Summary

Fabricera en njure Cortex extracellulära Matrix-Derived Hydrogel

Published: October 13, 2018
doi:

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att fabricera en njure cortex extracellulära matrix-derived hydrogel för att behålla den infödda njure extracellulära matrix (ECM) strukturella och biokemiska sammansättningen. Tillverkningsprocessen och dess tillämpningar beskrivs. Slutligen diskuteras ett perspektiv på använda denna hydrogel för att stödja njure-specifik cellulär och vävnad förnyelse och bioteknik.

Abstract

Extracellulär matrix (ECM) ger viktiga biofysiska och biokemiska signaler för att upprätthålla vävnad homeostas. Nuvarande syntetiska hydrogels erbjuder robust mekanisk stöd för cellodling in vitro- men saknar den nödvändiga protein och ligand sammansättningen för att framkalla fysiologisk beteende från celler. Detta manuskript beskriver en fabrication metod för en njure cortex ECM-derived hydrogel med ordentlig mekanisk robusthet och stödjande biokemiska sammansättning. Hydrogel är tillverkad av mekaniskt homogenisering och solubilizing cell-lösa mänskliga njurar cortex ECM. Matrisen bevarar infödda njure cortex ECM protein nyckeltal och även möjliggöra gelation till fysiologiska mekaniska stiffnesses. Hydrogel serverar som substrat vid vilken njure cortex-derived celler kan upprätthållas under fysiologiska betingelser. Dessutom kan hydrogel sammansättning manipuleras för att modellera en diseased miljö som möjliggör framtida studier av njursjukdomar.

Introduction

Extracellulär matrix (ECM) ger viktiga biofysiska och biokemiska signaler för att upprätthålla vävnad homeostas. Den komplexa molekylära sammansättningen reglerar både strukturella och funktionella egenskaper av vävnad. Strukturella proteiner förse cellerna med rumsuppfattning och möjliggöra adhesion och migration1. Destinerade ligands interagera med surface cellreceptorer att styra cell beteende2. Njure ECM innehåller en uppsjö av molekyler vars sammansättning och struktur varierar beroende på anatomiska läge, utvecklingsstadier och sjukdom stat3,4. Går igenom komplexiteten i ECM är en viktig aspekt i att studera njure-derived celler in vitro.

Tidigare försök att replikera ECM mikromiljö har fokuserat på decellularizing hela vävnad för att skapa ställningar kan recellularization. Decellularization har utförts med kemiska rengöringsmedel såsom natriumsulfat natriumdodecylsulfat (SDS) eller icke-joniskt rengöringsmedel, och det använder antingen hela orgel perfusion eller nedsänkning och agitation metoder5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. De ställningar som presenteras här bevara de strukturella och biokemiska signaler Funna i native vävnad ECM; Dessutom recellularization med givare-specifika celler har klinisk relevans i rekonstruktiv kirurgi14,15,16,17,18, 19. dock dessa ställningar saknar strukturella flexibilitet och därför är inkompatibla med många aktuella enheter som används för in vitro- studier. För att kringgå den här begränsningen har många grupper bearbetas vidare cell-lösa ECM till hydrogels20,21,22,23,24. Dessa hydrogeler är kompatibla med formsprutning och bioink och kringgå mikrometer skala rumsliga begränsningar som cell-lösa ställningar plats på celler. Dessutom bevaras molekylära sammansättning och nyckeltal i native ECM3,25. Här visar vi en metod för att fabricera en hydrogel som härrör från njure cortex ECM (kECM).

Syftet med detta protokoll är att producera en hydrogel som replikerar närmiljön i regionen njure kortikala. Njure cortex vävnad är cell-lösa i en 1% SDS lösning under ständig agitation ta bort cellulära fråga. SDS används ofta till decellularize vävnad på grund av dess förmåga att snabbt ta bort immunologiska cellulära material6,7,9,26. KECM är då föremål för mekanisk homogenisering och frystorka den5,6,9,11,26. Lösbarhet i en stark syra med pepsin resulterar i en slutlig hydrogel stamlösning20,27. Infödda kECM proteiner som är viktiga för strukturellt stöd och signal transduktion bevaras3,25. Hydrogel kan också vara geléartad till inom en beställa av storlek av infödda mänskliga njurar cortex28,29,30. Denna matris ger en fysiologisk miljö som har använts för att bibehålla rofylld av njure-specifika celler jämfört hydrogels från andra matrix proteiner. Dessutom matrix sammansättning kan manipuleras, exempelvis genom tillägg av kollagen-I, till modell sjukdom miljöer för studien av nedsatt fibros och andra njur sjukdomar31,32.

Protocol

Mänskliga njurar isolerades av LifeCenter nordväst efter etiska riktlinjer som fastställs av de Association av orgel upphandling organisationer. Detta protokoll följer djurens vård och cell-kultur riktlinjer beskrivs av University of Washington. 1. beredning av människans njure vävnad Beredning av decellularization lösning Sterilisera en 5000 mL bägare och en 70 x 10 mm rör bar. Blanda 1: 1000 (vikt: volym) sodium dodecyl sulfate (SDS) Ånghärdad avjonis…

Representative Results

Den kECM hydrogel erbjuder en matris för njure cellodling med liknande kemiska sammansättning som den infödda njure mikromiljö. För att fabricera hydrogel, är njure cortex vävnad mekaniskt isolerad från en hela njuren orgel och tärnade (figur 1). Decellularization med kemiska tvättmedel (figur 2A.1-A.3) följt av sköljning med vatten för att avlägsna rengöringsmedlet partiklar (…

Discussion

Matriser ger viktiga mekaniska och kemiska signaler som styr cellen beteende. Syntetiska hydrogels kan stödja komplexa 3-dimensionella mönster men misslyckas med att tillhandahålla olika extracellulära ledtrådar finns i fysiologiska matrix mikromiljö. Hydrogeler härrör från infödda ECM är perfekt material för både i vivo och in vitro- studier. Tidigare studier har använt cell-lösa ECM hydrogeler för att bestryka syntetiskt biomaterial för att förhindra värd immunologiska svar<sup clas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna vill erkänna Lynn och Mike Garvey Imaging Laboratory vid Institutet för stamceller och regenerativ medicin och LifeCenter nordväst. De skulle också vilja erkänna finansiella stöd av National Institutes of Health bidrag, UH2/UH3 TR000504 (att J.H.) och DP2DK102258 (till Y.Z.), NIH T32 utbildning grant DK0007467 (till R.J.N.) och en obegränsad gåva från Northwest njure centrerar till den Njure Research Institute.

Materials

Preparation of Kidney Tissue
5000 mL Beaker Sigma-Aldrich Z740589
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 436143
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Stir Bar (70 x 10 mm) Fisher Science 14-512-128
500 mL Vacuum Filter VWR 97066-202
Stir Plate Sigma-Aldrich CLS6795420D
1000 mL Beaker Sigma-Aldrich CLS10031L
Forceps Sigma-Aldrich F4642 Any similar forceps may be used
Scissor-Handle Hemostat Clamp Sigma-Aldrich Z168866
Dissecting Scissors Sigma-Aldrich Z265977
Scalpel Handle, No. 4 VWR 25859-000 Any similar scalpel handle may be used
Scalpel Blade, No. 20 VWR 25860-020 Any similar scalpel blade may be used
Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) Fisher Science 14-513-52
Absorbent Underpad VWR 82020-845
Petri Dish (150 x 25 mm) Corning 430597
Autoclavable Biohazard Bag VWR 14220-026
Sterile Cell Strainer (40 um) Fisher Science 22-363-547
Cell Culture Grade Water HyClone SH30529.03
30 mL Freestanding Tube VWR 89012-778
Fabrication of ECM Gel
Tissue Homogenizer Machine Polytron PCU-20110
Freeze Dryer Labconco 7670520
20 mL Glass Scintillation Vials and Cap Sigma-Aldrich V7130
Stir Bar (15.9 x 8 mm) Fisher Science 14-513-62
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa Sigma-Aldrich P7012
0.01 N HCl Sigma-Aldrich 320331 Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water
Kidney ECM Gelation
1 N NaOH (Sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1 N in cell culture grade water
Medium 199 Sigma-Aldrich M4530
15 mL Conical Tube ThermoFisher 339651
Cell Culture Media ThermoFisher 11330.032 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10082147
Antibiotic-Antimycotic 100X Life Technologies 15240-062
Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X Life Technologies 51300-044
1 mL Syringe Sigma-Aldrich Z192325
Microspatula Sigma-Aldrich Z193208

References

  1. Lelongt, B., Ronco, P. Role of extracellular matrix in kidney development and repair. Pediatric Nephrology. 18 (8), 731-742 (2003).
  2. Yue, B. Biology of the Extracellular Matrix: An Overview. Journal of Glaucoma. 23, S20-S23 (2014).
  3. Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney International. 56 (6), 2016-2024 (1999).
  4. Petrosyan, A., et al. Decellularized Renal Matrix and Regenerative Medicine of the Kidney: A Different Point of View. Tissue Engineering Part B. 22 (3), 183-192 (2016).
  5. Caralt, M., et al. Optimization and Critical Evaluation of Decellularization Strategies to Develop Renal Extracellular Matrix Scaffolds as Biological Templates for Organ Engineering and Transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (1), 64-75 (2015).
  6. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
  7. Nakayama, K. H., Lee, C. C. I., Batchelder, C. A., Tarantal, A. F. Tissue Specificity of Decellularized Rhesus Monkey Kidney and Lung Scaffolds. Public Library of Science ONE. 8 (5), (2013).
  8. Orlando, G., et al. Production and implantation of renal extracellular matrix scaffolds from porcine kidneys as a platform for renal bioengineering investigations. Annals of Surgery. 256 (2), 363-370 (2012).
  9. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
  10. Choi, S. H., et al. Development of a porcine renal extracellular matrix scaffold as a platform for kidney regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (4), 1391-1403 (2015).
  11. Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
  12. Nagao, R. J., et al. Decellularized Human Kidney Cortex Hydrogels Enhance Kidney Microvascular Endothelial Cell Maturation and Quiescence. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1140-1150 (2016).
  13. Gupta, S. K., Mishra, N. C., Dhasmana, A. Decellularization Methods for Scaffold Fabrication. Methods in Molecular Biology. , 1-10 (2017).
  14. Hudson, T., et al. Optimized Acellular Nerve Graft is Immunologically Tolerated and Supports Regeneration. Tissue Engineering. 10 (11), 1641-1651 (2004).
  15. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
  16. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
  17. Uygun, B., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularied liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).
  18. Nagao, R. J., et al. Preservation of Capillary-beds in Rat Lung Tissue Using Optimized Chemical Decellularization. Journal of Materials Chemistry B. 1 (37), 4801-4808 (2013).
  19. Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
  20. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
  21. Wolf, M. T., et al. A hydrogel derived from decellularized dermal extracellular matrix. Biomaterials. 33 (29), 7028-7038 (2012).
  22. Fisher, M. B., et al. Potential of healing a transected anterior cruciate ligament with genetically modified extracellular matrix bioscaffolds in a goat model. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 20 (7), 1357-1365 (2012).
  23. Ghuman, H., et al. ECM hydrogel for the treatment of stroke: Characterization of the host cell infiltrate. Biomaterials. 91, 166-181 (2016).
  24. Rijal, G. The decellularized extracellular matrix in regenerative medicine. Regenerative Medicine. 12 (5), 475-477 (2017).
  25. Lennon, R., et al. Global Analysis Reveals the Complexity of the Human Glomerular Extracellular Matrix. Journal of the American Society of Nephrology. 25 (5), 939-951 (2014).
  26. Bonandrini, B., et al. Recellularization of Well-Preserved Acellular Kidney Scaffold Using Embryonic Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1486-1498 (2014).
  27. O’Neill, J. D., Freytes, D. O., Anandappa, A. J., Oliver, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. The regulation of growth and metabolism of kidney stem cells with regional specificity using extracellular matrix derived from kidney. Biomaterials. 34 (38), 9830-9841 (2013).
  28. Streitberger, K. -. J., et al. High-resolution mechanical imaging of the kidney. Journal of Biomechanics. 47 (3), 639-644 (2014).
  29. Bensamoun, S. F., et al. Stiffness imaging of the kidney and adjacent abdominal tissues measured simultaneously using magnetic resonance elastography. Clinical Imaging. 35 (4), 284-287 (2011).
  30. Moon, S. K., et al. Quantification of Kidney Fibrosis Using Ultrasonic Shear Wave Elastography. Journal of Ultrasound in Medicine. 34, 869-877 (2015).
  31. Genovese, F., Manresa, A. A., Leeming, D. J., Karsdal, M. A., Boor, P. The extracellular matrix in the kidney: a source of novel non-invasive biomarkers of kidney fibrosis?. Fibrogenesis & Tissue Repair. 7 (1), (2014).
  32. Hewitson, T. D. Fibrosis in the kidney: is a problem shared a problem halved?. Fibrogenes & Tissue Repair. 5 (1), S14 (2012).
  33. Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
  34. Faulk, D. M., et al. ECM hydrogel coating mitigates the chronic inflammatory response to polypropylene mesh. Biomaterials. 35 (30), 8585-8595 (2014).
  35. Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels To Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
  36. Kim, M. -. S., et al. Differential Expression of Extracellular Matrix and Adhesion Molecules in Fetal-Origin Amniotic Epithelial Cells of Preeclamptic Pregnancy. Public Library of Science ONE. 11 (5), e0156038 (2016).
  37. Paduano, F., Marrelli, M., White, L. J., Shakesheff, K. M., Tatullo, M. Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells on Hydrogel Scaffolds Derived from Decellularized Bone Extracellular Matrix and Collagen Type I. Public Library of Science ONE. 11 (2), e0148225 (2016).
  38. Viswanath, A., et al. Extracellular matrix-derived hydrogels for dental stem cell delivery. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (1), 319-328 (2017).
  39. Uriel, S., et al. Extraction and Assembly of Tissue-Derived Gels for Cell Culture and Tissue Engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 15 (3), 309-321 (2009).
  40. Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
  41. Faust, A., et al. Urinary bladder extracellular matrix hydrogels and matrix-bound vesicles differentially regulate central nervous system neuron viability and axon growth and branching. Journal of Biomaterials Applications. 31 (9), 1277-1295 (2017).
  42. Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
  43. Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
  44. Pati, F., et al. Biomimetic 3D tissue printing for soft tissue regeneration. Biomaterials. 62, 164-175 (2015).
  45. Wang, R. M., Christman, K. L. Decellularized myocardial matrix hydrogels: In basic research and preclinical studies. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 77-82 (2016).
  46. Jang, J., et al. 3D printed complex tissue construct using stem cell-laden decellularized extracellular matrix bioinks for cardiac repair. Biomaterials. 112, 264-274 (2017).
  47. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
  48. Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 771-785 (2014).
  49. Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
  50. Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials – Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
  51. Uriel, S., et al. The role of adipose protein derived hydrogels in adipogenesis. Biomaterials. 29 (27), 3712-3719 (2008).
  52. Singelyn, J. M., et al. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
  53. Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
  54. Loneker, A. E., Faulk, D. M., Hussey, G. S., D’Amore, A., Badylak, S. F. Solubilized liver extracellular matrix maintains primary rat hepatocyte phenotype in-vitro. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (4), 957-965 (2016).
  55. Hill, R. C., Calle, E. A., Dzieciatkowska, M., Niklason, L. E., Hansen, K. C. Quantification of extracellular matrix proteins from a rat lung scaffold to provide a molecular readout for tissue engineering. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 961-973 (2015).
  56. Li, Q., et al. Proteomic analysis of naturally-sourced biological scaffolds. Biomaterials. 75, 37-46 (2016).
  57. Tanaka, T., Yada, R. Y. N-terminal portion acts as an initiator of the inactivation of pepsin at neutral pH. Protein Engineering. 14 (9), 669-674 (2001).
  58. Ligresti, G., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (8), 2370-2381 (2016).
  59. Mozes, M. M., Böttinger, E. P., Jacot, T. A., Kopp, J. B. Renal expression of fibrotic matrix proteins and of transforming growth factor-beta (TGF-beta) isoforms in TGF-beta transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (2), 271-280 (1999).
  60. Romanowicz, L., Galewska, Z. Extracellular matrix remodeling of the umbilical cord in pre-eclampsia as a risk factor for fetal hypertension. Journal of Pregnancy. 2011, 542695 (2011).

Play Video

Cite This Article
Hiraki, H. L., Nagao, R. J., Himmelfarb, J., Zheng, Y. Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel. J. Vis. Exp. (140), e58314, doi:10.3791/58314 (2018).

View Video