在这里, 我们提出了一个协议的厌氧蛋白纯化, 厌氧蛋白浓度, 并随后的动力学表征使用氧电极系统。该方法用酶 DesB, 一种在厌氧环境中纯化和贮存时更稳定、更活跃的酶酶来说明。
氧敏感蛋白, 包括那些利用氧作为基质的酶, 可以通过传统的有氧纯化方法, 降低稳定性。本手稿说明了厌氧净化过程中所涉及的技术细节, 包括缓冲剂和试剂的制备、手套盒中柱层析的方法, 以及动力学前蛋白质的脱盐。还介绍了制备和使用氧电极对氧利用酶进行动力学表征的方法。这些方法是使用酶酶 DesB, 一个无食子酶从细菌Sphingobium sp SYK-6。
利用铁或其他金属活化氧的酶在纯化过程中往往容易失活, 因为它们从细胞的还原环境中去除。因此, 这些蛋白质必须作为细胞裂解物, 受到外部还原剂, 或纯化厌氧, 以确保他们有最佳的酶活性1,2,3,4。对于那些对氧敏感的酶 (特别是含铁的酶), 执行所有的纯化和表征步骤, 同时保持厌氧条件是充分描述它们的必要条件。这使得研究人员在厌氧室范围内开发了整个实验室, 用于研究从蛋白质表达通过结晶学5,6,7,8.
本文报告了用氧电极系统对酶 DesB 进行厌氧纯化和动力学表征的方法。DesB 是酶细菌Sphingobium菌株 SYK-6 与 LigAB, protocatecuate 酶从同一有机体。这两种酶都属于 II. 型 protocatechuate 酶 (PCAD) 超家族, 至今尚未被广泛研究到9, 可能部分原因是由于这种超家族的酶在纯化使用标准好氧时易失活。蛋白质纯化方法。由于一些 PCAD 酶显示基质混杂, 而另一些是基板特定的2,10, 这一超家族的进一步描述是必要的, 以确定特异性决定因素。正如已经观察到的几个酶 superfamilies11,12,13,14,15, 小分子可以改变活动通过直接竞争抑制或约束分子分离构的口袋, 导致酶活性的增加或减少16。虽然动力学本身不能区分调制器的绑定位置, 但确定活动变化的大小对于理解这些影响是很重要的。因此, 在 4-nitrocatechol (4NC) 的存在下, 本机 DesB 活动的动力学特性及其活性的方法, 通常用来表征和抑制酶酶2,17的化合物,18, 显示。
DesB 可以通过 extradiol 酶 (江户) 反应, 通过氧作为基板10、19的一种催化剂, 来分解木质素衍生的芳香化合物。这种酶反应发生在木质素分解的背景下, 这是植物细胞壁上发现的一种芳香 heteropolymer。木质素可以降解, 产生多种芳香化合物, 可进一步分解成中心代谢产物3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33.Extradiol dioxygenases (江户) 催化在 dihydroxylated 芳香化合物上的环形开口反应, 其中裂解发生在金属协调二醇附近;相比之下, intradiol dioxygenases 在两个羟基之间进行类似的芳香化合物 (图 1)。EDOs, 像许多其他 metalloenzymes, 有一个价金属中心协调 Fe (II) 由两组氨酸, 一羧酸三联9,34,35。这些 metalloenzymes 变得氧化, 通过氧化或基于机制的失活, 而酶呈现非活动2,36,37,38。
在本手稿所描述的实验过程中, 我们利用 DesB (PCAD) 中的一名来自Sphingobium sp SYK-6 的细菌, 来催化在无食子 C4-C5 键中添加氧气 (图 2A)。这个的 regiochemistry 类似于 LigAB , 这是一个 protocatechuate – 4 , 5 – dioxygenase (图 2B) 。到目前为止, 对这个未食子酶的调查包括没有关于抑制 DesB10、19、39的化合物的报告。利用有氧纯化方法, DesB 表现出多变的活性, 而随着厌氧方法的使用, 我们能够始终如一地获得具有可再生活性的蛋白质。本文介绍的动力学研究显示了 DesB 的厌氧纯化方法、DesB 与未食子酸反应的动力学特性, 以及 4-nitrocatechol (4NC) 对 DesB 的抑制作用。
获得活性的、纯化的 DesB 蛋白的关键步骤包括在酶中还原铁 (II.) 活性部位的形成和维持。因此, 正确的诱导、纯化、浓缩和脱盐步骤的性能是成功获得活性酶的必要条件。诱导蛋白在1毫米铁铵存在下的表达确保铁 (II) 正确地纳入 DesB 的活性部位。这种方法是灵感的研究, 如那些与 amidohydrolase metalloenzymes, 这往往需要添加金属的增长媒体, 以允许适当的折叠和充分占用的金属结合点6</sup…
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢卫斯理大学的卡米尔. 凯勒博士的技术支持。特别感谢 Eltis 教授和珍娜 k. Capyk 从不列颠哥伦比亚大学, 以及德克萨斯大学奥斯汀分校的基督教惠特曼, 他们就厌氧蛋白质纯化方法和使用 O 2 的建议敏感电极。
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise | Gold Bio Technologies | I2481C50 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 161-0400 | |
Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
30% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0158 | |
N,N'tetramethyl-ethylenediamine | Bio-Rad | 161-0801 | |
Amylose Resin High Flow | New England Biolabs | E8022S | |
BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells | New England Biolabs | C2527I | |
L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
gallic acid | Sigma Aldrich | G7384 | |
4-nitrocatechol | Sigma Aldrich | N15553 | |
Ferrous ammonium sulfate | Mallinckrodt | 5064 | |
Sodium dithionite | Alfa Aesar | 33381-22 | |
wheaton serum bottles | Fisher Scientific | 06-406G | |
25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane | Pall Corportation | 4187 | |
400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator | EMD Millipore | UFSC40001 | |
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter | EMD Millipore | PLGC07610 | |
DL-dithiothreitol | Gold Bio Technologies | DTT50 | |
Sephadex G-25 coarse desalting gal column | GE Healthcare | 17-0033-01 | |
2 mL Crimp-Top Vials | Fisher Scientific | 03-391-38 | |
Oxygraph Plus Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | OXYG1 Plus | |
Oxygen Eletrode Chamber | Hansatech Instruments | DW1 | |
Electrode Disc | Hansatech Instruments | S1 | |
PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel | Hansatech Instruments | S4 | |
Electrode cleaning Kit | Hansatech Instruments | S16 | |
Spacer paper | Zig Zag | available at any gas station | |
He-series Dri-Lab glove box | Vacuum/Atmospheres Company | ||
HE-493 Dri-Train | Vacuum/Atmospheres Company | ||
Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | k420400-1530 | |
10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe | Hamilton | 80300 | |
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | K420401-1505 | |
Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer | Avestin | ||
B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 89821 | |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 12650-88-3 | |
Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 151-21-3 | |
ampicillin | Sigma Aldrich | 7177-48-2 | |
Tryptone | Fisher Scientific | BP-1421-500 | |
Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
Dextrose | Fisher Scientific | D16-3 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
Tris hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
Maltose | Fisher Scientific | BP684-500 | |
Glycine | Fisher Scientific | G46-500 |