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Biochemistry

氧电极对 DesB 酶活性和抑制作用的厌氧蛋白纯化及动力学分析

doi: 10.3791/58307 Published: October 3, 2018

Summary

在这里, 我们提出了一个协议的厌氧蛋白纯化, 厌氧蛋白浓度, 并随后的动力学表征使用氧电极系统。该方法用酶 DesB, 一种在厌氧环境中纯化和贮存时更稳定、更活跃的酶酶来说明。

Abstract

氧敏感蛋白, 包括那些利用氧作为基质的酶, 可以通过传统的有氧纯化方法, 降低稳定性。本手稿说明了厌氧净化过程中所涉及的技术细节, 包括缓冲剂和试剂的制备、手套盒中柱层析的方法, 以及动力学前蛋白质的脱盐。还介绍了制备和使用氧电极对氧利用酶进行动力学表征的方法。这些方法是使用酶酶 DesB, 一个无食子酶从细菌Sphingobium sp SYK-6。

Introduction

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利用铁或其他金属活化氧的酶在纯化过程中往往容易失活, 因为它们从细胞的还原环境中去除。因此, 这些蛋白质必须作为细胞裂解物, 受到外部还原剂, 或纯化厌氧, 以确保他们有最佳的酶活性1,2,3,4。对于那些对氧敏感的酶 (特别是含铁的酶), 执行所有的纯化和表征步骤, 同时保持厌氧条件是充分描述它们的必要条件。这使得研究人员在厌氧室范围内开发了整个实验室, 用于研究从蛋白质表达通过结晶学5,6,7,8.

本文报告了用氧电极系统对酶 DesB 进行厌氧纯化和动力学表征的方法。DesB 是酶细菌Sphingobium菌株 SYK-6 与 LigAB, protocatecuate 酶从同一有机体。这两种酶都属于 II. 型 protocatechuate 酶 (PCAD) 超家族, 至今尚未被广泛研究到9, 可能部分原因是由于这种超家族的酶在纯化使用标准好氧时易失活。蛋白质纯化方法。由于一些 PCAD 酶显示基质混杂, 而另一些是基板特定的2,10, 这一超家族的进一步描述是必要的, 以确定特异性决定因素。正如已经观察到的几个酶 superfamilies11,12,13,14,15, 小分子可以改变活动通过直接竞争抑制或约束分子分离构的口袋, 导致酶活性的增加或减少16。虽然动力学本身不能区分调制器的绑定位置, 但确定活动变化的大小对于理解这些影响是很重要的。因此, 在 4-nitrocatechol (4NC) 的存在下, 本机 DesB 活动的动力学特性及其活性的方法, 通常用来表征和抑制酶酶2,17的化合物,18, 显示。

DesB 可以通过 extradiol 酶 (江户) 反应, 通过氧作为基板1019的一种催化剂, 来分解木质素衍生的芳香化合物。这种酶反应发生在木质素分解的背景下, 这是植物细胞壁上发现的一种芳香 heteropolymer。木质素可以降解, 产生多种芳香化合物, 可进一步分解成中心代谢产物3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33.Extradiol dioxygenases (江户) 催化在 dihydroxylated 芳香化合物上的环形开口反应, 其中裂解发生在金属协调二醇附近;相比之下, intradiol dioxygenases 在两个羟基之间进行类似的芳香化合物 (图 1)。EDOs, 像许多其他 metalloenzymes, 有一个价金属中心协调 Fe (II) 由两组氨酸, 一羧酸三联9,34,35。这些 metalloenzymes 变得氧化, 通过氧化或基于机制的失活, 而酶呈现非活动2,36,37,38

在本手稿所描述的实验过程中, 我们利用 DesB (PCAD) 中的一名来自Sphingobium sp SYK-6 的细菌, 来催化在无食子 C4-C5 键中添加氧气 (图 2A)。这个的 regiochemistry 类似于 LigAB , 这是一个 protocatechuate - 4 , 5 - dioxygenase (图 2B) 。到目前为止, 对这个未食子酶的调查包括没有关于抑制 DesB101939的化合物的报告。利用有氧纯化方法, DesB 表现出多变的活性, 而随着厌氧方法的使用, 我们能够始终如一地获得具有可再生活性的蛋白质。本文介绍的动力学研究显示了 DesB 的厌氧纯化方法、DesB 与未食子酸反应的动力学特性, 以及 4-nitrocatechol (4NC) 对 DesB 的抑制作用。

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Protocol

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1. 一般材料和方法

  1. 按照表 1中的说明准备所有必需的介质。高压釜在120˚C 15 分钟无菌过滤器的 SOC 解决方案, 在添加氯化镁2和葡萄糖后, 通过通过0.2 µm 过滤器。在热处理之前, 调整米勒的溶源性汤 (LB 介质) 溶液的 pH 值。补充 LB-安培介质溶液后, 热处理与无菌溶液的0.2 毫米 l-半胱氨酸, 然后0.1 毫米亚铁铵, 以提高蛋白质的表达和溶解度。
  2. 为聚丙烯酰胺凝胶电泳 (页) 准备 Laemmli 缓冲器和运行缓冲器, 如表 2所述。调整溶液的 pH 值 (使用1米 HCl 和三基作缓冲准备), 然后将组件稀释至最终体积。
  3. 为蛋白质纯化准备缓冲液, 如表 3所述。调整溶液的 pH 值 (使用1米 HCl 和三基作缓冲准备), 然后将组件稀释至最终体积。
  4. 将准备好的缓冲器转移到可以用一孔橡胶塞子密封的瓶子上, 并装有玻璃管。
    1. 使用软管将塞子中的玻璃管连接至真空源。允许溶液在负压下加气约30分钟, 同时搅拌中速。
    2. 先打破真空密封, 然后关闭真空。接下来, 刺穿橡胶塞与两个20G 针 (一个足够长的时间到达底部的瓶子, 和一个更短的针, 可以用作气体逃生发泄)。以中等速度搅拌30分钟, 以稳定的氮气流泡。
    3. 除去针头, 重复脱气和在氮气中冒泡, 共三循环。完成后, 用实心橡胶塞子妥善封住瓶子。进一步安全的塞子与石蜡膜和铜线 (20G), 并把它们放进 glovebox。
      注: 所有材料都放置在 glovebox 中, 并受3周的净化, 然后清除氧气, 再加氮气。用于净化和浓缩的缓冲器可以无限期地被封上并储存在手套箱中。
  5. dithionate 钠溶液溶解约一铲 (0.31 "x 2", 小端的双端微锥形不锈钢铲), 在约1毫升脱气水中的1.5 毫升离心管中的 dithionate 钠.在拆卸手套盒前, 用石蜡膜封住管子。
    注: 贮存固体钠 dithionate 在手套箱内防止氧化。

2. 蛋白质纯化用直链淀粉柱的制备

  1. 用高流量直链淀粉树脂 (15 毫升) 和5柱 (75 毫升) 的直链淀粉柱缓冲液制备浆料。将树脂浆料转移到两个50毫升的血清瓶中, 并用橡胶隔膜封住每个瓶子。穿刺一 20G, 305 毫米针穿过隔膜, 将氮气泡入泥浆中大约1分钟, 从悬浮液中除去氧气。将树脂和含蛋白质的溶液转移到手套箱中。
  2. 在手套箱中, 将树脂倒入 2 x 30 厘米高的硼硅酸盐柱上, 装上一个简单的旋塞阀, 允许树脂沉淀并创建一个水平床。用加压氮气将脱气直链淀粉柱缓冲液中的3列容积 (~ 30 毫升) 平衡列缓冲, 然后将缓冲液按大约1滴/秒或5毫升/分钟的树脂, 直到溶剂刚好高于树脂床。
    注: 蛋白质洗脱后 (见步骤 3.5), 直链淀粉柱树脂以1柱容积 (10 毫升) 的水冲洗, 再用1柱容积 (SDS), 最后是1% 柱体积 (3 毫升) 的水来再生。此步骤可在手套箱外完成。柱树脂储存在4°c 在20% 乙醇和可再生多达5倍。

3. DesB 的蛋白质表达和厌氧纯化

注: DesB 基因是商业合成的, 已被放置到 pET-15b, pET-32a 和 pMAL c5x 的载体使用 NdeI 和 BamHI 限制克隆网站。

  1. 根据制造商的指导方针完成蛋白质表达的测定, 以确定大尺度表达的正确条件 (下文简述)。
    1. 根据制造商的指示, 将含有 DesB 的质粒转化为商业制造的、化学能力很强的大肠杆菌BL21 (DE3) 细胞。简而言之, 在冰上解冻细胞10分钟, 在细胞混合物中增加约10-50 的质粒 DNA, 热休克细胞在42°c 十年代, 并在冰上孵化, 以增加5分钟. 添加 SOC 介质以获得最终的1毫升容量, 并允许细胞摇晃 (~ 200 rpm) 在37°c 为60分钟。对一磅安培的板, 添加和传播100µL 的细胞溶液和孵化隔夜在37摄氏度。
    2. 在夜间孵化后从盘子中选择一个菌落形成单元, 并使用这个菌落接种10毫升的 LB-安培培养基。一夜之间生长细胞, 晃动 (约 200 rpm) 在37摄氏度。
    3. 到10毫升的介质, 添加100µL 的隔夜生长解决方案, 并动摇新的媒体, 如步骤3.1.2 在37摄氏度的描述。当光学密度在600毫微米 (OD600) 是在 0.4-0.8 之间, 增加异丙基β D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 获得一个最终溶液浓度为1毫米。
    4. 立即删除1毫升整除的解决方案, 并将其转移到1.5 毫升离心管与标记的时间 = 0 小时。旋转管在 1.5万 x g 10 分钟, 以颗粒细胞。旋转后, 取出上清, 将细胞储存在摄氏4摄氏度。
    5. 在添加 IPTG (通常在5、10、12、18和 24 h) 后的时间间隔内, 删除额外的整除数 (每个1毫升)。如步骤3.1.4 所述, 离心机每管, 醒酒上清, 并存储细胞在4摄氏度。
    6. 一旦获得所有的整除数, 并用重悬细胞从每 timepoint 30 µL 细菌蛋白提取液, 孵化他们在室温10-15 分钟, 并离心管 1.5万 x 克5分钟, 以分离可溶性和不溶性蛋白质。
    7. 将可溶性蛋白溶液转移到新的离心管中, 并用重悬30µL 的细菌蛋白萃取液, 将残留的不溶性颗粒分离出来。
    8. 将每个溶液的30µL (每个 timepoint 的可溶性和不溶性溶液) 与 Laemmli 缓冲量相等, 然后在 SDS 页凝胶40上可视化。选择条件对应的车道包含正确的大小带在可溶性分数的大尺度蛋白质表达和纯化。
      注: 由于最低可溶性蛋白最初是使用上述条件产生的, 添加了各种补充剂, 以测试对可溶性蛋白表达的影响, 0.2 毫米 l-半胱氨酸和0.1 毫米硫酸亚铁铵显示增强蛋白表达。根据该蛋白表达筛, pMAL c5x 载体可溶性生产 DesB 的合适表达载体。
  2. 经转化成大肠杆菌 BL21 (DE3), 通过结合900µL 细菌培养 (夜间生长与颤抖在 200 rpm 和37°c) 与100µL 80% 甘油的 DesB/pMal-c5x 的股票。在低温管中储存-80 摄氏度的存货。
    注: 大约每6-8 月制作一份新的冷冻库存。
  3. 使用吸管尖端从冰冻的库存中刮出细胞并开始细菌培养, 在37摄氏度的5毫升的 LB 放大介质中以颤抖的一夜之间生长。在37摄氏度和 200 rpm 的2升瓶中接种1.5 公升的 LB 型培养基, 使用夜间生长的细菌培养。
    注: 由于所观察到的蛋白质对氧的敏感性, 发现在瓶中的顶空和适度的震动速度改善了大尺度表达的蛋白质产量。
  4. 当光学密度在600毫微米 (OD600) 是在 0.4-0.8 之间以1毫米 IPTG 并且补充以0.2 毫米 l-半胱氨酸和0.1 毫米铁硫酸铵时, 诱导蛋白质表达。将孵化温度降低到30摄氏度, 并在200转每分钟晃动。在24小时后感应后, 在 4700 x g 处通过离心旋转细胞, 并丢弃所用的介质。
  5. 并用重悬在每1.5 升的20毫升直链淀粉柱缓冲细胞颗粒, 其次是增加1毫克溶菌酶。在冰上搅拌20分钟。
    注: 如果溶液太粘性, 可以添加更多的缓冲液, 因为太粘性的蛋白质溶液可能会扰乱以下均质步骤。
  6. 溶解悬浮细胞溶液通过高压均匀化, 3-5 通过大约 1.5万 psi。将蛋白质转移到50毫升离心管, 用氮气将顶空冲洗1分钟。然后, 离心细胞裂解物在 2万 x g 40 分钟, 以去除不溶性的碎片。
    注: 成功的均质导致蛋白质形成胶束, 因为它流经管和收集瓶, 和解决方案显示为半透明的灰褐色的颜色。在整个过程中保持均匀的蛋白质在冰上。
  7. 离心后, 将上清液转移到50毫升管 (以上可能是必需的), 用橡胶隔膜盖管, 用20口径针, 通过溶液缓慢气泡氮气, 以取代氧气。用石蜡膜包裹隔膜, 再用铜线将其固定, 并将上清液与柱状材料一起带入手套箱。
  8. 平衡列 (见步骤 2.3), 并将蛋白质上清液加载到柱上。在适度加压氮气 (1 滴/秒或大约5毫升/分) 的5毫升馏分中收集流动。接下来, 用3列的直链淀粉柱缓冲柱, 在适度加压氮气 (约5毫升/分) 的情况下, 手动收集玻璃试管中的3毫升馏分。洗脱蛋白质使用5柱容积 (~ 50 毫升) 洗脱缓冲和手动收集3毫升分数在适度氮气压力下 (约5毫升/分钟)。
    注: 可使用重力过滤法回收馏分。应收集大约12洗脱分数。
  9. 收集30µL 整除数的分数, 并将其从手套盒中取出, 以便通过 SDS 页面分析, 使含有蛋白质的分数可视化。
    注: 在测试期间, 收集的分数保留在手套箱中。纯化 DesB 通常 elutes 从分数3到5的列。

4. 厌氧蛋白浓度/缓冲交换

  1. 用76毫米重构的纤维素膜过滤器 (10 kDa 截止) 装配加压、搅拌的细胞选矿厂。加入足够数量的20% 乙醇进入选矿厂, 以保持膜湿, 因为组装选矿厂转移到手套箱。
    注: 确保膜内无泪, O 形环不皱。
  2. 将搅拌后的电池集中器带入手套箱后, 用清水冲洗膜上的乙醇溶液。盖上并加压搅拌单元, 清洗任何多余水的油管和膜。
  3. 添加所有含有蛋白质的分数, 由 SDS 页 (图 3) 确定的选矿厂。添加足够的交换缓冲区, 以产生150毫升的总蛋白溶液体积。
  4. 用外部 N2线加压搅拌细胞室, 将蛋白质浓缩为50毫升, 搅拌速度适中。
    注: 达到50毫升的浓度大约需要20分钟。
  5. 补充100毫升的交换缓冲器与0.1 毫米 dithiothreitol (德勤) 和0.1 毫米亚铁铵, 加入溶液的搅拌细胞, 并浓缩蛋白质的总体积50毫升与适度搅拌速度。
  6. 溶液达到50毫升的体积后, 再加入补充的交换缓冲器, 但将溶液集中到10毫升的总容积中, 搅拌速度适中。
  7. 用0.45 µm 孔径注射器过滤器和整除将浓缩蛋白过滤成单独的0.2 毫升聚合酶链反应 (pcr) 管 (每个含有大约150µL 的蛋白质溶液)。从手套箱中取下整除数, 立即用液氮将其冻结。把整除数-80 摄氏度。

5. 脱盐 DesB

  1. 使用前大约1.5 小时用氮气冲洗手套袋。
  2. 解冻150µL 整除的纯化 DesB 蛋白内的手套袋, 在冰上。
  3. 当蛋白质融化, 准备一个小的重力, 脱盐塔含有3毫升的葡 G-25 粗脱盐凝胶在9毫升硼硅酸盐柱。用2列容积 (~ 6 毫升) 的脱气淡化缓冲柱冲洗。
    注: 当凝胶颜色从白色变黄 (大约7使用后), 更换脱盐凝胶。
  4. 通过重力控制的过程将解冻的 DesB 加载到柱上。放弃流程。洗脱约5毫升的脱盐缓冲蛋白。
    注: 油箱内不断装满手套袋的压力会影响溶液从柱上滴下的速度。
  5. 为初步确定蛋白质洗脱从专栏, 收集12瓶/elutions (含3滴每瓶)。用橡胶隔膜密封, 将其从手套袋中取出, 或者直接 (通过 SDS 页凝胶分析) 或间接 (通过检查每一个分数的活动) 来测试蛋白质的存在。
    注意: 通常情况下, 分数是单独测试的活动, 如步骤7.1 所述, 与最大的活动相对应的分数与最大浓度的活性蛋白。DesB 通常 elutes 从第七滴开始, 然后收集以下9滴淡化蛋白。蛋白质整除数储存在冰在动力学测量期间 (步骤 7.1-7.4)。

6. 制备氧电极

  1. 抛光银阳极环和铂阴极与电极清洁剂和潮湿的 Q 尖, 直到没有明显的迹象, 黑色氧化物矿床。
  2. 用剪刀, 切约一1.5 英寸正方形的间隔纸 (或卷烟卷纸, 这也同样工作)。然后, 将 1) 小三角形放在正方形和2的每个面上, 缝到角上以帮助电极的环绕。
  3. 在银阳极槽上添加5滴50% 氯化钾溶液, 并将其连接起来, 形成一个连续的溶液环。加入2滴50% 氯化钾溶液的铂电极顶部。小心地把间隔纸放在铂电极的顶部, 平滑出间隔纸, 这样就没有气泡了。
    注意: 请小心, 避免撕裂间隔纸。
  4. 切一块 S4 30m 聚四氟乙烯 (聚四氟乙烯) 膜, 大约2英寸长, 并将其放在间隔纸的顶端。切断膜的边缘, 使其与电极外环对齐。
  5. 使用 o 形环涂抹器, 将小 O 形环推到电极上, 将间隔纸和膜固定在电极上。将较大的 O 形环放到电极的圆槽上, 确保其下方没有膜。将电极的顶部腔滑动到底座上, 将两者拧在一起。
    注: 如果没有气泡粘在房间的两侧, 这两个问题就会被正确地拧紧。
  6. 将组装的电极放在底座上, 将电极连接至监控系统。启动电极控制程序, 并通过执行液相校准协议校准电极 (图 4A)。温度变量应该是进行实验的房间的温度, 环境压力变量取决于区域和当前天气条件。
    注: 环境压力可从该地区的天气报告中获得。
  7. 将1毫升的25毫米三缓冲器添加到电极室, 插入柱塞, 开始校准氧气饱和溶液, 并调整搅拌器速度为100。在电极稳定后, 确定了氧饱和溶液的标定集点 (图 4B)。
  8. 在不拆卸柱塞的情况下, 使用 1.2 x 40 毫米针和1毫升注射器将大约1毫升的硫酸钠钠溶液注入室内, 小心避免添加任何气泡 (图 4C)。在硫酸钠钠加入后, 使用橡胶塞子立即密封电极室。
  9. 允许校准继续, 直到所有的氧气被使用和程序完成并保存校准 (图 4D)。从腔内抽出溶液, 用去离子水冲洗活塞和腔室5-6 次, 以确保完全去除硫酸钠钠。冲洗时, 使用装有吸管尖端的塑料管连接到侧臂真空瓶。避免损坏膜。

7. 用氧电极进行动力学测定

  1. 通过连续测试1µL 酶解的活性蛋白, 在25毫米整除数的溶液中, 用 pH 7.5 和含有100µM 无食子的方法来确定含有活性蛋白质的淡化。使用整除的最大观察活动进行剩余的实验。(请参见步骤 5.5.1)
  2. 通过电极控制单元的计算机集成, 通过测量 o2敏感的克拉克型电极, 测定酶反应的速率2
    1. 对于每个动力学数据点测量 DesB, 增加1毫升25毫米三缓冲器 (pH 7.5) 到电极室。添加一个计算出的体积为25毫米的无食子的库存解决方案的三个缓冲, 以达到预期的最终基质浓度 (0.05-25 毫米)。
      注: 如有必要, 每日用清水制备无食子酸和抑制化合物的新鲜库存溶液, 并将 pH 值调整为7.5。
    2. 搅拌十年代后, 允许混合溶液, 缓慢密封室与活塞, 拧上向下。一个干净的组织可以用来吸收多余的液体, 从房间里转移。允许电极平衡在它能产生稳定的测量溶液中的氧浓度至少1分钟之前, 继续添加酶 (背景 O2消耗率的0.5 µM/分钟)。
    3. 使用气体紧10µL 注射器, 增加大约1µL 酶 (大约3-7 µM 酵素) 到电极室通过柱塞。
      注: 酶的数量可以增加或减少, 以响应特定整除的观察活动, 以使反应速率足够。
    4. 在酶添加后, 根据第一三十年代线性数据的斜率计算反应速度, 并对背景 O2消耗量使用三十年代的数据在酶加法之前。催化率等于 O2的消耗率 (图 5A)。
    5. 在收集了给定衬底浓度的速率数据后, 通过使用连接到侧臂真空烧瓶的塑料管, 并在4-6 周期内反复冲洗水, 将电极室通过吸尘器清空。在电极中设置解决方案, 如步骤7.2.1 使用新的基板浓度所述。
    6. 以无序的方式改变基质浓度, 并在整个实验过程中进行复制, 以说明酶活性随时间的减少 (图 5B)。
      注: 当特定浓度的复制运行时, 与较早的运行相比, 其速率降低30% 以上, 则不应使用该批酶进行额外的化验。通常情况下, 30-40 运行后, 酶表明30% 减少的活动。
    7. 确定动力学参数, kcat (基材转化为产品的催化常数) 和 km (米氏常数, 操作上定义为基材浓度, 初始速率为一半的最大速度), 由一个最小二乘拟合的数据从每一个基底浓度到 Michaelis−Menten 方程 (图 6) 使用 GraphPad 棱镜。
  3. 添加 4-nitrocatechol (4NC) 测试其对 dioxygenation 动力学的影响, 并确定抑制常数 (Ki) 与 DesB。对于每个反应条件, 三 (50 毫米), 未食子 (25 毫米) 和 4NC (25 毫米) 的库存解决方案是结合和稀释水, 以产生2毫升溶液25毫米三缓冲 (pH 7.5) 与1毫米未食子酸和不同浓度的4NC。4NC 的体积变化, 以达到预期的最终抑制剂浓度 (0.05-20 毫米)。
    1. 经过10秒的搅拌, 以允许混合的解决方案, 把柱塞在房间里慢慢地拧上下来。一个干净的组织可以用来吸收多余的液体, 从房间里转移。允许电极平衡并在溶液中至少1分钟内产生稳定的氧浓度测量, 然后再加入酶 (2的背景 O 0.5 µM/分钟的消耗率)。
    2. 如前所述, 添加蛋白质 (步骤 7.2.3), 确定反应速率 (步骤 7.2.4), 并复位电极的下一个条件。
    3. 作为这一系列实验的一部分, 在多次抑制抑制剂的情况下, 确定反应速率。确定在不同抑制剂浓度存在的情况下, 用1毫米基体和无抑制剂 (v/vo) 的存在对氧消耗率进行标准化的抑制。
    4. 用图形程序拟合无食子 dioxygenation 对方程7.3A 的抑制, 然后将抑制数据应用到等式7.3B 中 (图 7)。
  4. 通过在所有动力学运行完成后执行布拉德福德试验, 确定每个实验的精确酶浓度。
    注意: 所有的速率都被纠正酶浓度。此步骤不需要在手套盒或手套袋中进行。

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Representative Results

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显示的是 DesB-麦芽糖结合蛋白 (MBP) 融合结构纯化的单个组分的 SDS 页凝胶分析 (图 3)。凝胶显示蛋白质是纯净的 (兆瓦 = 91.22 kDa), 除了 DesB 的存在 (兆瓦 = 49.22 kDa) 和 MBP 蛋白质领域 (42 kDa) 互相互相劈开。选择分数 E2 和 E3 浓度 (步骤 4.2)。

DesB 动力学分析的重现性结果取决于正确的装配、校准和实验技术。有必要输入正确的环境温度和压力, 因为这些变量决定2 O 的百分比, 预计将溶解在溶液中的试验 (图 4A)。初始信号应介于1800和 2000 nmol 之间, 并应产生接近于零的稳定速率, 表明溶液的氧饱和度是最小的 (图 4B)。一旦添加钠 dithionate, 并密封腔, o2消耗率应迅速和稳步增加, 直到有最小的 o2 (< 60 nmol/毫升) 留在溶液中。一个稳定的负斜率表明, 1) 组装电极没有空气泄漏和 2) 电极对 O2浓度的变化有充分的反应 (图 4CD)。如果保留在解决方案中的 O2不够低, 则校准偏移值将不正确。校准将不得不重复与正确组装电极, 必须使用新鲜的钠硫酸钠。

当电极正确校准时, 可以进行动力学测定。第一个测量建立了新的淡化酶的活性, 使用100µM 无食子在25毫米三缓冲和 1 uL 的酶。在加入酶之前, 三缓冲器和无食子被搅拌在腔内, 柱塞位置。这应该产生一个近似的初始信号在250和 350 nmol/毫升, 和信号应该稳定 (±5 nmol/毫升/分钟) 之前, 酶添加。一个稳定的信号表明, 没有变量(例如,撕裂膜, 残留钠硫酸钠, 肮脏的电极), 可能导致不一致的测量。当添加酶时, 信号应迅速且稳步下降, 表明 DesB 的反应正在进行, 因为 O2在与无食子的反应中消耗。通过使用速率工具, 将窗口调整为30秒 (图 5A), 确定了酶添加前的初始速率斜率和催化速率。经过大约 1-1 5 小时的使用, 酶活性下降约 30-50%, 此时不应再使用 (图 5B)。

一旦采取了所有的动力学测量, 数据可以用建模程序绘制 (图 6)。通过测定不同食子酸浓度下 O2的消耗率, 获得无食子 DesB 的活性。从催化速率中减去酶加法前的背景速率以获得校正率。背景校正率由酵素集中划分并且适合等式 7.3A (参见步 7.3.3)。充分的适合取决于 km和 ksi的初始参数 (初始参数:km = 320 微米, ksi = 1600 微米)。结果显示一条双曲线, 达到最大的高原, 然后向下倾斜轻微的 [未食子] 增加。这是一种典型的曲线, 用于在高基质浓度下表现基底抑制的酶。

Equation 7.3B

通过观察在 4-nitrocatechol 浓度变化的情况下, nitrocatechol DesB 的氧耗率降低了 4-DesB 的抑制率 (图 7)。4-NC 浓度的绘制与规范化的活动 (在存在的抑制剂的速率除以不受约束的速率), 适合方程 7.3B (见步骤 7.3.3)。结果表明, 4-NC 抑制了氧的消耗, 从而抑制了 DesB 反应。

Equation 7.3A

媒体类型 组件
阻遏压制的超级最佳发酵液 (SOC 介质) 2% (w/v) 胰蛋白胨
0.5% (w/v) 酵母提取物
10毫米氯化钠
2.5 毫米氯化钾
10毫米氯化镁2 (灭菌后添加)
20毫米葡萄糖 (灭菌后添加)
米勒的溶源性汤与氨苄西林 (LB-安培媒体) 0.5% (w/v) 酵母提取物
1% (w/v) 胰蛋白胨
1% (w/v) 氯化钠
0.1 毫克/毫升氨苄西林 (在灭菌后添加)

表 1.阻遏压制 (SOC 介质) 和米勒的溶源性汤与氨苄西林 (LB-安培介质) 一起制备超级最佳发酵液的配料.

工作解决方案 组件最终浓度
Laemelli 缓冲器, pH 值6。8 100毫米三 (羟甲基) 氨基甲烷 (三)
200毫米 dithiothreitol (德勤),
4% 月桂酸钠 (SDS)
0.05% 溴酚蓝色
20% 甘油
运行缓冲 pH 值8。3 25毫米三
192毫米甘氨酸
0.1% SDS

表 2.SDS 页分析准备 Laemelli 和运行缓冲器的配料.

工作解决方案 组件最终浓度
直链淀粉柱缓冲液, pH 值7。4 20毫米三 (羟甲基) 氨基甲烷 (三)
1毫米乙二胺乙酸 (EDTA)
200毫米氯化钠
洗脱缓冲液 pH 值7。4 20毫米三
1毫米 EDTA
200毫米氯化钠
10毫米麦芽糖
交换缓冲器, pH 值7。5 50毫米三
10% 甘油
脱盐缓冲液, pH 值7。5 50毫米三
10% t 丁醇

表 3.蛋白质纯化用缓冲剂的制备材料.

Figure 1
图 1: 环裂解 dioxygenases 催化反应的比较.波浪线显示了相应的碳碳键, 在酶反应过程中被劈裂, 在那里 intradiol 裂解 (红色) 打破两个羟基基团和 extradiol 裂 (蓝) 之间的键合, 打破了相邻的碳碳键。羟基。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: DesB 和 LigAB 的反应, 两个相关的 extradiol dioxygenases 属于 II 型 protocatechuate 酶 (PCAD) 超家族.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: DesB 的 SDS 页凝胶显示纯化和浓缩步骤结果.车道标记如下: S = 蛋白质标准, FT1 并且 FT2 = 被收集的流经的组分, W1 并且 W2 = 收集的洗涤组分, E1-E4 = 收集的洗脱组分。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 氧电极的校准曲线的生成.(A) 在校准之前, 将环境温度和压力输入到程序中, 以确定空气平衡溶液的氧浓度。(B) 氧气饱和溶液达到平衡并产生提示。(C) 添加 dithionate 钠溶液以利用所有氧气, 如氧气信号减少所示。(D) 当信号在零氧浓度下稳定时, 得到校准。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 代表性的动力学曲线, 说明了一段时间内典型的活动损失.(A) 100 µm 无食子的反应, 使用新鲜 DesB,2 % 的利用率为-56.61 µm/分钟. (B) 100 µm 未食子酸的反应, 使用 DesB 后 2 h 的数据收集, 与 o2的利用率-29.56 µm/分钟.请单击此处查看这个数字的大版本.

Figure 6
图 6: 与无食子 DesB 活动的情节, 适合米氏-芒通方程(黑色), 适合于用于基板抑制的霍尔丹方程 (红色;等式 7.3B).从两种拟合得到的动力学参数如下: 米氏-米氏- k= 316 +/-17 秒-1, km = 123 +/-26 微米;570 +/ -110 秒-1, km = 320 +/100 微米, ksi = 1600 +/-600 微米。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 4-nitrocatechol 抑制无食子 DesB dioxygenation (1 毫米)的图。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 8
图 8: DesB 的协调 (pdb ID = 3wr3).正如在许多 dioxygenases 中看到的, 配体坐标到一个活跃的地点铁 (II) 原子在二齿的方式。根据无食子与 4-nitrocatechol (4NC) 的结构相似性, 对 DesB 的抑制作用进行了预测。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

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获得活性的、纯化的 DesB 蛋白的关键步骤包括在酶中还原铁 (II.) 活性部位的形成和维持。因此, 正确的诱导、纯化、浓缩和脱盐步骤的性能是成功获得活性酶的必要条件。诱导蛋白在1毫米铁铵存在下的表达确保铁 (II) 正确地纳入 DesB 的活性部位。这种方法是灵感的研究, 如那些与 amidohydrolase metalloenzymes, 这往往需要添加金属的增长媒体, 以允许适当的折叠和充分占用的金属结合点6,41,42 ,43

在手套箱中的厌氧净化和浓缩可能是本议定书中最关键和技术上最困难的步骤。在手套箱中保持无氧气氛是必不可少的。这就要求在 glovebox 中保持脱氧催化剂, 如手册所规定的那样, 在低的时候周期性地改变附着在盒子上的氮气罐, 以确保在 glovebox 上的手套中没有孔, 并在 glovebox 中保留一托盘新鲜的干燥剂。在暴露于环境 o2的情况下改变颜色的氧敏感条可放置在盒中, 以测试2无 o 型大气。此外, 有必要完全德加德的所有缓冲和解决方案, 将在净化和浓缩过程中使用。为了确保缓冲区中的最小 O2 , 请非常小心地将脱气缓冲区的暴露量限制在氮气冒泡和清除周期之间切换到空气中。

当在手套箱中运行该列时, 一个很好的测试, 以确定是否有氧气存在的缓冲器是采取一个小部分的洗涤分数 (约 0.1-0.5 毫升), 并把它放在一个离心管与一小部分的铁 ammonium 硫酸盐和德勤 (低于浓缩步骤所需的量)。这是很重要的, 以混合的内容, 管井和观察的颜色变化。如果溶液变为黑色、深黄色或橙色, 则蛋白质组分中存在氧气, 在完全纯化和浓缩过程后, 可能会减少催化活性。如果溶液是淡紫色或非常淡黄色的颜色, 可能有极小的 O2目前, 但它很可能是酶仍然有高活性。当氧存在时, 暗黄色到橙色的变化很可能是由铁铵中的铁质氧化成铁 (III), 形成锈44。为了解决这个问题, 建议将缓冲液加在一起, 让氮气通过粗蛋白溶液泡1-2 分钟, 然后放入手套箱中。此外, 重要的是要确保在手套箱的气氛是真正 o2免费使用 o2敏感条。

最后一个关键步骤, 在动能特性之前淡化酶, 需要无氧气氛, 必须在冰上做, 因为纯化的蛋白质在室温下容易变性。确定淡化蛋白何时脱落, 对于成功的动力学分析是必不可少的, 因为最集中的分数给出最可重现的结果。淡化蛋白是洗脱的分数必须确定, 每次新的一批蛋白质被纯化, 当柱是重新包装与新的树脂。如果在动力学检测过程中活性较低, 并且在技术上掌握了提纯和浓缩步骤, 则问题可能在于脱盐步骤。在排除此步骤时, 关键是要检查50毫米 Tris/10%t 丁醇缓冲器是否彻底脱气, 重新包装柱与新鲜的葡树脂, 并确保没有孔的手套袋。

在 DesB 成功纯化和淡化后, 必须仔细地使用氧电极进行动力学分析, 以获得酶催化活性的数据。当使用催化活性和浓缩蛋白时, 动力学测量通常是可重现的。如果在重复基板或抑制剂浓度数据点的运行时数据点不可重现, 则问题可能是蛋白质在延长使用后变性或氧化。可以生成新的淡化蛋白质, 以便继续收集数据。重要的是保留所有的小瓶的酶, 所以准确的蛋白质浓度可以确定后, 数据收集完成使用布拉德福德化验。这一步是在动力学测量后进行的, 因为酶随着时间的推移而失去活性, 所以首先执行它可能会导致较低的活性和不准确的动力学测量。然后利用蛋白质浓度将所观察到的催化速率转化为确定周转数所需的反应速率。除了对导致不可再生动力学结果的酶活性丧失的担忧外, 延长使用后覆盖电极的膜的降解也可能在复制数据时产生挑战。膜降解通常是由初始信号的增加 (从 250-350 nmol/毫升到>350 nmol/毫升) 或无法达到稳定的背景率之前的酶添加 (> ±5 nmol/毫升/分钟)。如果观察到, 建议将电极拆卸, 使用所提供的清洁粉末清洁电极上的任何氧化物, 重新组装电极, 重新校准。

厌氧纯化方法对于金属中心的酶是非常重要的, 它可以被氧化, 尤其是那些在蛋白质折叠后无法交换的紧密结合的金属。虽然酶已经进化来保护自己通过协调氧气, 只有在基板的协调, 他们已经这样做在细胞环境中-在体外环境中饱和的氧量可以导致金属的快速氧化并将 fe (II) 转化为非活性 fe (III.) 形式31。这种氧化/失活可能导致扭曲的结果, 其中酶不是在其催化活动状态。使用氧敏感电极的动力学分析可以应用于依赖氧作为基质的酶。这种方法不是利用基体强度或产品吸收的变化来获得动力学参数, 而是允许在溶液中饱和氧消耗的可视化。这种方法以前曾与 LigAB, 另一个 extradiol 酶在 protocatechuate 酶超家族, 同样依赖于 Fe (II) 在其活动的网站, 以协调和切割其基底。

本手稿还提供了有关Sphingobium菌株 SYK-6 的酶 DesB 的补充信息。在定义了 DesB101939的酶函数和结构的工作之后, 本文确定 DesB 是无食子 dioxygenation 的催化剂, 与k17.8 ~ 1.0 s-1和 Km 45 @ 13 µM, 导致k或 km 3.98 x 105 m/秒。这些速率可与其他酶酶确定的, 包括 LigAB (k五十一年代-1k/km 4.26 x 106 M-1s-1) 和其他 dioxygenases 有k/km值范围从 105-108 m-1s-136,45,46,47,48,49,50

DesB 活动的站点以前被证明是在二聚体接口, 与两个单体的残余贡献对基板的协调 [来自单体的残余从束缚 Fe (II) 由他们的残余数字表明, 而残余物从其他单体由他们的残余数字和一个质数 (Glu377ʹ) 指示6。由于缺乏结构信息, 显示4NC 与 DesB 的结合作用, 无食子和4NC 之间的结构相似性和差异可以为 DesB 如何被4NC 抑制提供洞察力。无食子在 C3、C4 和 C5 有三羟基取代基, 其 C3 和 C4 羟基与 Fe (II) 中心协调, C5 羟基由 Glu377ʹ协调 (图 8)。C1 中的羧酸组由 Thr-267 活性部位的 Tyr-391ʹ、Tyr-412ʹ、Thr-13 和 DesB 协调。4NC, 这证明是一个温和的 DesB 抑制剂, 有两个羟基可用来协调 Fe (II) 中心和一个 C1 硝基组, 这是等量吸附到羧酸 (同时也有两个氧为协调由残滓 391, 412, 13 和 267), 但更在未食子酸上的电子提取比羧酸。由于4NC 显示只有36.6% 抑制无食子 dioxygenation 的 DesB, 当抑制剂存在于5倍以上的基质, 这是不足为奇的是, 它不是一个非常有效的抑制剂 (与 Ki 2.3, 0.3 毫米)。这表明, C5 羟基和 C1 取代基对促进酶配体复合体起着重要作用。由于残留 Glu377ʹ、Tyr-391ʹ和 Tyr-412ʹ都与这些相互作用有关, 这表明 DesB 活性部位与相邻单体的接触对于放置化合物和构造活性部位是很重要的。

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Disclosures

作者没有竞争的金融利益或其他利益冲突。

Acknowledgments

我们要感谢卫斯理大学的卡米尔. 凯勒博士的技术支持。特别感谢 Eltis 教授和珍娜 k. Capyk 从不列颠哥伦比亚大学, 以及德克萨斯大学奥斯汀分校的基督教惠特曼, 他们就厌氧蛋白质纯化方法和使用 O 2 的建议敏感电极。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise Gold Bio Technologies I2481C50
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad 161-0400
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
30% Acrylamide Bio-Rad 161-0158
N,N'tetramethyl-ethylenediamine Bio-Rad 161-0801
Amylose Resin High Flow New England Biolabs E8022S
BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells New England Biolabs C2527I
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
gallic acid Sigma Aldrich G7384
4-nitrocatechol Sigma Aldrich N15553
Ferrous ammonium sulfate Mallinckrodt 5064
Sodium dithionite Alfa Aesar 33381-22
wheaton serum bottles Fisher Scientific 06-406G
25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane Pall Corportation 4187
400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator EMD Millipore UFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter EMD Millipore PLGC07610
DL-dithiothreitol Gold Bio Technologies DTT50
Sephadex G-25 coarse desalting gal column GE Healthcare 17-0033-01
2 mL Crimp-Top Vials Fisher Scientific 03-391-38
Oxygraph Plus Electrode Control Unit Hansatech Instruments OXYG1 Plus
Oxygen Eletrode Chamber Hansatech Instruments DW1
Electrode Disc Hansatech Instruments S1
PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel Hansatech Instruments S4
Electrode cleaning Kit Hansatech Instruments S16
Spacer paper Zig Zag available at any gas station
He-series Dri-Lab glove box Vacuum/Atmospheres Company
HE-493 Dri-Train Vacuum/Atmospheres Company
Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula Fisher Scientific 21-401-10
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific k420400-1530
10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe Hamilton 80300
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific K420401-1505
Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer Avestin
B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent Thermo Fisher Scientific 89821
Lysozyme from chicken egg white Sigma Aldrich 12650-88-3
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 151-21-3
ampicillin Sigma Aldrich 7177-48-2
Tryptone Fisher Scientific BP-1421-500
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-10
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-3
Magnesium Chloride Fisher Scientific M33-500
Dextrose Fisher Scientific D16-3
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
Tris hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
Maltose Fisher Scientific BP684-500
Glycine Fisher Scientific G46-500

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References

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氧电极对 DesB 酶活性和抑制作用的厌氧蛋白纯化及动力学分析
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Uchendu, S. N., Rafalowski, A., Cohn, E. F., Davoren, L. W., Taylor, E. A. Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition. J. Vis. Exp. (140), e58307, doi:10.3791/58307 (2018).More

Uchendu, S. N., Rafalowski, A., Cohn, E. F., Davoren, L. W., Taylor, E. A. Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition. J. Vis. Exp. (140), e58307, doi:10.3791/58307 (2018).

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