Summary
Hier presenteren we een praktische gids voor het bouwen van een geïntegreerde microscopie-systeem, dat wordt samengevoegd conventionele epi-belichting fluorescerende imaging, single-molecuul detectie gebaseerde Super resolutie beeldvorming en Multi-Color single-molecuul detectie, met inbegrip van single-molecuul fluorescentie resonantie energieoverdracht imaging, in één set-up op een kostenefficiënte manier.
Abstract
Fluorescentie microscopie is een krachtig hulpmiddel om biologische moleculen in situ ontdekken en hun dynamiek en interactie in real-time controleren. Naast conventionele epi-fluorescentie microscopie, zijn verschillende beeldvormende technieken ontwikkeld om specifieke experimentele doelen te bereiken. Enkele van de meest gebruikte technieken omvatten single-molecuul fluorescentie resonantie energieoverdracht (smFRET), die conformationele veranderingen en moleculaire interacties met angstrom resolutie en single-molecuul detectie gebaseerde rapporteren kan Super resolutie (SR) imaging, die de ruimtelijke resolutie van ongeveer tien tot twentyfold in vergelijking met diffractie-limited microscopie verbeteren kan. Hier presenteren we een klant ontworpen geïntegreerd systeem, dat wordt samengevoegd meerdere beeldvormende methoden in een Microscoop, met inbegrip van conventionele epi-belichting fluorescerende imaging, single-molecuul detectie gebaseerde SR imaging en Multi-Color single-molecuul detectie, inclusief smFRET imaging. Verschillende beeldvormende methoden kunnen gemakkelijk en reproducibly worden bereikt door over te schakelen van optische elementen. Deze set-up is eenvoudig te nemen door een onderzoekslaboratorium dat in de biologische wetenschappen met een behoefte aan routine en gevarieerde beeldvorming experimenten op een lagere kosten en ruimte ten opzichte van de bouw van aparte microscopen voor individuele doeleinden.
Introduction
Fluorescentie microscopen zijn belangrijke hulpmiddelen voor de moderne biologische wetenschap onderzoek en fluorescerende imaging wordt routinematig uitgevoerd in vele biologie laboratoria. Door biomoleculen van belang met fluorophores te labelen, kunnen we direct visualiseren ze onder de Microscoop en de tijd-afhankelijke wijzigingen vastleggen in lokalisatie, conformatie, interactie, en vergadering staat in vivo of in vitro. Conventionele fluorescentie microscopen hebben een ruimtelijke resolutie van diffractie-limited, die daarom ~ 200-300 nm in de laterale richting en ~ 500-700 nm in de axiale richting1,2, en zijn beperkt tot de beeldvorming op de 100s van nanometer-naar-micron schaal. Om te onthullen fijnere details in de moleculaire assembly of organisatie, hebben verschillende SR-microscopies die de diffractie-limiet breken kunnen ontwikkeld. Strategieën gebruikt om SR omvatten niet-lineaire optische effecten, zoals de gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie3,4 en gestructureerde verlichting microscopie (SIM)5,6, 7, stochastische detectie van afzonderlijke moleculen, zoals stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM)8 en photoactivated lokalisatie microscopie (PALM)9, en een combinatie van beide, zoals MINFLUX10. Onder deze microscopies SR, kunnen single-molecuul detectie gebaseerde SR microscopen relatief moeiteloos worden gewijzigd van een single-molecuul Microscoop set-up. Met de activering van de repetitieve en beeldvorming van photoactivatable fluorescente proteïnen (FPs) of foto-schakelbare kleurstoffen getagd op biomoleculen van belang, is ruimtelijke resolutie 10-20 nm11bereikbaar. Om te krijgen informatie over de moleculaire interacties en conformationele is dynamiek in real-time, angstrom-naar-nanometer resolutie vereist. smFRET12,13 is een benadering om deze oplossing te bereiken. In het algemeen, zijn afhankelijk van de biologische kwesties van belang, beeldvormende methoden met verschillende ruimtelijke resoluties nodig.
Meestal is voor elk type voor imaging, specifieke excitatie en/of emissie optische configuratie nodig. Bijvoorbeeld, is een van de meest gebruikte verlichting methoden voor single-molecuul detectie door middel van totale interne reflectie (TIR), waarin een specifieke excitatie hoek moet worden bereikt door middel van een prisma of door middel van het objectief. Voor de detectie van de smFRET moeten emissies van zowel donor als acceptor kleurstoffen worden ruimtelijk gescheiden en gericht op verschillende delen van het elektron-te vermenigvuldigen, charge - coupled apparaat (EMCCD), die kan worden bereikt met een set van spiegels en dichroïde beam splitters Geplaatst in het pad van de emissie. Voor driedimensionale (3-D) is SR imaging, een optische component, zoals een cilindrische lens14, nodig om een astigmatisme effect te veroorzaken in het pad van de emissie. Daarom, EIGENBOUW of verkrijgbare geïntegreerde microscopen, meestal, functioneel gespecialiseerd zijn voor elk type van imaging methode en zijn niet flexibel om te schakelen tussen verschillende beeldvormende methoden op de zelfde set-up. Hier presenteren we een kosteneffectieve, hybridesysteem waarmee verstelbaar en reproduceerbare Hiermee schakelt u tussen drie verschillende beeldvormende methoden: conventionele epi-belichting fluorescerende beeldbewerking met diffractie-beperkte resolutie, single-molecuul detectie gebaseerde SR beeldbewerking en Multi-Color single-molecuul detectie, met inbegrip van smFRET imaging (figuur 1A). In het bijzonder de hier gepresenteerde set-up bevat vezel-gekoppelde ingang lasers voor Multi-Color excitatie en een commerciële verlichting arm in het pad van excitatie, waardoor geprogrammeerd controle van de excitatie-hoek, om te schakelen tussen epi-modus en TIR. In het pad van de emissie, een verwisselbare EIGENBOUW cilindrische lens cassette is geplaatst binnen het lichaam van de Microscoop voor 3D-SR imaging en een commerciële balk splitter is geplaatst voor een EMCCD-camera die kan selectief worden ingeschakeld om te detecteren van meerdere kanalen van de emissie tegelijkertijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Microscoop constructie- en montage
-
Excitatie-pad
Opmerking: De excitatie-pad bevat lasers, differentiële interferentie contrast (DIC) onderdelen, het lichaam van de Microscoop en haar arm verlichting.- Een optische Vibratie-geïsoleerd-tabel voorbereiden. Bijvoorbeeld, geeft een structurele demping inhoudsopgave 48 x 96 x 12'' genoeg ruimte voor alle componenten.
Opmerking: Bouwen de set-up in een kamer met temperatuurregeling (bijvoorbeeld21.4 ± 0.55 ° C). Temperatuur stabiliteit is van cruciaal belang voor het behoud van de optische uitlijning. - Installeren van een Microscoop lichaam dat is uitgerust met een arm van de verlichting voor optische vezel verbinding, een 100 X olie-immersie objectief voor TIRF en DIC onderdelen.
- Plaats vier laser koppen (647 nm, 561 nm, 488 nm, en 405 nm, omcirkeld in figuur 1B) en hun warmte zakt op optische tafel, en zorg ervoor dat de uitgestoten laserstralen hebben dezelfde hoogte en zijn zo kort mogelijk te zijn om goede stabiliteit (bv 3'').
Opmerking: Als een laser-hoofd op een kortere hoogte dan andere lasers zit, plaatsen en een aluminiumplaat met voldoende dikte eronder. Zorg altijd ervoor maximale contact tussen de heatsinks en de optische tabel voor de beste warmtedissipatie (figuur 1B). De lasers moeten krachtig genoeg voor SR imaging. Zie tabel met materialen. Het is aanbevolen om de laser-opschonen filters voor Diodelasers hebben. - Installeer een gegevenskaart verwerving via een peripheral component interconnect (PCI)-interface in een werkstation en sluit lasers met deze kaart. Controle van de lasers' ON/OFF gedrag door transistor-transistor-logic (TTL) output, en de aanpassing van hun macht door de analoge uitgang van deze kaart (Figuur 1 c). Installeer een goede microscopie denkbaar software (commercieel of EIGENBOUW) om te bepalen van de data-acquisitie kaart, evenals de Microscoop lichaam.
- Montage van de spiegels en dichroïde beam splitters (590, 525 en 470 lange pass filters) met hun respectieve mounts. Gebruik zeer stabiel spiegel klemstroken voor de spiegels. Circulaire splitters met behoud van ringen om te voorkomen dat eventuele buiging van de dichroïde beam splitters (Figuur 1 d) gebruiken.
- Plaats de spiegels en dichroïde beam splitters op de optische tafel te combineren van de laserstralen (figuur 1B). Om te bereiken de meest stabiele uitlijning, de ganse regeling zo compact mogelijk te maken en gebruiken van 1''-dikte optische berichten. De lasers zo rangschikken dat het kortere golflengte lasers dichter bij de optische koppeling (figuur 1B), zijn omdat korte golflengte lichten meer in de lucht verdrijven.
- Laserstralen combineren tot een enkelvoudige modus optische vezel. Om dit te doen, door een fiber coupler te bouwen in een kooi-systeem bezorgd via de volgende stappen uit:
- Monteer een fiber adapter plaat in een z-as vertaling mount (figuur 1E, meest linkse paneel).
- Een achromatische doublet lens mount (brandpuntsafstand = 7,5 mm) in een kooi plaat (figuur 1E, tweede paneel van links).
- Sluit de twee delen boven door verlengstangen te vormen van een kooi. Monteer de kooi op de optische tafel met montagebeugels op de 1'' dikke optische posten (figuur 1E, middelste deelvenster).
- Sluiten de 647-nm laser eerst bij een enkelvoudige modus optische vezel (FC/APC daartoe het voorste koppelingsvlak).
Opmerking: Een ruwe uitlijning een multi-mode optische vezel te gebruiken voordat u de enkelvoudige modus optische vezel kan het helpen van het uitlijning proces. Aanpassen van de hoeken van de spiegels en dichroïde beam splitters (Figuur 1 d, door aanpassing knoppen), evenals de afstand tussen de Achromatische doublet lens en de fiber adapter plaat (figuur 1E, door aanpassing van de z-as vertaling mount) te krijgen maximale laservermogen door middel van de vezel. - Zodra de uitlijning van de eerste laser wordt gedaan, tijdelijk installeren van een paar van irissen en uitlijnen van de rest van de lasers één voor één (figuur 1F). Controleer de uitlijning efficiëntie met een Energiemeter.
- Laat een iris aan de voorkant van de plaat van de adapter om de reflecties van de lasers.
Opmerking: Sterke terug reflecties kunnen de levensduur van de laser bronnen verminderen. U kunt desgewenst kan een optische isolator worden geïnstalleerd voor elk hoofd laser de reflecties om volledig te verwijderen.
- Sluit het andere uiteinde van de optische vezel aan de tak van de verlichting van de Microscoop (Figuur 1 H).
- Ontwerpen en installeren van de "vergroting lens (mag lens)" door de volgende stappen:
Opmerking: De lasers voor epi-fluorescentie beeldvorming van het monster kunnen worden gebruikt, maar de grootte van de smalle lichtbundel van elke laser beperkt de verlichte ruimte van het monster tot een gebied meerdere malen kleiner is dan de werkelijke grootte van de bijbehorende camerasensor, speciaal voor de nieuwere camera's (met 18,8 mm in diagonale lengte in vergelijking met de conventionele 11,6 mm lengte). Het is dus wenselijk om uit te breiden van de lichtbundel te bereiken een groter en platter verlichting van het monster.- Het ontwerp van de lens van de mag, die in de arm van de verlichting (Figuur 1 H passen kan).
Opmerking: Het ontwerp van de lens mag afhankelijk van waar het zal worden geïnstalleerd. Figuur 1 H toont een voorbeeld van de installatie in de arm van de verlichting, maar het kan worden geïnstalleerd op elke plek nadat de laserstralen worden collimated (Zie discussie). Het ontwerp met een computer-aided design / opstelling software. - Plaats twee Achromatische lenzen, een concaaf (brandpuntsafstand = f1), en een convexe (brandpuntsafstand = f2) in de huisgemaakte mag lens houder (figuur 2A en 2 C), met een afstand gelijk aan de som van hun brandpuntsafstanden, f1 + f2 = (-25) + 50 = 25 mm (figuur 2B).
Opmerking: Met deze keuze van de brandpuntsafstanden, de lens mag breidt de lichtbundel door f2/ | f1| = 2 plooien. De mag-lens biedt veelzijdigheid. Het kan worden verwijderd om te hervatten reguliere verlichting zonder uitbreiding van de balken (figuur 2D) of ingevoegd in de omgekeerde richting te richten de laserstraal om een sterkere excitatie-intensiteit.
- Het ontwerp van de lens van de mag, die in de arm van de verlichting (Figuur 1 H passen kan).
- Een optische Vibratie-geïsoleerd-tabel voorbereiden. Bijvoorbeeld, geeft een structurele demping inhoudsopgave 48 x 96 x 12'' genoeg ruimte voor alle componenten.
2. luchtverontreiniging door emissies pad
Opmerking: De emissie pad bestaat uit een verwisselbare cilindrische lens, een filterwiel barrière, een emissie-splitter en een EMCCD camera (figuur 1G). Om te bereiken de beste punt verspreiden functie (PSF) van afzonderlijke moleculen, de DIC-prisma wordt uit de buurt van het objectief.
- Custom-ontwerp de cilindrische lens (3D-lens) cassette, die in de handmatige DIC analyzer passen kan invoegen sleuf in het lichaam van de Microscoop (Figuur 3 c).
Opmerking: Dit ontwerp niet afdoet aan de DIC analyzer aangezien een blok analyzer kan worden ingevoegd in het torentje van het filter. - Plaats van de 3D-lens van 10 m van brandpuntsafstand in de cassette en plaatst u deze in de emissie lichtbundel pad naar het effect van astigmatisme worden geschapen voor het extraheren van de z-coördinaat van elke één molecuul14.
Opmerking: Optioneel, de 3D-lens cassette kan worden geplaatst in of uit het pad van de emissie (Figuur 3 c). - Installeer een multi-band dichroïde balk splitter in het filter torentje binnenkant van het lichaam van de Microscoop.
- Emissie filters installeren.
Opmerking: De filters van de emissie worden gekozen afhankelijk van de voorkeur fluorophores. Afhankelijk van de beeldvorming module, worden emissie filters geplaatst op verschillende locaties gebruikt zoals hieronder beschreven:- Bij sequentiële Multi-Color epi-fluorescentie imaging of SR imaging, gebruik emissie filters geplaatst in de barrière filterwiel verbonden naast het lichaam van de Microscoop om te minimaliseren van de trilling in het lichaam van de Microscoop tijdens de channel-schakelaar (figuur 1G).
- Plaats voor de gelijktijdige Multi-Color detectie (b.v., smFRET-experimenten), een ander filter instellen in een emissie splitter (selectievakje stap 4 voor meer informatie).
Opmerking: Meestal een commerciële emissie splitter heeft twee schakelbare modi (dat wil zeggen, "betrokken" of "overslaan" modi). Als u wilt scheiden emissie lichten chromatisch voor gelijktijdige Multi-Color beeldvorming ("betrokken"-modus), een kubus van de filter houdt twee dichroïde beam splitters en drie emissie filters wordt gebruikt ("triple cube," figuur 4C en 4 D). Een lege sleuf in de barrière filterwiel wordt gebruikt in combinatie met de triple kubus. Aan de andere kant, voor sequentiële Multi-Color imaging, is de drievoudige kubus vervangen door een kubus die net een spiegel binnen ("bypass cube," figuur 4A en 4 D heeft).
- Installeer de EMCCD camera als het laatste deel van het pad van de emissie. Gebruik de USB-PCI-verbinding om een snelle framesnelheid.
Opmerking: Een EMCCD camera wordt aanbevolen voor de meest gevoelige detectie van single-molecuul kan, maar een geavanceerde sCMOS camera een alternatief.
3. diffractie-beperkte Imaging met Epi-excitatie
- Pas de excitatie lasers incidentele hoek epi-modus in de arm van de verlichting.
- Losraken van de 3D-lens als bezig (Figuur 3 c, rechter paneel).
- Plaats de rondweg kubus in de emissie-splitter (figuur 4A en 4E, onderste paneel).
- (Optioneel) Plaats de lens mag voor een bredere verlichting gebied (figuur 2D, linkerpaneel).
Opmerking: Met het gebruik van een mag-lens en een 100 X olie-immersie objectief, ongeveer 91 x 91 µm2 kan worden verlicht gelijkmatig, eliminerend de behoefte om een witte lichtbron en meerdere filter kubussen te gebruiken. - Een denkbaar software te nemen de Multi-Channel, microscopie en/of Z-stapel, en/of time-lapse afbeeldingen gebruiken.
Opmerking: Er zijn meerdere programma's beschikbaar voor microscopie imaging, niet alleen van Microscoop fabrikanten, maar ook van andere fabrikanten of open bronontwikkelaars.
4. multi-kanaals Single-molecuul Imaging met inbegrip van smFRET
Opmerking: Verplaatsen naar een "lege" positie in de barrière filterwiel, zodat alle de uitstoot met een golflengte in de tweede set met filters/dichroïde beam splitters in de splitter emissie kan bereiken.
- Voor het instellen van meerdere kleuren aanpassen single-molecuul detectie van oppervlak-geïmmobiliseerd moleculen15 met behulp van excitatie van de TIRF, met inbegrip van meting van de smFRET, de excitatie lasers incidentele hoek om de hoek van de TIRF. Los de mag-lens en de 3D-lens.
- De drie-kanaals mode deelnemen aan de emissie-splitter (figuur 1G) via de volgende stappen uit:
- Vervangen van de rondweg kubus met een "kalibratie kubus" waarmee licht om te gaan via alle kanalen (figuur 4B en 4E).
- Zet de camera onder DIC (dat wil zeggen, geen emissie filter in de barrière filterwiel) en pas van de opening van de emissie-splitter totdat drie volledig gescheiden kanalen op het scherm verschijnen.
Opmerking: Voeren deze stap met het licht van de kamer verlicht, zodat het visualiseren van alle kanalen. - De verticale/horizontale aanpassing controle knoppen inschakelen door de emissie-splitter en uitlijnen ruwweg de drie kanalen (figuur 4E en 4F).
- Uitschakelen van de camera en de kalibratie-kubus vervangen door een drievoudige kubus (figuur 4C en 4E).
- Plaats een monster met 100-nm meerkanaals kralen op de top van de 100 X objectief en focus op het monster.
- Zet de camera en de 488-nm laser, zoom in op een van de heldere kralen en fijn het uitlijnen van de drie kanalen door te draaien aan de aanpassing controle knoppen weer (figuur 4E en 4 G).
Opmerking: 100-nm meerkanaals kralen uitstoten verschillende golflengten van het licht op 488-nm excitatie, waardoor de drie-kanaals-uitlijning.
- Inschakelen van de camera en de lasers, de focus en vinden een goede positie met een redelijke plek dichtheid. De laser macht en blootstelling tijd tot aanvaardbare niveaus van signal-to-noise en photobleaching aanpassen. De microscopie beeldbewerkingssoftware gebruiken om time-lapse beelden te nemen.
5. SR Imaging
Opmerking: Dit is één-molecuul detectie gebaseerde SR microscopie.
- U stelt SR beeldvorming, invoegen van de 3D-lens en de lens mag verwijderen. Stel de blootstellingstijd van de camera in de juiste laser kanalen (bijvoorbeeld5-60 ms). Bepalen en de optimale excitatie lasers incidentele hoek om de hoek van de TIRF handmatig in te stellen.
- Breng de monsterhoeveelheid in SR imaging buffer16. Toestaan dat de buffer equilibreer gedurende ten minste 10 minuten vóór imaging.
Opmerking: SR imaging buffer verloopt na ongeveer 1 h, zodat nieuwe SR imaging buffer dienovereenkomstig. - Neem een beeld van de DIC voor SR imaging. Gebruiken om te vinden van de juiste objectieve hoogte voor SR, die het astigmatisme effect optimaliseert, DIC imaging om te zoeken naar het middelste vlak van de cellen. Identificeren van het vliegtuig door de hoogte waarop de cellen overgang van "licht" tot "dark" beelden en lijken te worden transparant (figuur 5A, 5Ben 5 C). Nadat de gewenste brandvlak is vastgesteld, gaan de z-drift correctie systeem (figuur 1A).
- Gedrag SR imaging. De kracht van de laser van 405 nm te houden een redelijke dichtheid van 'knipperen-on' plekken te wijzigen.
Opmerking: Hoewel het mogelijk handmatig wijzigen van de laser van 405 nm, is het handiger een geprogrammeerde gegevens overname code te handhaven van de dichtheid van "knipperen-on" vlekken uit te voeren. Hier is een voorbeeld van hoe het verloopt automatisch. De broncode is beschikbaar op aanvraag (Figuur 6).- Start de imaging overname met 0 W/cm2 violet laser belasting.
- Het aantal knipperende-op plekken in een bepaalde periode.
- De kracht van de violette laser moduleren zodat het aantal knipperende-op plekken wordt gehouden boven een user-defined "tellen drempel" in het gezichtsveld. De kracht van de violette laser verhogen wanneer het aantal knipperende-op plekken onder de drempel te tellen daalt.
- De overname beëindigen wanneer het aantal knipperende-op plekken daalt de tellen drempel met behulp van de kracht van de maximale violette laser.
Opmerking: De maximale kunnen instellen anders afhankelijk van de helderheid van het monster, maar niet hoger dan 130 W/cm2. Afhankelijk van het werkelijke doel van de SR-beeldvorming, kan deze automatische overname code handmatig worden beëindigd op elk gewenste moment.
- Controleer de knipperende gedrag en spinnen bestemde van de plekken snel na het begin van de overname.
Opmerking: Als het knipperende gedrag niet ideaal is, de excitatie lasers incidentele hoek wijzigen of vervangen van de beeldvorming buffer. Verwachten een steekproef van de "verticale", "horizontal" en "diamant" vormen van PSF, respectievelijk fluorophores van beneden, boven, en binnen het brandvlak, (figuur 5D). Als de meeste spots Toon verticaal of horizontaal spinnen bestemde, vervolgens het brandvlak uitstaat vanuit het midden van de cellen, dus het experiment beëindigen en het brandvlak opnieuw aanpassen. Een aanwezigheid van de luchtbel in de immersie-olie of andere lokale factoren, kan dit gevolgen hebben voor de spinnen bestemde kwaliteit, dus het kan nodig zijn om de olie vervangen of wijzigen in een ander gebied van de beeldvorming van het monster. - Voor de data-analyse, open bron (in NIH ImageJ plugins) of commercieel beschikbare codes op te sporen centroids van elke plek in elk imaging frame en uittreksel van z-waarden van elke vlek uit de x - en y-breedtes14te gebruiken.
Opmerking: In dit verslag, een broncode oorspronkelijk ontwikkeld in een van de vroegste single-molecuul detectie gebaseerde SR8 is bewerkt voor 3D-detectie16 en werd gebruikt. - In het geval van twee kleuren imaging, het imago van de fluorophore met de langere golflengte van excitatie, gevolgd door degene met de kortere golflengte van excitatie. De geautomatiseerde acquisitie-code op dezelfde manier uitvoeren aan degene die zijn beschreven in stap 5.4, maar met een verschillende beeldvormende laser.
Opmerking: chromatische aberratie moeten worden gecorrigeerd tussen afbeeldingen met verschillende fluorophores (bijvoorbeeld, rode kleurstof en geel-groene kleurstof). Hier zijn de stappen.- Immobiliseren meerdere 100 nm meerkanaals parels op het glas dekglaasje aan, vermijden van de vorming van clusters.
- Het nemen van beelden van hen in verschillende excitatie kanalen.
- Uittreksel hun (X, Y, Z) door software (stap 5.6 coördineert).
- Uitzetten ΔXik = X1i - X2i en ΔYi = Y1i - Y2i (ik is voor verschillende parels en 1 en 2 zijn verschillende kleurkanalen) afzonderlijk en ze passen met de juiste functies. Sla de functies.
Opmerking: Het lineaire functies zijn in de meeste gevallen voldoende. Zodra deze functies zijn bepaald, hoeft deze meting niet te worden herhaald telkens voor imaging. - In de werkelijke twee kleuren SR beeldvorming van een steekproef van belang, de functies van toepassing op de juiste (X, Y) chromatische aberratie. Voor z-directionele chromatische aberratie, voeren het door het verkrijgen van ΔZ = Z1 - Z-2 voor meerkanaals kralen of bekende meerkanaals referentiemonsters ontpit samen met het monster van belang.
Opmerking: in tegenstelling tot (X, Y) chromatische aberratie, z-directionele chromatische aberratie is niet goed-reproduceerbaar in elk experiment, voornamelijk als gevolg van onvolledige z-directionele focus onderhoud op het kanaal over te schakelen. Dus is het aangeraden om uit te voeren van de correctie telkens. ΔZ = Z1 - Z-2 is meestal onafhankelijk van (X, Y), dus gewoon een paar kralen of referentiemonsters voldoende per elke samplegebied van belang zou zijn. Uitzetten van de geconstrueerde laatste twee kleuren SR beelden in een 3D-visualisatie software en ΔZ handmatig controleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze microscoop kan flexibel en reproduceerbare schakelen tussen verschillende beeldvormende methoden. Hier laten we steekproefbeelden verzameld met elke imaging module.
Figuur 5D toont de PSF van het molecuul knipperen-op tijdens de overname SR. Duizenden van dergelijke beelden worden gereconstrueerd voor het genereren van het eindbeeld SR (figuur 5E). Figuur 5E toont de dezelfde bacteriële regelgevende RNAs zoals weergegeven in de afbeelding van de epi-fluorescentie in figuur 7A. Figure 7 toont de representatieve epi-fluorescentie beelden van een klein regelgevende RNA in Escherichia coli cellen en een mRNA in U2OS zoogdiercellen. Beide RNAs worden aangeduid met fluorophore-gelabeld DNA oligo via in situ hybridisatie17. Figuur 8 toont de meting van de representatieve smFRET van gevouwen molecules van RNA gemarkeerd met kleurstof (groene kleurstof) van de donor en acceptor kleurstof (rode kleurstof). De complexen zijn geïmmobiliseerd op het microscoopglaasje en opgewonden door TIRF verlichting. Fluorescentie intensiteit trajecten kunnen worden geëxtraheerd uit individuele afzonderlijke moleculen, genereren FRET efficiëntie als functie van de tijd.
Figuur 1: het ontwerp van de Microscoop set-up. (A) dit paneel toont een diagram van de set-up. M = spiegel, DBS = dichroïde balk splitter, LCF = laser opschonen filter, ik iris, L = lens, AP = adapter plaat, ZTM = = z-as translationeel mount, van = optische vezel, OFC = optische koppeling, CL = cilindrische lens, TL buis lens, EF = = emissie filter/de filters, Obj = doel lens, en SM = stap motor. De z-drift correctie systeem beweegt de motor stap op het neusstuk van het objectief naar de tegenovergestelde richting van de z-drift, die wordt berekend door het signaal van de infrarood (IR) gegenereerd door eigen LED en door eigen detector gedetecteerd. (B) dit paneel toont de vergadering van de excitatie van de laser. Vier lasers worden gecombineerd door middel van spiegels en dichroïde beam splitters en worden vervolgens doorgestuurd naar een optische vezel door middel van een focus lens en een adapter plaat zittend op een translationeel mount (onderkant van de afbeelding). (C) dit paneel toont de modulatie van de laser. Twee bajonet Neill-Concelman (BNC) kabels worden aangesloten op elk van de laser (het hoofd of de controller, afhankelijk van de fabrikant) voor TTL- en analoge modulatie (meest linkse paneel). BNC Kabels worden gecombineerd tot een enkele kabel (middelste deelvenster) die is verbonden met een overname gegevenskaart in een workstation (meest rechtse paneel) voor controle van de computer. (D) dit paneel toont de spiegel en dichroïde balk splitter mounts. (E) opbouw van een fiber coupler in een kooi-systeem. Een glasvezel adapter plaat (AP) is gemonteerd in een z-as vertaling mount (ZTM), zodat de afstand tot de Achromatische dubbele lens (L1, zijaanzicht weergegeven) kan worden gedifferentieerd. AP en ZTM hebben bijpassende draden, hetzelfde als L1 en de plaat van de kooi. (F) A paar irissen (omsluit) worden geïnstalleerd tijdens de alignement procedure voor meerdere lasers. Ze worden gebruikt om ervoor te zorgen dat de 647-nm laser (linkerdeel) en de 561-nm laser (rechtervenster) gaan via hetzelfde pad. (G) A gedeeltelijke gedeelte van de emissie-pad wordt weergegeven. Buiten het lichaam van de Microscoop, worden de emissie filterwiel, de emissie-splitter en de camera van de EMCCD geïnstalleerd in de volgorde. (H) dit paneel toont de vergadering van de arm van de verlichting. De mag-lens wordt ingevoegd in de arm van de verlichting. De excitatie-laserstralen worden verzonden naar de arm van de verlichting door de optische vezel en de optische koppeling (aan de rechterkant van de afbeelding). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: de lens mag. (A) dit paneel toont orthografische projecties van de houder huisvesting lenzen voor het vergroten van de laserstralen (eenheid: mm). Dit ontwerp is bedoeld om te worden past op de arm van de verlichting. (B) dit paneel toont een interne tekening van het gat in de houder waar krijgen twee lenzen in. L1 is een concave lens L2 is een bolle lens en de afstand tussen hen is de som van hun brandpuntsafstanden. (C) Dit is een foto van de mag-lens. (D) de mag-lens kan worden ingevoegd in de arm van de verlichting uit te breiden of richten van de laserstralen (links) of kan worden verwijderd om te houden van de laserstralen ongewijzigd (rechts). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: de 3D-lens. (A) dit paneel toont orthografische projecties van de houder met een lege ronde gat voor de bypass-modus en een rechthoekige gat voor het houden van de cilindrische lens (eenheid: mm). Dit ontwerp is bedoeld om te worden aangepast gemeten de DIC analyzer-schuifregelaar in het lichaam van een microscoop. (B) Dit is een foto van de 3D-lens. (C) het cilindrische lens kan worden betrokken bij het pad van de lichtbundel emissie spinnen bestemde met astigmatisme (links) veroorzaakt of kan worden ontkoppeld voor de bypass-modus, houden de spinnen bestemde intact (rechts). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: meerkanaals uitlijning van de emissie-splitter. Regelingen van optica en lichtpad staan in de emissie splitter met (A) een bypass kubus, (B) een kalibratie cube, en (C) een triple kubus. M = spiegel. De rondweg kubus heeft een spiegel binnen (M5) en wordt verondersteld te worden gebruikt met een emissie-filter (EF) in de barrière filterwiel. De kalibratie-kubus heeft beam splitters (BS), waarmee de verlichting om te gaan via alle kanalen. De drievoudige kubus heeft twee dichroïde beam splitters (DBS), alsmede drie emissie filters. (D) Dit zijn de foto's van de drie blokjes. (E) de interne markt van de emissie-splitter wordt weergegeven zonder een kubus (bovenste deelvenster) en met een kubus (lagere paneel) glijden. M3 is achter M4 en niet gevangen in de foto. Controle knoppen voor de spiegels zijn op de top van de emissie-splitter (bovenste deelvenster). (F) dit paneel toont kanaal uitlijning met behulp van de kubus kalibratie onder DIC. (G) dit paneel toont een fijne aanpassing van de groene (bovenzijde) en rood (middelste deelvenster) kanalen met 100-nm meerkanaals kralen en een triple kubus. Een samengevoegde beeld van de twee kanalen wordt ook getoond (onderste paneel). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: vertegenwoordiger SR Beeldacquisitie. Deze panelen tonen een representatieve DIC (A) onderstaande afbeelding, (B) bij, of (C) boven het midden vlak van de cellen. (D) dit paneel toont een voorbeeld van de PSF van de fluorophores knipperen-op. De oranje cirkel omringt een "vertical" PSF De groene cirkel omringt een "horizontale" PSF De blauwe cirkel omringt een diamant-vormige PSF, fluorophores aan een gerichte vlak vertegenwoordigen. (E) dit paneel toont dat een vertegenwoordiger gereconstrueerd SR afbeelding. Een klein regelgevende RNA wordt gelabeld met fluorescentie in situ hybridisatie met rode kleurstof. De witte randen markeren de randen van de cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: een geprogrammeerde gegevens overname code voor SR imaging. In deze programmeerbare acquisitie module, diverse uitvoering opdrachten en Microscoop controlefuncties staan in het linker paneel en geprogrammeerde overname code maken kunnen worden geselecteerd. De opdrachten worden opeenvolgend uitgevoerd van boven naar beneden. Deze screenshot toont een voorbeeld waar een vooraf gedefinieerde dat aantal herhaalde imaging overnames worden uitgevoerd totdat de verwerving wordt gesteld en het aantal plekken in drie opeenvolgende afbeeldingsframes wordt berekend. Als het gemiddelde aantal van deze vlekken boven de drempel (gedefinieerd als 50% van het aantal cellen in de bacteriële imaging), blijft de Beeldacquisitie in de dezelfde lus. Als de drempel, dan blijft de Beeldacquisitie in de next-lus waar sterker violet laser macht wordt gebruikt (ontneemt aan de onderkant van de screenshot). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: vertegenwoordiger epi-fluorescentie beelden. (A) dit paneel toont een klein regelgevende RNA in cellen van E. coli . (B) dit paneel toont een mRNA in U2OS zoogdiercellen. RNAs zijn gelabeld met rode kleurstof en blauwe kleurstof door fluorescentie in situ hybridisatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: voorbeeld voor smFRET imaging. (A) monsters waren enthousiast met de laser 561-nm. (B) emissies door de groene en rode kleurstoffen zijn verzameld en weergegeven als groen (rechts) en rood (links) plekken, respectievelijk. (C) dit paneel toont de representatieve fluorescentie intensiteit vs. tijd trajecten van groene kleurstof (groen) en rode kleurstof (rood) van een molecule. (D) dit paneel toont de FRET efficiëntie vs. de tijd traject (ononderbroken blauwe lijn) berekend als ikAcceptor/ (ikDonor + IAcceptor) van een molecule van het monster. De FRET trace is uitgerust met de verborgen Markov Model (gestippelde rode lijn). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze hybride Microscoop systeem elimineert de noodzaak voor de aankoop van meerdere microscopen. De totale kosten voor alle onderdelen, inclusief de optische tabel, tabel installatie arbeid, software en werkstation, is ongeveer 230.000 dollar. Aangepaste-machinaal bewerkte onderdelen, inclusief de mag lens en 3D-lens, kost ongeveer $700 (de kosten hangt af van de werkelijke kosten bij verschillende instituten). Typische verkrijgbare geïntegreerde systemen voor single-molecuul detectie gebaseerde SR microscopie meer dan 300.000 dollar kosten ~ 400.000 en zijn niet gemakkelijk beschikbaar voor smFRET meting, of epi-imaging voor een redelijke gezichtsveld, zonder wit licht Bron. Zo kunnen de hier gepresenteerde benadering beeldvormende mogelijkheden gelijkwaardig zijn aan meerdere microscopen tegen een sterk gereduceerde prijs.
Dit stelsel van gemoduleerde Microscoop kan worden gebaseerd op Microscoop organen van verschillende fabrikanten. De 3D-lens kan potentieel worden geïnstalleerd in elke positie in het pad van de uitstoot, met inbegrip van binnen de emissie-splitter, binnen het lichaam van de Microscoop of in de beschikbare ruimte tussen de filterwiel en de objectieve neusstuk. De fysieke locatie van de 3D-lens zal echter de brandpuntsafstand voor het bereiken van de beste astigmatisme effect voor 3D-SR imaging bepalen. We raden aan te beginnen met een 10-meter brandpuntsafstand. Het mag objectief is in wezen een lichtbundel expander geïnstalleerd in de excitatie-pad. Als de excitatie-lasers lucht-combinatie zijn (dwz., zonder optische vezel), het is triviaal om dergelijke een expander installeren op elke plek nadat de laserstralen worden collimated. Als de excitatie-lasers vezel-combinatie zijn, kijk dan voor extra sleuven twee lenzen (een concaaf en de andere een convex) installeren. Bijvoorbeeld, hebben veel commerciële verlichting wapens "slots" voor neutrale-opaciteitsfilters. Vind twee lenzen met de som van hun brandpunten gelijk is aan de afstand tussen de twee sleuven. Vervolgens kunnen ze worden ingevoegd om te functioneren als een mag-lens. Een mount voor de veld middenrif schuifregelaar kunnen ook een andere plaats, indien beschikbaar. Het bouwen van de lens mag in een verwijderbare cassette heeft het bijkomende voordeel van het inschakelen van één te richten de excitatie-lasers om hogere macht, die nodig voor SR imaging, zijn kan simpelweg door het omkeren van de richting van de mag-lens.
In dit verslag toonden we flexibel schakelen tussen drie verschillende beeldvormende technieken met behulp van een gemoduleerde Microscoop. Deze set-up kan voor een bredere en meer gevorderde toepassingen worden gebruikt. Bijvoorbeeld, de SR-configuratie kan worden gebruikt voor single-deeltje bijhouden in levende cellen, op foto-schakelbare of photoactivatable TL proteïne-gelabeld biomoleculen van belang18,19. De configuratie van de smFRET kan worden gebruikt om te bestuderen van de moleculaire interacties in in-vivo systemen20. De emissie splitter gebaseerde meerkanaals detectie kan worden gecombineerd met de SR-configuratie voor het uitvoeren van twee kleuren SR beeldbewerkings- of single-deeltje bijhouden gelijktijdig21.
Deze set-up kan verder worden uitgebreid zodat meer gedifferentieerde onderdelen. Bijvoorbeeld, kan een andere laag van filter torentje en verlichting compartiment worden toegevoegd, zodat extra excitatie/emissie paden voor extra kanalen, zoals met een infrarood (IR) laser voor imaging-monsters aangeduid met IR kleurstoffen kunnen worden gemaakt. Naast de toegevoegde beeldvorming kanaal, kunnen IR-lasers worden gebruikt om te corrigeren van de drift van de etappe in SR beeldbewerking tijdens imaging verwerving of tijdens de post-analyse. Voor drift correctie tijdens imaging acquisitie, als de z-drift correctie systeem niet beschikbaar bij de fabrikant van de Microscoop is, kan een alternatief systeem met IR laser ofwel EIGENBOUW14 of verworven van derden. Voor na overname drift correctie, kan een IR-laser worden gebruikt voor het bijhouden van fiducial markeringen. 22
Single-molecuul detectie gebaseerde SR microscopie vereist twee sets van software, een voor data-acquisitie en een voor data-analyse. Voor data-acquisitie, zelfs een eenvoudige EIGENBOUW software die beelden via de camera neemt de beheersing van de lasers' ON/OFF gedrag kan werken voor het genereren van SR beelden, hoewel het mogelijk is om handmatig het moduleren van de 405-nm laser macht, bijvoorbeeld door het draaien van een kleurovergang neutrale-opaciteitsfilter geïnstalleerd voor de laser. Deze manier van uitvoeren van het experiment is echter afhankelijk van de experimentator subjectief oordeel van de dichtheid van knipperen-op plekken. Dus, op deze manier is niet objectief en wellicht niet geschikt om voor de kwantificering van SR imaging gegevens worden gebruikt. De hier gebruikte code voor de overname van gegevens omvat ter plaatse detectie / een tellen algoritme terwijl de data-acquisitie loopt, waardoor automatische modulatie van de 405-nm laser macht op basis van de dichtheid van knipperen-op plekken (Figuur 6). Tegenwoordig bieden sommige fabrikanten Microscoop programmeerbare imaging modules, zodat kan gebruik maken van deze, of zoekt u plugins uit open bronnen zoals Micro-Manager. Voor de data-analyse is het mogelijk te gebruiken commercieel beschikbare analyse modules van Microscoop fabrikanten of plugins uit open bronnen zoals ImageJ zoekt.
Kortom biedt de set-up die hier gepresenteerd hoge veelzijdigheid en eenvoudig schakelen tussen verschillende beeldvormende configuraties tegen een verminderde prijs en ruimte. Deze set-up is relatief eenvoudig te nemen door een onderzoekslaboratorium dat in de biologische wetenschappen met een behoefte aan routine en gevarieerde beeldvorming experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
J.F. erkent steun van het programma van de geleerden Searle en van de directeur van de NIH New Innovator Award. De auteurs erkennen nuttige suggesties van Paul Selvin de lab (Universiteit van Illinois, Urbana-Champaign) voor het plaatsen van de 3D-lens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
References
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
