkilidir kontrast26. Ayrıca, sıvı veya özel ürünleri fiziksel hasar eğilimli olduğunu ve zaman içinde onları uzun vadeli örnek muhafazası için uygun olmayan hale bozulmasına yol açar. Bir potansiyel olarak başarılı ve basit bir örnek immobilizasyon Yöntem elektron mikroskobu numuneler için kullanılandan adapte olabilir gerekçeli. Polimerli reçineler EPON (üretilmiyor ve EMbed 812 tarafından değiştirilir) 812 gibi elektron mikroskobu27,28ultrathin bölümler oluşturmak için gereken sertlik sağlamak için yaygın olarak kullanılır. Nitekim, birkaç karşılaştırmalı çalışmalar röntgen görüntüleme ve elektron mikroskobu arasında reçine gömülü örnekleri tarafından x-ışını mikroskobu29,30yansıması göstermiştir. Ancak, bazı elektron mikroskobu standart uygulamalar doğrudan mikro-CT görüntüleme için tercüme değil. Örneğin, reçine kenarları tipik reçine blokların mikro-CT görüntüleme örnekleri ile kare ve bu blok kesme örnekleri ile görüntülemede engelleyebilir kenar kırınım eserler ile ilişkili. Mümkün, süre reçine kenarları yumuşatma zahmetli ve zaman alıcı.
Plastik gömme reçine çeşitli istihdam edilmektedir iken elektron mikroskobu, Embed 812 gibi sert reçine ile ilişkili yüksek arka plan diğerleri test bize yol açtı. Biz LR beyaz düşük viskoziteli, düşük çekme, form baloncuklar düşük eğilim nedeniyle polimerizasyon ve alt arka plan sırasında seçti. Kenar ücretsiz örnekleri oluşturmak ve örnek çevreleyen reçine miktarı en aza indirmek için polimid boru polimerizasyon önce içine sıvı reçine numuneler çizmek için protokolleri geliştirdik. Tüp kaldırılması görüntüleme için gerekli değildir polimid yüksek termal istikrar ve yüksek x-ışını geçirgenliği yükseltebileceği etkili oldu. Son olarak, bir özel micropipette bağdaştırıcısı gömme tekniği güvenilir tüp tutun ve Mikropipetler kontaminasyonu önlemek için bizim örnek için tasarlanmış. Bağdaştırıcı 3D CAD yansıma dosyasından basılmış olabilir. Birlikte ele alındığında, burada sunulan örnek hazırlama yöntemleri amacı küçük örnekleri daha doğru sözlü gömme yapmak için gelişmiş kontrast, katı immobilizasyon ve bozulmamış milimetre çaplı örneklerin uzun süreli depolama boyama olduğunu.
Protocol
Canlı hayvanlar üzerinde tüm yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Pennsylvania State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. gün 1: fiksasyon
- Fiksasyonun artırmak ve bağırsak içeriği hacmini azaltmak için en az 24 s bir 10 mm örnek için ya da uzun süre daha büyük örnekler için Juvenil Balık açlıktan (Örn., 14 mm numune için 72 h).
- % 10 ön chill tarafsız arabelleğe alınmış Formalin (NBF) ve 2 x Tricaine-S (MS-222, 400 mg/L) buz ile 4 ° c
- Çift balık su ile soğutulmuş 2 Birim x MS-222 hızlı ve insancıl ötenazi için.
- 30 için bekle s (larvaları) 60 s (gençlere) balık sonra durur hareket.
- Soğutulmuş %10 balıkta bırakın NBF 10 dk için.
- Balık soğutulmuş % 10 NBF çözüm oda sıcaklığında düz oturaklı kaplarda gecede düzeltin.
Not: Düz oturaklı kapsayıcılar numune bükme en aza indirmek gerekir. Sabitleştirici hacmi ve çözümleri tüm sonraki adımların en az 20 kez numune hacmi aksi belirtilmedikçe olmalıdır. 1-5 larva zebra balığı için en az 1 mL önerilen çözüm birimdir. Zavallı fiksasyon yetersiz sabitleştirici sonuçlarında ve reaktif hacmi bir fazlalık değil olumsuz açıklanan yordamı sonucu. Büyük balık tam fiksasyonu için biraz anal gözenek anterior başlayan karın kesti. İç organlarına zarar en aza indirmek için kesim sırasında balık uzak yumuşak güç uygulayarak ve en az penetrasyonu makas ya da bıçak kullanın. Fiksasyon protokolleri-si olmak be başkaları tarafından31,32,33tanımladı.
2. 2. gün: Dehidratasyon & boyama
- Sabit örnekler 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) pH 7,4 10 min için x 3 kez yıkayın.
- Nazik ajitasyon ile Oda sıcaklığında 20 dk için % 35 etil alkol (alkol) örneklerinde daldırın.
Not: tüm nazik ajitasyon adımlar için masa üstü bir shaker kullanın ve dikkatle darbeleme ve örnek konteyner yüzeyler karşı sürtünme kaçınarak karıştırma bir efekt için ayarlayın. - % 50 örneklerinde daldırın alkol nazik ajitasyon ile Oda sıcaklığında 20 dakika.
- Phosphotungstic asit (PTA) toz % 1 w/v hisse senedi çözüm hazırlamak için su geçiyoruz.
- % 1 okul aile birliği hisse senedi çözüm 3:7 içinde %100 seyreltik alkol % 0,3 okul aile birliği boyama çözüm elde etmek için.
- % 0,3 okul aile birliği çözüm nazik ajitasyon ile Oda sıcaklığında gecede örneklerinde leke.
3. gün 3: infiltrasyon
- 1:1 v/v % 100 alkol ve LR beyaz akrilik reçine karışımı hazırlamak ve bir kenara koyun.
- Durulama 3 kez % 70 alkol 10 dk için.
- % 90 örneklerinde daldırın alkol nazik ajitasyon ile Oda sıcaklığında 30 dakika.
- % 95 örneklerinde daldırın alkol nazik ajitasyon ile Oda sıcaklığında 30 dakika.
- % 100 iki kez örneklerinde daldırın alkol nazik ajitasyon ile Oda sıcaklığında 30 dakika.
- Gecede, oda sıcaklığında hafif ajitasyon ile 1:1 alkol ve LR beyaz akrilik reçine karışımı örneklerinde daldırın.
4. gün 4: gömme
- LR beyaz reçine nazik ajitasyon ile Oda sıcaklığında 2 h için % 100 örneklerinde daldırın.
- 4.1. adımda reçine taze % 100 LR ile yerine beyaz reçine ve nazik ajitasyon ile Oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
- Gömme cihazı (resim 1) bir araya getirin.
- Uygun çap ve uzunluk polimid tüp kesti.
Not: En az 0,1 mm numune çapı daha büyük bir iç çapı ile tüp önerilir. Tipik örnekler için her örnek için standart uzunluğu 30 mm boru kullanılır. İstendiğinde, uzun örnekler daha uzun boru kullanarak yerleştirilebilir.- P1000 micropipette geniş gömme bağdaştırıcısı sonuna eklemek ve dar sonuna (Şekil 1 c) polimid tüp takın. Gömme bağdaştırıcı yoksa, adım 4.3.3 e gidin. Aksi halde, adım 4.4 için devam edin.
- Micropipette bahşiş ucunu düz böyle rahatça polimid boru uygun küçük. 44 mm geniş sonuna 200 µL sarı micropipette bahşiş için 0.0403" kesim boru ve 1 mL Mavi İpucu için 0,105" altından 59 mm boru. Gerektiği şekilde düzeltin.
- Kes micropipette ipucu bir micropipette ekleyin.
- Bir küçük tartmak tekne ya da V-şekilli çözüm Havzası örnekleri aktarmak ve tamamen % 100 örneklerinde daldırın LR beyaz reçine.
- Gömme aparat kimden adım 4.3 boru sabit örneği (veya baş hayvan numuneler durumunda doğru) geniş sonunda amaç ve numune yavaş yavaş içine tüp pipette. Örnek tüp ortasında konumlandırın ve boru üstündeki ve altındaki örnek reçine ile dolu olun.
- Öyle ki örnek doğal, ileriye doğru yönde hareket ediyor örnek içine tüp pipette.
Not: Yavaş pipetting hava kabarcıkları ve aşınmaya karşı boru kenar tarafından numune hasarları önler. Geriye doğru hareket tüp içine ekstremitelerde (bacaklarda, kanatlar, palet, vb) kolayca zarar verebilir. Bu daha sonra hava boru kaldırma sırasında girmek değildir bazı reçine taşma alanında gömme cihazı izin için tavsiye edilir.
- Öyle ki örnek doğal, ileriye doğru yönde hareket ediyor örnek içine tüp pipette.
- Hemen yağ bazlı yumuşak modelleme kil ile açık son mühür.
- Kil 1 mm kalınlığında levha düzleştirin.
- Dizin ve orta parmak arasında boru stabilize.
- Yavaş yavaş kil başparmak ile boru sonuna karşı tuşuna basın.
- Aşırı kil kaldırın.
- Gömme cihazı micropipette kaldırın.
- Nazik döndürme tarafından boru dışarı çekin ve kil ile diğer ucunu mühür.
- Bir parmak kil çýkartýlmasýný önlemek için karşı kapalı ucunu tut.
- Yavaş yavaş mühürsüz sonuna hortumunun kil itin.
- Tüp yer yatay ve reçine 65 ° C'de 24 h için polimerize
Not: Yatay yerleşim polimerizasyon sırasında örnek hareketi önler. Eğer az miktarda hava adım 4,8 tuzak, hava kabarcığı ucu biraz örnek doğru hava kabarcık hareketi önlemek için bu yükseltilmiş olacak. Önemlisi, çok fazla yükseklik polimerizasyon sırasında numune yerçekimi nedeniyle düşük sonuna doğru düşmeye neden olabilir. Düzgün katıştırılmış bir örnek bir kırılma hava/reçine arabirimleri üzerinden görüntü kalitesi (Şekil 2) düşürebileceğinden hangi kaçınılmalıdır bir hava kabarcığı ile karşılaştırıldığında gösterilir.
5. gün 5: koleksiyon
- Gün 5 sonundaki resim alma için örnekler toplamak.
Not: Polimid boru kaldırılması mümkün ama görüntüleme için gerekli değil. Sinkrotron tabanlı mikro-CT görüntüleme zebra balığı örnek için Beamline 2-BM, Gelişmiş foton kaynak (APS) Argonne Ulusal Laboratuvarı (Lemont, IL, USA) içinde de gerçekleştirildi. Okul Aile Birliği lekeli zebra balığı için bir en iyi x-ışını enerji aralığı 5-30 keV belirlendi ve 13,8 x-ışını enerjisini keV için kullanılan görüntüleme. 1501 projeksiyonlar 13,8 elde keV üzerinde 180 derece (1 projeksiyon 0,12 her derece) 2048 2048 piksel kamera ile. Ayrıca, iki düz-alan (kazanç) resim (tek başına) ve bir satın alma sonunda ve bir karanlık alan resim da elde. Düz- ve karanlık alanları düzeltme, yüzüğü artefaktı azaltma ve görüntü yeniden yapılanma yapılır açık kaynak TomoPy araç seti34. Okul Aile Birliği lekeli Daphnia ve Drosophila örnekleri üzerinde bir x-ışını mikroskobu12,35görüntüsü. Belirli mikro-CT ayarları nesne ve leke kalitesine bağlıdır. Örneğin, Drosophila numune 40 kVp, 74 taranan mA ve 15 s 3.10 3.10 × × 3.10 µm3Voksel çözünürlükte.
Representative Results
Protokol örnek hazırlama yordam için tüm zebra balığı larva ve gençlere mikro-CT görüntüleme için ayrıntıları açıklanan. Özellikle, bu yöntem diğer örnekleri türleri kolayca adapte (Örn., Drosophila, Daphnia, Arabidopsis, fare organları). Çeşitli adımlar kuluçka zamanlarında zebra balığı larva ve benzer boyuttaki örnekler için uygundur; daha büyük örnekleri daha uzun kuluçka gerektirebilir. Adımları katıştırma örnek ile yardımcı olmak için ve 1 mL micropipette vermektedir (Şekil 1) boru polimid çeşitli boyutları için özelleştirilebilir bir bağdaştırıcı tasarlanmıştır. Bu özel bağdaştırıcı bu el yazması ile ilişkili ve http://publications.chenglab.com/LinEtAlJOVE/ adresinden yüklenebilir bir CAD dosyasından baskılı 3D yapıldı. Tüm okuyucuların bir 3D yazıcıya erişiminiz olmayabilir beri micropipette ipuçlarını kullanarak bir ev yapımı gömme aparatı Meclisi Protokolü (adım 4.3) açıklanmıştır. Başarıyla katıştırılmış zebra balığı larva ile büyük olasılıkla görüntü kalitesi düşer bir hava kabarcığı (Şekil 2) bir örnek göre gösterilir. Gömme işlemi çok yönlülük göstermek için biz göstermek örnekler çeşitli model organizmalar (i.e., Danio, Drosophila, Daphnia, fare embriyo) örnek hazırlama boru hattı (gitmiş Şekil 3). Mikro-BT ile yansıma tüm Danio, Daphniave Drosophila örneklerin yeniden oluşturulan 3D birimleri (Şekil 4) gösterilmektedir. Önemlisi, Danio örnek tarafından gösterildiği, bu örnekler uzun bir süre için depolanan ve birden çok görüntüleme oturum (Şekil 5) yeniden.
Şekil 1. Cihaz katıştırmayı. (A) bir bağdaştırıcı ortak laboratuvar araçları kullanarak katılmasını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır. (B) bağdaştırıcı bir kesit çizimi. (C) ekleme noktası bağdaştırıcısı (a), polimid hortumunun sonra aparatı gömme ve micropipette (c) bağdaştırıcısı noktada ekleme. Bağdaştırıcı kesimdir (b) aşırı reçine uyum ve micropipette kirlenme korumak için tasarlanmış bir taşma odası. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Başarıyla katıştırılmış örneklerden olan hava kabarcıkları yoksun. (A) bir katıştırılmış 3 gün sonrası döllenme (dpf) larva zebra balığı hava kabarcığı olmadan. (B) bir hava kabarcığı ile bir katıştırılmış 3 dpf zebra balığı. Örnek yatay olarak polimerizasyon sırasında koymamış durumunda gömme işlemi sırasında sıkışmış hava numune doğru taşıyabilirsiniz. Ölçek çubukları = 1 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Çok çeşitli örnekler-ebilmek var olmak embedded ile bizim protokolü. (A) 7 dpf zebra balığı larva. (B) Yetişkin Drosophila. (C) Yetişkin Daphnia. (D) fare embriyo. Fare embriyo gibi daha büyük örnekler iletişim kuralı için bir kaç değişiklik tarafından barındırılabilir. Kısaca, polimid boru 1/3 uzunluğu için reçine ile dolu ve katıştırma önce polimerli. Sabit ve lekeli örnek önceden polimerli reçine üzerine yerleştirildi. Tüp sonra ikinci bir polimerizasyon tarafından takip un polimerli reçine ile doluydu. Polimid boru fotoğraf örnek daha iyi görselleştirme bu şekilde izin vermek için önce kaldırıldı. Tüp kaldırılması başarılı resim alma tarafından mikro-CT ölçek çubukları için gerekli değildir: örnek resimler, 5 mm; insets, 1 mm. genişlemiş Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. 3 boyutlu render katıştırılmış örneklerin. (A) 3 dpf zebra balığı larva 0.743 × 0.743 × 0.743 µm3 Voksel çözünürlükte yeniden. (B) Yetişkin Daphnia (3 × 3 × 3 µm3 Voksel çözünürlük) yeniden. (C) Yetişkin Drosophila (3.1 x 3.1 x 3.1 µm3 Voksel çözünürlük) yeniden. Dijital kesit sol sütunda gösterildiği gibi herhangi bir açıda oluşturulabilir. Yüzey kaplamalar sağ tarafta gösterilen ticari yazılım kullanılarak dönüştürülen. Örnek dışında tüm taramaları reçine katıştırma görülebilir (tarafından belirtildiği *), örnek ile müdahale değil ama. Zebra balığı larva Argonne Ulusal Laboratuvarı sinkrotron tabanlı gelişmiş foton kaynak görüntüsü. Daphnia veya Drosophila numuneler ile ticari bir x-ışını mikroskobu görüntüsü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5. Bizim iletişim kuralıyla gömülü örnekleri-ebilmek var olmak yeniden mikro-CT ile görüntülü Aynı 5 dpf zebra balığı larva 2011 (A) ve (B) 2013 sagittal görünümü ortalama yoğunluk projeksiyon sunulan, görüntüsü. Görüntü depolama anatomik özellikleri korunması gösterdikten sonra taramalar arasında karşılaştırma. Karşılık gelen bölgeler (D) yoğunluk profil üretimi için kullanılan gösteren kesimli çizgili kas her iki taramaları close-up (C) A sunulur. Her iki doğrultuda karşılık gelen onların Ortalamalar için normalleştirilmiş yoğunluğu profilleri dağınık şekilde eşleşen yerel tepeler her iki taramaları göster. (E) Ortalama Yoğunluk değerleri seçilen bölgelerin a ve B, nöronal hücre çekirdeği (N, yeşil) (Bg, mor), arka planına ait beyaz madde (W, mavi), kas (M, turuncu) arka plan (beyaz) için Ortalama bölünen ve parazit sinyal oluşturmak için kullanılan de taramalar arasında karşılık oranları (SNR). Ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bu makale, biz (0.5-2.5 mm çap) numuneler mikro-CT görüntüleme için sabit ve lekeli milimetre ölçek katı immobilizasyon için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Çözünürlük ve hız açısından mikro-CT teknolojinin hızlı ilerlemek göz önüne alındığında, bir yöntem kalıcı örnek koruma yetenekleri yeniden görüntüleme ile son derece arzu edilir. Geleneksel olarak, yoğun gömme reçine sık elektron mikroskobu ultrathin bölümleri kesmek ve numune hasarı en aza indirmek için yapısal destek sağlamak için kullanılır. Bizim yöntem kullanımı tahribatsız görüntüleme sırasında sert immobilizasyon için uyarlanmış. Aşırı reçine varlığı görüntüleme yapılardan en aza indirmek için biz x-ışını şeffaf polimid boru olmadan kenarları yuvarlak örnekleri oluşturmak ve reçine örnek etrafında hacmi kısıtlamak için kullanımı hayata geçirdik.
Gömme işlemi en iyi sonucu dikkatli yürütülmesi birkaç önemli adımlar ve örnek bütünlük prosedürü boyunca dikkatleri üzerine şartlı olduğunu. Nitekim, örnek zarar bir uzlaşma son görüntü yürütme görüntüleme başarısı ne olursa olsun neden olur. Tüyler ürpertici ağrı yanıt bir azalma katkıda bulunur ve sabitlenmemiş doku daha hızlı daha yüksek sıcaklıklarda düşer, biz önceden soğutulmuş reaktifler kullanmanız. Büyük örnekler karaciğer, pankreas ve gut gibi iç organları tamamen sabit böylece sabitleştirici giriş örnek iç izin vermek için kesmek gerekir. Sabitlenmemiş dokuları bozulmaya ve yapısal bütünlük biyolojik yapısı yok, kaybetmek. Başka bir önemli adım numune onun doğal uyum içinde muhafaza etmektir. Bu nedenle, yordam ve fiksasyon sırasında özellikle önemli olan boyunca kullandığımız düz oturaklı kapsayıcılar kullanımı için savunucusu. Fiksasyonu polipropilen borular veya eğmek uzun örnekleri neden olabilir çünkü genellikle V şeklinde alt var konik tüpler hangi örnek doğal morfolojisi bozan kaçınılmalıdır. Buna ek olarak, reçine kullanımını en aza indirmek için polimid boru iç çapı sadece örnek genişliğinden biraz daha büyük. O tüp girerken numune bükme de zarar numune için neden olabilir. Ayrıca örnek boru içine zararlı ekstremitelerde önlemek için doğal bir ileriye doğru şekilde aktarmak için önerilir. Uygun su kaybı kritik bir adımdır. Bu yavaş yavaş su hangi daha reçine ile karışan alkol ile değiştirmek için alkol konsantrasyonu artan küçük artışlarla gerçekleştirilir. Alkol konsantrasyonu büyük artışlar doku büzülme ile ilişkili olan ve daha kademeli geçiş yapmak için alkol kuluçka ek artırmalarla iyileştirmiştir. Son olarak, eğer varsa numune veya hava cepleri, hareketi en aza indirmek için örnekleri yatay reçine polimerizasyon (son gün 4) sırasında yerleştirilir. Hava cepleri veya numune yanındaki dolgu macunu optik eserler görüntü kalitesi azaltılması kenar bükülmesi ile ilişkili röntgen görüntüleme ile neden olur.
Protokol, diğer gömme reçineler ve metal olası değişiklikler ile ilgili olarak lekeleri kullanılabilir LR beyaz akrilik ve Okul-Aile Birliği, yerine sırasıyla. Embed812, elektron mikroskobu, yaygın olarak kullanılan bir epoksi reçine çok viskoz, aktarmak daha zor, numuneler bozulma neden olabilir ve akrilik veya glikol metakrilat reçineleri daha yüksek arka plan ile ilişkilidir. JB4 Ayrıca, glikol metakrilat EMbed812 daha az yapışkan ve alt arka plan var iken, hava cepleri rastgele oluşumu sık sık numune civarında görünüyor. Belirtildiği gibi hava cepleri görüntü kalitesini düşürebilir ve değerli örnekleri için özellikle sorunlu. Bu Technovit 7100, başka bir glikol metakrilat, Okul Aile Birliği boyama ile son resimdeki zavallı kontrast sonuçlanan engelleyen dikkati çekiyor. Nispeten, LR Beyaz Akrilik su benzeri viskozite, düşük arka plan, vardır ve okul aile birliği boyama ile müdahale değil. Bizim ellerde LR beyaz örnek hasar veya hava kabarcıkları katıştırma başarı oranı % 95'den büyüktür. Bu nedenlerden dolayı biz gömme reçine olarak kullanmak için doku mikro-CT Temsilciliği Lekeleri, ile ilgili olarak çeşitli metal sonucu gibi osmiyum tetroxide, iyot, lekeleri ve okul aile birliği mikro-CT görüntülemede karşılaştırılmış ve başka bir yerde ele15,16,17 olmuştur ve bu kapsamı dışında el yazması.
Örnek boyutu bizim geçerli protokol için büyük bir kısıtlamadır. Biz numuneler boru içine aktarmak için emme istihdam beri numune görebilme olanağı yönlendirme ve tüp içinde gerçekten sağlamak için önemlidir. Sonuç olarak, Tardigrade gibi alt milimetre örnekleri (i.e., su ayılar) görüntülenmeyecektir için mikroskop kullanımı gerektirdiğinden katıştırmak son derece zordur. Emme uygulandıktan sonra mikroskobik örnekleri odak düzlem kolayca kaybolur ve tüp ekli sonuna doğru çok ileri geçti belirlemek üzere yeniden keşfetmek için zor olur. Fare embriyolar, (3-10 mm) gibi daha büyük örnekleri gömme protokolüne (Şekil 4 d) hafif değişiklikler ile gömülü olabilir. Özellikle, polimid boru 1/3 katıştırma önce polimerli hangi sıvı reçine ile doluydu. Sabit ve lekeli örnek önceden polimerli reçine üzerine yerleştirildi. Tüp sonra tam un polimerli reçine ile dolu ve ikinci bir polimerizasyon tarafından takip.
Bizim gömme Protokolü önemini manifold geçerli. Katı immobilize bütün hayvan ya da doku örnekleri gibi nedenlerle arzu: (1) uzun vadeli depoları oluşturmak veya hazırlamak; zor örnekleri oluşturma (2) yeniden kazanılması veri; (3) seri görüntüleme birden çok görüntüleme yöntemleri kullanarak etkinleştirme; ve kalibrasyon ve teknoloji geliştirme (4) sağlayan standartları. Gömme prosedürü ile hazırlanan örnekleri hasara karşı dayanıklı sağlam reçine kaplı ve kolayca bu nedenle belki de süresiz olarak depolanabilir. Uzun süreli depolama nadir veya yorucu oluşturulan örnekler gibi bu phenome projeleri ile ilgili özellikle yararlıdır. Ayrıca, dijital veri kaybolur olay bu verileri özgün örneğinden oluşturulabilir. Uzun bir süre boyunca potansiyel olarak yeniden görüntüleme yeteneği ile sorgulanmak aynı örnek daha gelişmiş yöntemleri gelecekte görüntüleme sağlar. Örnekleri görüntüleme örnekleri arasında fiziksel olarak kararlı olduğundan, önceki ve sonraki veri setleri arasında kayıt kolaylaştırmak aynı numune aynı yönde gelen görüntüleri elde. Örneğin, düşük çözünürlüklü bir görüntü sadece segmentasyon dokuların bir zebra balığı larva izin verebilir. Böylece hücresel çözünürlükte hesaplama analizleri ayrıntılı aynı larva daha sonra daha yüksek çözünürlükte yeniden yansıması. Mikro-CT teknoloji gelişimi için standart bir potansiyel olarak reçine gömülü örnekleri kayıtlı taramalar arasında doğrudan karşılaştırma için bu özelliği göstermektedir Görüntüleme yöntemi için herhangi bir değişiklik etkisi örnek hazırlık adımda tüm değişkenleri kontrol edilir böylece aynı örneğini görüntüleme tarafından tespit edilebilir. Son olarak, bir reçine gömülü standart örnek aleti kalibrasyon için görüntüleme tutarlılık için test etmek için kullanılabilir.
Hücresel çözünürlük brüt sınavı-diseksiyon mikroskop36veya düşük güç kullanarak gözden kaçan ince doku yapısı anormallikleri algılanmasını sağlar mutant ve hastalıklı balık Histoloji incelenmesi bizim önceki çalışma gösterdi stereo mikroskop. Bizim yüksek çözünürlüklü analizleri için insan örnekleri genişletmek istiyoruz. Bizim geliştirme çalışmalarının birincil konu oluşturan, zebra balığı larva insan iğne biyopsileri kırılganlık, hücresel ve hücreler arası doku heterojenite, boyutu (1-3 mm çapında), ve uzun şekil benzer. Bizim zebra balığı ve mikro-CT başarıyla lekeli ve insan dokusu, inceden inceye gözden geçirmek daha düşük çözünürlük37de olsa gösterilen diğer çalışma ile geniş bir deneyimim dayanarak, görüntüleme ve analiz iğne biyopsileri katma değer getirmek bizim yaklaşımlar bekliyoruz. Bu tahmini var potansiyel olarak az 30 YTL olmak bir hazırlık aynı durumda 20 örnekleri için yeterli bir kit montaj. Bizim Gömme yöntemi tarafından hazırlanan fiziksel hasara karşı ve bu nedenle kolay taşıma için örneklerdir. Düşük maliyet ve taşıma kolaylığı örnekleri topluluğu olasılığı dünya çapında, hücresel kararlılık düşsel mikro-CT ile kolayca erişilebilir değil alanlarda özellikle tavsiye ederim. Vizyonumuz iğne biyopsileri (0,1 birkaç terabayt arasında), yüksek çözünürlüklü dijital dosyaları için dijital bir atlas insan dokuların oluşumunu ve aynı zamanda rafine ve geçerli analiz boru hatları için geliştirmek araştırmacılar sağlar etmektir Yerelleştirme ve inceden inceye gözden geçirmek belgili tanımlık doku tam 3D bağlamında cep ve doku mimarisinin nicel karakterizasyonu.
Disclosures
Tüm yazarların çıkarlarını hiçbir çatışmalar vardır bildirin.
Acknowledgments
Yazarlar Roland Myers lütfen orijinal TEM protokolleri sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Buna ek olarak, Dr John Daphnia örnek sağlamak için Colbourne, Dr. Santhosh Drosophila örnek sağlamak için Girirajan ve Dr. Fadia Kamal fare embriyo sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Müfettişler NIH desteğinden fon kabul (1R24OD18559-01-A2, PI: KCC), Jake Gittlen laboratuvarlar kanser araştırmaları için ve PSU Huck Enstitüleri yaşam bilimleri ve CyberScience Enstitüsü pilot ödül fon üzerinden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Phosphotunstic Acid | VWR | MK282402 | |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | MS-222 | |
| LR White | Electron Microscopy Sciences | 14380 | |
| Polyimide tubing (ID 0.04") | Nordson Medical | 141-0065 | The exact polyimide tubings described in the manuscript are no longer available. A close match is provided here. Tubing with custom diameter can be manufactured upon request. |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Oil-based soft modeling clay | Sculpey | S302 001 | |
| Micropipette P200 | Gilson | F123601 | |
| Micropipette P1000 | Gilson | F123502 | |
| Glass vials | VWR | 66015-042 | |
| V-shaped basin | VWR | 89094-676 | |
| Weigh boats | VWR | 10803-148 | |
| 200 μL yellow micropipette tip | Fisher Scientific | 02-707-500 | |
| 1 mL blue micropipette tip | Fisher Scientific | 02-681-163 | |
| Tabletop shaker | Thermolyne | M71735 | |
| Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 CCD | |
| X-ray microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa |
References
- Cheng, K. C., Katz, S. R., Lin, A. Y., Xin, X., Ding, Y. Whole-organism cellular pathology: a systems approach to phenomics. Advances in Genetics. 95, 89-115 (2016).
- Cheng, K. C., Xin, X., Clark, D., La Riviere, P. Whole-animal imaging, gene function, and the zebrafish phenome project. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 620-629 (2011).
- Vågberg, W., Larsson, D. H., Li, M., Arner, A., Hertz, H. M. X-ray phase-contrast tomography for high-spatial-resolution zebrafish muscle imaging. Scientific Reports. 5, 16625 (2015).
- Bruneel, B., et al. Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies. Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).
- Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
- Silvent, J., et al. Zebrafish skeleton development: High resolution micro-CT and FIB-SEM block surface serial imaging for phenotype identification. PLoS One. 12 (12), e0177731 (2017).
- Hur, M., et al. MicroCT-based phenomics in the zebrafish skeleton reveals virtues of deep phenotyping in a distributed organ system. eLife. 6, e26014 (2017).
- J, S. Whole-body imaging of a hypercholesterolemic female zebrafish by using synchrotron X-ray micro-CT. Zebrafish. 12 (1), 11-20 (2015).
- Hasamura, T., et al. Green tea extract suppresses adiposity and affects the expression of lipid metabolism genes in diet-induced obese zebrafish. Nutrition and Metabolism. 9 (1), 73 (2012).
- Meguro, S., Hasumura, T., Hase, T. Body fat accumulation in zebrafish is induced by a diet rich in fat and reduced by supplementation with green tea extract. PLoS One. 10 (3), e0120142 (2015).
- Dyer, E. L., et al. Quantifying mesoscale neuroanatomy using X-ray microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
- Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 115 (10), 2293-2298 (2018).
- Perilli, E., Parkinson, I. H., Reynolds, K. J. Micro-CT examination of human bone: from biopsies towards the entire organ. Ann Inst Super Sanita. 48 (1), 75-82 (2012).
- Watz, H., Breithecker, A., Rau, W. S., Kriete, A. Micro-CT of the human lung: imaging of alveoli and virtual endoscopy of an alveolar duct in a normal lung and in a lung with centrilobular emphysema - initial observations. Radiology. 236 (3), 1053-1058 (2005).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Pauwels, E., Van Loo, D., Cornillie, P., Brabant, L., Van Hoorebeke, L. An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250 (1), 21-31 (2013).
- Kün-Darbois, J. D., Manero, F., Rony, L., Chappard, D. Contrast enhancement with uranyl acetate allows quantitative analysis of the articular cartilage by microCT: Application to mandibular condyles in the BTX rat model of disuse. Micro. 97, 35-40 (2017).
- Tang, S. Y., Vashishth, D. A non-invasive in vitro technique for the three-dimensional quantification of microdamage in trabecular. Bone. 40 (5), 1259-1264 (2007).
- Elliott, J. C., Dover, S. D. X-ray microtomography. Journal of Microscopy. 126 (Pt 2), 211-213 (1982).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping). PLoS Genetics. 2 (4), e61 (2006).
- Larsson, D. H., Vågberg, W., Yaroshenko, A., Yildirim, A. Ö, Hertz, H. M. High-resolution short-exposure small-animal laboratory x-ray phase-contrast tomography. Scientific Reports. 6, 39074 (2016).
- Pleissis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 5, 1011 (2017).
- Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321 (2013).
- Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, L. P., Henkelman, R. M. Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-CT. Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).
- Hsu, C. W., et al. Three-dimensional microCT imaging of mouse development from early post-implantation to early postnatal stages. Developmental Biology. 419 (2), 229-236 (2017).
- Luft, J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 409-414 (1961).
- Hayat, M. A., Giaquinta, R. Rapid fixation and embedding for electron microscopy. Tissue Cell. 2 (2), 191-195 (1970).
- Handschuh, S., Baeumler, N., Schwaha, T., Ruthensteiner, B. A correlative approach for combining microCT, light and transmission electron microscopy in a single 3D scenario. Frontiers in Zoology. 10, 44 (2013).
- Bushong, E. A., et al. X-ray microscopy as an approach to increasing accuracy and efficiency of serial block-face imaging for correlated light and electron microscopy of biological specimens. Microscopy and Microanalysis. 21 (1), 231-238 (2015).
- Tsao-Wu, G. S., Weber, C. H., Budgeon, L. R., Cheng, K. C. Agarose-embedded tissue arrays for histologic and genetic analysis. Biotechniques. 25 (4), 614-618 (1998).
- Sabaliauskas, N. A., et al. High-throughput zebrafish histology. Methods. 39 (3), 246-254 (2006).
- Copper, J. E., et al. Comparative analysis of fixation and embedding techniques for optimized histological preparation of zebrafish. Comparative Biochemistry and Physiology. 208, 38-46 (2018).
- Gürsoy, D., De Carlo, F., Xiao, X., Jacobsen, C. TomoPy: a framework for the analysis of synchrotron tomographic data. J Synchrotron Radiat. 21 (Pt 5), 1188-1193 (2014).
- Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21 (2), 10-15 (2013).
- Thomas, G. K. A molecular and systems biology analysis of pleiotropic vertebrate phenotypes (Doctoral dissertation). , Retrieved from the Penn State Electronic Theses and Dissertations Database (2009).
- Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano- tomography. Scientific Reports. 5, 10074 (2015).
