Fabricera en njure Cortex extracellulära Matrix-Derived Hydrogel

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att fabricera en njure cortex extracellulära matrix-derived hydrogel för att behålla den infödda njure extracellulära matrix (ECM) strukturella och biokemiska sammansättningen. Tillverkningsprocessen och dess tillämpningar beskrivs. Slutligen diskuteras ett perspektiv på använda denna hydrogel för att stödja njure-specifik cellulär och vävnad förnyelse och bioteknik.

Abstract

Extracellulär matrix (ECM) ger viktiga biofysiska och biokemiska signaler för att upprätthålla vävnad homeostas. Nuvarande syntetiska hydrogels erbjuder robust mekanisk stöd för cellodling in vitro- men saknar den nödvändiga protein och ligand sammansättningen för att framkalla fysiologisk beteende från celler. Detta manuskript beskriver en fabrication metod för en njure cortex ECM-derived hydrogel med ordentlig mekanisk robusthet och stödjande biokemiska sammansättning. Hydrogel är tillverkad av mekaniskt homogenisering och solubilizing cell-lösa mänskliga njurar cortex ECM. Matrisen bevarar infödda njure cortex ECM protein nyckeltal och även möjliggöra gelation till fysiologiska mekaniska stiffnesses. Hydrogel serverar som substrat vid vilken njure cortex-derived celler kan upprätthållas under fysiologiska betingelser. Dessutom kan hydrogel sammansättning manipuleras för att modellera en diseased miljö som möjliggör framtida studier av njursjukdomar.

Introduction

Extracellulär matrix (ECM) ger viktiga biofysiska och biokemiska signaler för att upprätthålla vävnad homeostas. Den komplexa molekylära sammansättningen reglerar både strukturella och funktionella egenskaper av vävnad. Strukturella proteiner förse cellerna med rumsuppfattning och möjliggöra adhesion och migration¹. Destinerade ligands interagera med surface cellreceptorer att styra cell beteende². Njure ECM innehåller en uppsjö av molekyler vars sammansättning och struktur varierar beroende på anatomiska läge, utvecklingsstadier och sjukdom stat^3,4. Går igenom komplexiteten i ECM är en viktig aspekt i att studera njure-derived celler in vitro.

Tidigare försök att replikera ECM mikromiljö har fokuserat på decellularizing hela vävnad för att skapa ställningar kan recellularization. Decellularization har utförts med kemiska rengöringsmedel såsom natriumsulfat natriumdodecylsulfat (SDS) eller icke-joniskt rengöringsmedel, och det använder antingen hela orgel perfusion eller nedsänkning och agitation metoder^{5,6,7 ,8,9,10,11,12,13}. De ställningar som presenteras här bevara de strukturella och biokemiska signaler Funna i native vävnad ECM; Dessutom recellularization med givare-specifika celler har klinisk relevans i rekonstruktiv kirurgi^{14,15,16,17,18, 19}. dock dessa ställningar saknar strukturella flexibilitet och därför är inkompatibla med många aktuella enheter som används för in vitro- studier. För att kringgå den här begränsningen har många grupper bearbetas vidare cell-lösa ECM till hydrogels^{20,21,22,23,24}. Dessa hydrogeler är kompatibla med formsprutning och bioink och kringgå mikrometer skala rumsliga begränsningar som cell-lösa ställningar plats på celler. Dessutom bevaras molekylära sammansättning och nyckeltal i native ECM^3,25. Här visar vi en metod för att fabricera en hydrogel som härrör från njure cortex ECM (kECM).

Syftet med detta protokoll är att producera en hydrogel som replikerar närmiljön i regionen njure kortikala. Njure cortex vävnad är cell-lösa i en 1% SDS lösning under ständig agitation ta bort cellulära fråga. SDS används ofta till decellularize vävnad på grund av dess förmåga att snabbt ta bort immunologiska cellulära material^6,7,9,26. KECM är då föremål för mekanisk homogenisering och frystorka den^5,6,9,11,26. Lösbarhet i en stark syra med pepsin resulterar i en slutlig hydrogel stamlösning^20,27. Infödda kECM proteiner som är viktiga för strukturellt stöd och signal transduktion bevaras^3,25. Hydrogel kan också vara geléartad till inom en beställa av storlek av infödda mänskliga njurar cortex^28,29,30. Denna matris ger en fysiologisk miljö som har använts för att bibehålla rofylld av njure-specifika celler jämfört hydrogels från andra matrix proteiner. Dessutom matrix sammansättning kan manipuleras, exempelvis genom tillägg av kollagen-I, till modell sjukdom miljöer för studien av nedsatt fibros och andra njur sjukdomar^31,32.

Protocol

Mänskliga njurar isolerades av LifeCenter nordväst efter etiska riktlinjer som fastställs av de Association av orgel upphandling organisationer. Detta protokoll följer djurens vård och cell-kultur riktlinjer beskrivs av University of Washington. 1. beredning av människans njure vävnad Beredning av decellularization lösning Sterilisera en 5000 mL bägare och en 70 x 10 mm rör bar. Blanda 1: 1000 (vikt: volym) sodium dodecyl sulfate (SDS) Ånghärdad avjonis…

Representative Results

Den kECM hydrogel erbjuder en matris för njure cellodling med liknande kemiska sammansättning som den infödda njure mikromiljö. För att fabricera hydrogel, är njure cortex vävnad mekaniskt isolerad från en hela njuren orgel och tärnade (figur 1). Decellularization med kemiska tvättmedel (figur 2A.1-A.3) följt av sköljning med vatten för att avlägsna rengöringsmedlet partiklar (…

Discussion

Matriser ger viktiga mekaniska och kemiska signaler som styr cellen beteende. Syntetiska hydrogels kan stödja komplexa 3-dimensionella mönster men misslyckas med att tillhandahålla olika extracellulära ledtrådar finns i fysiologiska matrix mikromiljö. Hydrogeler härrör från infödda ECM är perfekt material för både i vivo och in vitro- studier. Tidigare studier har använt cell-lösa ECM hydrogeler för att bestryka syntetiskt biomaterial för att förhindra värd immunologiska svar<sup clas…

Materials

Preparation of Kidney Tissue
5000 mL Beaker	Sigma-Aldrich	Z740589
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	436143
Sterile H2O			Autoclaved DI H2O
Stir Bar (70 x 10 mm)	Fisher Science	14-512-128
500 mL Vacuum Filter	VWR	97066-202
Stir Plate	Sigma-Aldrich	CLS6795420D
1000 mL Beaker	Sigma-Aldrich	CLS10031L
Forceps	Sigma-Aldrich	F4642	Any similar forceps may be used
Scissor-Handle Hemostat Clamp	Sigma-Aldrich	Z168866
Dissecting Scissors	Sigma-Aldrich	Z265977
Scalpel Handle, No. 4	VWR	25859-000	Any similar scalpel handle may be used
Scalpel Blade, No. 20	VWR	25860-020	Any similar scalpel blade may be used
Stir Bar (38.1 x 9.5 mm)	Fisher Science	14-513-52
Absorbent Underpad	VWR	82020-845
Petri Dish (150 x 25 mm)	Corning	430597
Autoclavable Biohazard Bag	VWR	14220-026
Sterile Cell Strainer (40 um)	Fisher Science	22-363-547
Cell Culture Grade Water	HyClone	SH30529.03
30 mL Freestanding Tube	VWR	89012-778
Fabrication of ECM Gel
Tissue Homogenizer Machine	Polytron	PCU-20110
Freeze Dryer	Labconco	7670520
20 mL Glass Scintillation Vials and Cap	Sigma-Aldrich	V7130
Stir Bar (15.9 x 8 mm)	Fisher Science	14-513-62
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa	Sigma-Aldrich	P7012
0.01 N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water
Kidney ECM Gelation
1 N NaOH (Sterile)	Sigma-Aldrich	415413	Dilute to 1 N in cell culture grade water
Medium 199	Sigma-Aldrich	M4530
15 mL Conical Tube	ThermoFisher	339651
Cell Culture Media	ThermoFisher	11330.032	Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10082147
Antibiotic-Antimycotic 100X	Life Technologies	15240-062
Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X	Life Technologies	51300-044
1 mL Syringe	Sigma-Aldrich	Z192325
Microspatula	Sigma-Aldrich	Z193208