Summary
Här presenterar vi en praktisk vägledning för att bygga ett integrerat mikroskopi system, som sammanfogar konventionella epi-fluorescerande imaging, singel-molekyl baseras på upptäckt super resolution imaging och flerfärgade singel-molekyl upptäckt, inklusive singel-molekyl fluorescens resonans energiöverföring imaging, in i en uppspänning på ett kostnadseffektivt sätt.
Abstract
Fluorescensmikroskopi är ett kraftfullt verktyg att upptäcka biologiska molekyler i situ och övervaka deras dynamik och interaktioner i realtid. Utöver konventionella epi-fluorescensmikroskopi, har olika bildgivande tekniker utvecklats för att uppnå specifika experimentella mål. Några av de allmänt använda teknikerna inkluderar singel-molekyl fluorescens resonans energiöverföring (smFRET), som kan rapportera konfirmerande förändringar och molekylära interaktioner med Ångström upplösning och singel-molekyl baseras på upptäckt super-upplösning (SR) imaging, som kan förbättra den rumsliga upplösningen som är ungefär tio till fasreaktioner jämfört med diffraktion begränsad mikroskopi. Här presenterar vi ett Kunddesignade integrerade system, som sammanfogar flera avbildningsmetoder i ett mikroskop, inklusive konventionella epi-fluorescerande imaging, singel-molekyl baseras på upptäckt SR imaging och flerfärgade singel-molekyl upptäckt, inklusive smFRET imaging. Olika avbildningsmetoder kan uppnås enkelt och reproducibly genom att byta optiska element. Detta upplägg är lätt att anta av någon research laboratory i biologiska vetenskaper med behöver rutin och olika imaging experiment till en reducerad kostnad och utrymme i förhållande till bygga separata Mikroskop för enskilda ändamål.
Introduction
Fluorescens Mikroskop är viktiga verktyg för den moderna biologiska vetenskap forskningen och fluorescerande imaging utförs rutinmässigt i många biologi laboratorier. Genom att tagga biomolekyler intresse med fluorophores, kan vi direkt visualisera dem under mikroskopet och registrera de tidsberoende förändringarna i lokalisering, konformation, interaktion, och församlingen staten in vivo eller in vitro. Konventionella fluorescens Mikroskop har en diffraktion begränsad rumslig upplösning, som är ~ 200-300 nm i lateral riktning och ~ 500-700 nm i axiell riktning1,2, och är därför begränsat till imaging på 100s av nanometer-till-micron skala. För att avslöja finare detaljer i molekylär församling eller organisation, har olika SR microscopies som kan bryta diffraktionsgränsen utvecklats. De strategier som används för att uppnå SR är icke-linjär optiska effekter, såsom stimulerad emission utarmning (STED) mikroskopi3,4 och strukturerade belysningen mikroskopi (SIM)5,6, 7, stokastiska detektion av enstaka molekyler, såsom stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi (STORM)8 och photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM)9och en kombination av båda, såsom MINFLUX10. Bland dessa SR microscopies, kan single-molekyl baseras på upptäckt SR Mikroskop ändras relativt enkelt från ett enda-molekyl Mikroskop set-up. Med repetitiva aktivering och tänkbar photoactivatable fluorescerande proteiner (FPs) eller foto-omkopplingsbar färgämnen taggade på biomolekyler sevärdheter, kan rumslig upplösning nå 10-20 nm11. För att få information om molekylära interaktioner och konfirmerande krävs dynamik i realtid, Ångström-till-nanometers upplösning. smFRET12,13 är en strategi för att uppnå denna resolution. Beroende på de biologiska frågorna av intresse behövs i allmänhet avbildningsmetoder med olika rumsliga upplösningar.
Vanligtvis för varje typ av imaging behövs specifik excitation eller utsläpp optisk konfiguration. Exempelvis är en av de vanligaste belysning metoderna för singel-molekyl upptäckt genom Totalreflexion (TIR), där en viss magnetisering vinkel måste uppnås antingen genom en prisma eller genom objektivet. För smFRET detektering måste utsläppen från både givare och acceptor färgämnen rumsligt avskiljas och riktad till olika delar av den elektron-multiplicera, kostnad – tillsammans enhet (elektrisk), som kan uppnås med en uppsättning av speglar och dichroic beam splitters placeras i sökvägen utsläpp. För tredimensionell (3-D) behövs SR imaging, en optisk komponent, såsom en cylindrisk lins14, för att orsaka en astigmatism effekt i sökvägen utsläpp. Därför hemmabyggd eller kommersiellt tillgängliga integrerat Mikroskop är, oftast, funktionellt specialiserade för varje typ av imaging metoden och är inte flexibla att växla mellan olika avbildningsmetoder på samma upplägg. Här presenterar vi ett kostnadseffektivt, hybridsystem som ger justerbar och reproducerbara växlar mellan tre olika avbildningsmetoder: konventionella epi-fluorescerande imaging med diffraktion begränsad upplösning, singel-molekyl baseras på upptäckt SR Imaging och flerfärgade singel-molekyl detektering, inklusive smFRET imaging (figur 1A). Specifikt, set-up presenteras här innehåller fiber-kopplade ingående lasrar för flerfärgade excitation och en kommersiell belysning arm i sökvägen excitation, som tillåter programmerade kontroll av magnetiseringen lutning, växla mellan epi- och TIR-läge. I sökvägen utsläpp, en flyttbar hemmabyggd cylindriska linsen kassett är placerad inom Mikroskop kroppen för 3D-SR avbildning och en kommersiell stråldelare placeras före en elektrisk kamera som selektivt kan aktiveras att upptäcka flera utsläpp kanaler samtidigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mikroskopet Design och montering
-
Magnetiseringen sökväg
Obs: Excitation sökvägen innehåller lasrar, differentiell störningar kontrast (DIC) komponenter, Mikroskop kroppen och dess belysning arm.- Förbereda en vibration-isolerade optiska tabell. Exempelvis ger en strukturell dämpning tabell över 48 x 96 x 12'' tillräckligt med utrymme för alla komponenter.
Obs: Bygga set-up i ett rum med temperaturkontroll (t.ex., 21,4 ± 0.55 ° C). Temperaturstabilitet är kritiska för upprätthållande optiska justeringen. - Installera en Mikroskop kropp som är utrustad med en belysning arm för optisk fiberanslutning, 100 X Oljeimmer Frida objektiv och DIC komponenter.
- Placera fyra laser huvuden (647 nm, 561 nm, 488 nm och 405 nm, inringade i figur 1B) och deras värme sjunker på optiska bordet och se till att de utsläppta laserstrålar har samma höjd och är så korta som möjligt för att säkerställa god stabilitet (t.ex. 3'').
Obs: Om en laserhuvudet sitter på en kortare höjd än andra lasrar, sätta en aluminiumplåt med lämplig tjocklek undertill. Alltid säkerställa maximal kontakt mellan kylare och optiska tabellen för den bästa värmeavledning (figur 1B). Lasrar måste vara tillräckligt kraftfullt för SR imaging. Se tabell över material. Det rekommenderas att ha laser sanering filter framför Diodlasrar. - Installera ett datakort förvärvet genom ett peripheral component interconnect (PCI) gränssnitt i en arbetsstation och ansluter lasrar med detta kort. Styra lasrar ON/OFF beteenden av transistor-transistor logic (TTL) utgång, och deras makt justering av analog utgång av detta kort (figur 1 c). Installera en ordentlig mikroskopi bildhanteringsprogram (kommersiella eller hemmabyggd) att styra förvärv datakortet, samt Mikroskop kroppen.
- Montera speglar och dichroic beam splitters (590, 525 och 470 länge passera filter) till deras respektive fästen. Använd mycket stabil spegel fästen för speglarna. Använda cirkulära splitters med Spårringar för att undvika eventuella böjning av de dichroic beam splitters (figur 1 d).
- Placera speglar och dichroic beam splitters på tabellen optiska att kombinera laserstrålar (figur 1B). För att uppnå den mest stabila justeringen, gör hela arrangemanget så kompakt som möjligt, och Använd 1''-tjocklek optiska inlägg. Ordna lasrar så att kortare våglängd lasrar är närmare optisk fiber koppling (figur 1B) eftersom kort våglängd ljuset försvinna mer i luften.
- Kombinera laserstrålar i en single-mode optisk fiber. Till gör så, bygga en fiber koppling i en bur-systemet genom följande steg:
- Montera en Adapterplatta för fiber i en z-översättning montera (figur 1E, längst till vänster panel).
- Montera en akromatisk doublet objektiv (brännvidd = 7,5 mm) i en bur-tallrik (figur 1E, andra panelen från vänster).
- Anslut de två delarna ovanför förlängningsstänger att bilda en bur. Montera flaskhållaren på optiska bordet med fästplatta 1'' tjock optiska inlägg (figur 1E, mellersta panelen).
- Justera 647-nm laser först med en single-mode optisk fiber (FC/APC slutet till fästet).
Obs: En grovuppriktning använda en multi-mode fiberoptiska innan du använder single-mode optisk fiber kan hjälpa justeringsprocessen. Justera vinklarna på speglarna och dichroic beam splitters (figur 1 d, av justeringsreglagen), samt avståndet mellan objektivets akromatisk doublet och fiber adapterplattan (figur 1E, genom att justera z-översättning mount) att få maximala laser uteffekten genom fibern. - När anpassningen av den första lasern är gjort, tillfälligt installera ett par iris och justera resten av lasrar ett (figur 1F). Kontrollera justeringen effektivitet med en kraftmätare.
- Lämna en iris framsidan adapterplattan att minska reflektioner av lasrar.
Obs: Starkt tillbaka reflektioner kan minska livslängden på laserkällor. Alternativt kan en optisk-isolator installeras framför varje laserhuvudet ta bort reflektioner helt.
- Anslut den andra änden av den optiska fibern till belysning armen av mikroskopet (figur 1 H).
- Designa och installera ”förstoring lins (mag lins)” genom följande steg:
Obs: Lasrar kan användas för påljusfluorescens avbildning av provet, men smal stråle storleken på varje laser begränsar det belysta området av provet till ett område flera gånger mindre än den faktiska storleken på motsvarande kamerasensorn, särskilt för de nyare Kameror (med diagonala längd jämfört med den konventionella 11,6-mm längden 18,8 mm). Därför är det önskvärt att utöka balken för att uppnå en större och plattare belysning av provet.- Design mag objektivet, som kan passa in belysning armen (figur 1 H).
Obs: Konstruktion av mag linsen beror på där det kommer att installeras. Figur 1 H visar ett exempel på installation i belysning armen, men det kan installeras i någon fläck efter laserstrålar är kollimerad (se diskussion). Utforma det med datorstödd design och redaktionella programvara. - Placera två akromatisk linser, en konkav (brännvidd = f1), och en konvex (brännvidd = f2) i hemgjorda mag lins hållaren (figur 2A och 2 C), med avståndet som är lika med summan av deras brännvidder, f1 + f2 = (-25) + 50 = 25 mm (figur 2B).
Obs: Med detta val av brännvidder, mag linsen expanderar strålen av f2/ | f1| = 2 veck. Mag linsen ger mångsidighet. Det kan tas bort om du vill återuppta regelbundna belysning utan att utvidga balkar (figur 2D) eller infogas i omvänd riktning att fokusera laserstrålen för att uppnå en starkare excitation intensitet.
- Design mag objektivet, som kan passa in belysning armen (figur 1 H).
- Förbereda en vibration-isolerade optiska tabell. Exempelvis ger en strukturell dämpning tabell över 48 x 96 x 12'' tillräckligt med utrymme för alla komponenter.
2. utsläpp sökväg
Obs: Sökvägen utsläpp består av en flyttbar cylindrisk lins, en barriär Filterhjul, ett utsläpp splitter och en elektrisk kamera (figur 1 g). För att uppnå den bästa punkten spridda funktion (PSF) av enstaka molekyler, DIC prismat tas bort från objektivet.
- Kundanpassa cylindriska linsen (3D-lins) kassett, som kan passa i manuell DIC analyzer infoga slot i mikroskopet kroppen (figur 3 c).
Obs: Denna konstruktion inte äventyrar DIC analysatorn eftersom en analyzer block kan infogas i filterrevolvern. - Placera 3D-lins 10 m av brännvidd i kassetten och infoga det i utsläpp beam sökvägen till skapa astigmatism effekten nödvändig för att extrahera z koordinaten för varje enda molekyl14.
Obs: Valfritt, 3D-lins kassetten kan placeras i eller utanför utsläpp sökvägen (figur 3 c). - Installera en dikroisk stråldelare flera band i filterrevolvern insidan av mikroskopet kroppen.
- Installera utsläpp filter.
Obs: De utsläpp filter väljs beroende på den önskade fluorophores. Beroende på modulen imaging används utsläpp filter placerade på olika platser som beskrivs nedan:- För sekventiell flerfärgade påljusfluorescens imaging eller imaging SR, använda utsläpp filter placeras i den barriär Filterhjul ansluten bredvid Mikroskop kroppen för att minimera vibrationer i mikroskopet kroppen under channel-växel (figur 1 g).
- För samtidig flerfärgade identifiering (t.ex., smFRET experiment), placera ett annat filter i ett utsläpp-splitter (kontrollera steg 4 för detaljer).
Obs: En kommersiell utsläpp splitter har vanligtvis två omkopplingsbar lägen (dvs, ”engagerad” eller ”kringgå” lägen). För att separera utsläpp lampor chromatically för samtidiga flerfärgade imaging (”engagerad” läge), en filter kub håller två dichroic beam splitters och tre utsläpp filter används (”triple kub”, figur 4 c och 4 D). En tom plats i barriär filter hjulet används i kombination med trippel kuben. Däremot, för sekventiell flerfärgade imaging ersätts trippel kuben av en kub som bara har en spegel inuti (”bypass kub”, figur 4A och 4 D).
- Installera elektrisk kameran som den sista delen av sökvägen utsläpp. Använda USB-PCI anslutningen för att uppnå en snabb bildhastighet.
Obs: En elektrisk kamera rekommenderas för känsligaste singel-molekyl upptäckt, men en avancerad sCMOS-kamera kan vara ett alternativ.
3. diffraktion begränsad Imaging med Epi-magnetisering
- Justera excitation lasrar oförutsedda vinkel epi-läget i belysning armen.
- Koppla ur 3D-linsen om engagerad (figur 3 c, högra panelen).
- Infoga bypass kuben i utsläpp splitter (figur 4A och 4E, nedre panelen).
- (Valfritt) Infoga mag linsen för en breddad belysning område (figur 2D, vänstra panelen).
Obs: Med användning av en mag-lins och en 100 X Oljeimmer objektiv, ca 91 x 91 µm2 kan belysas jämnt, vilket eliminerar behovet av att använda en vit ljuskälla och flera filter kuber. - Använd en mikroskopi tänkbar mjukvaran ta Multi-Channel, eller Z-stack time-lapse bilder.
Obs: Det finns flera program för mikroskopi imaging, inte bara från Mikroskop tillverkare, utan också från tredje part-företag eller open source-utvecklare.
4. Multi-Channel singel-molekyl Imaging inklusive smFRET
Obs: Flytta till en ”tom” position i barriär filter hjulet, så att alla utsläpp med någon våglängd kan nå till den andra uppsättningen av filter/dichroic beam splitters i utsläpp splitter.
- Ställ in flerfärgade singel-molekyl detektion av surface-orörlig molekyler15 med Frida magnetisering, inklusive smFRET mätning, justera excitation lasrar oförutsedda vinkel till Frida vinkel. Frikoppla mag linsen och 3D-objektiv.
- Engagera det tre-kanals läget i utsläpp splitter (figur 1 g) genom följande steg:
- Ersätta bypass kuben med en ”kalibrering kub” som tillåter ljuset att gå igenom alla kanaler (figur 4B och 4E).
- Slå på kameran under DIC (dvs, inget utsläpp filter i barriär filter hjulet) och justera bländaren av utsläpp splitter tills tre helt separerade kanaler visas på skärmen.
Obs: Genomföra detta steg med rummet ljus tända, för att visualisera alla kanaler. - Aktivera kontroll vertikala/horisontella justeringsreglagen utsläpp splitter och ungefär justera de tre kanalerna (figur 4E och 4F).
- Stäng av kameran och ersätta kalibrering kuben med en trippel kub (figur 4 c och 4E).
- Placera ett prov med 100-nm flerkanaliga pärlor ovanpå 100 X objektiv och fokus på provet.
- Slå på kameran och 488-nm laser, zooma in på en av de ljusa pärlorna och fint justera de tre kanalerna genom att vrida kontroll justeringsreglagen igen (figur 4E och 4 G).
Obs: 100-nm flerkanaliga pärlor avger olika våglängder av ljus på 488-nm magnetisering, möjliggör tre-kanals justeringen.
- Slå på kameran och lasrar, fokus och hitta en bra position med en rimlig plats densitet. Justera laser effekt och exponering tiden att uppnå en acceptabel signal-brus- och fotoblekning. Använd microscopyen tänkbar mjukvaran ta time-lapse bilder.
5. SR Imaging
Obs: Detta är single-molekyl baseras på upptäckt SR mikroskopi.
- Ställ in SR imaging, infoga 3D-linsen och ta bort mag linsen. Ställa in exponering innan kameran i lämplig laser kanaler (t.ex., 5-60 ms). Bestämma och manuellt ställa in optimal excitation lasrar oförutsedda vinkel ska Frida vinkeln.
- Placera provet i SR imaging buffert16. Tillåta att bufferten jämvikta i minst 10 min innan imaging.
Obs: SR imaging buffert upphör efter ungefär 1 h, så ny SR imaging buffert med detta. - Ta en DIC bild innan SR imaging. För att hitta rätt objektiv höjd för SR, som optimerar effekten astigmatism, Använd DIC imaging för att hitta mitten planet av cellerna. Identifiera planet av höjden där cellerna övergång från ”ljus” till ”mörka” bilder och verkar bli transparent (figur 5A, 5Boch 5 C). När önskad fokalplanet bestäms, engagera z-drift korrigering systemet (figur 1A).
- Genomföra SR imaging. Ändra 405-nm laser befogenhet att upprätthålla en rimlig täthet av 'blinkar-på' ställen.
Obs: Det är möjligt att ändra 405-nm laser manuellt, det är mer bekvämt att köra en programmerad data förvärvet kod för att bibehålla tätheten av ”blinkar-på” ställen. Här är ett exempel på hur det sker automatiskt. Källkoden är tillgänglig på begäran (figur 6).- Starta imaging förvärvet med 0 W/cm2 violett laser power.
- Räkna antalet blinkar-på ställen under en viss tidsperiod.
- Modulera violett laser kraften så att antalet blinkar-på ställen hålls tröskelvärdet en användardefinierad ”räknar” i synfältet. Öka violett laser kraften när antalet blinkar-på ställen sjunker under tröskelvärdet räknande.
- Säga upp förvärvet när antalet blinkar-på ställen sjunker under tröskelvärdet räknar med hjälp av maximal violett laser kraften.
Obs: Maximalt kan vara satt olika beroende på provet ljusstyrka, men inte högre än 130 W/cm2. Beroende på det faktiska målet av SR bildtagning, kan denna automatiska förvärvet kod avslutas manuellt när som helst önskat.
- Kontrollera blinkande beteende och vävda av fläckarna snart efter början förvärv.
Obs: Om blinkande beteendet inte är idealisk, ändra magnetiseringen lasrar oförutsedda vinkel eller ersätta imaging bufferten. Förvänta dig en sampling av ”vertikala”, ”horisontella” och ”diamant” former av polyesterstapelfibrer, som företräder fluorophores underifrån, ovan, och inom fokalplanet, respektive (figur 5 d). Om de flesta ställen visar antingen vertikal eller horisontell vävda, sedan fokalplanet är avstängd från mitten av cellerna, så avsluta experimentet och justera fokalplanet igen. En närvaro av luftbubbla i nedsänkning oljan eller andra lokala faktorer kan påverka den vävda kvalitet, så det kan vara nödvändigt att ersätta oljan eller ändra till en annan tänkbar del av provet. - Dataanalys, antingen använda öppen källkod (i NIH ImageJ plugins) eller kommersiellt tillgängliga koder att upptäcka centroids av varje plats i varje tänkbar ram och extrahera z-värden för varje plats från x - och y-bredder14.
Obs: I denna rapport en källkod som ursprungligen utvecklades i en av de tidigaste singel-molekyl baseras på upptäckt SR8 ändrades för 3D-detektering16 och användes. - När det gäller två-färg imaging, image fluorophore med längre excitation våglängden, följt av en med kortare excitation våglängden. Köra automatiserade förvärvet koden på samma sätt som den som beskrivs i steg 5,4, men med en annan tänkbar laser.
Obs: kromatisk aberration korrigeras mellan bilderna med olika fluorophores (e.g., rött färgämne och gul-grönt färgämne). Här är stegen.- Immobilisera flera 100-nm flerkanaliga pärlor på den täckglas, undvika bildar kluster.
- Ta bilder av dem i olika excitation kanaler.
- Utdrag sin (X, Y, Z) samordnar av programvara (steg 5,6).
- Rita ΔXjag = X1i - X2i och ΔYi = Y1i - Y2i (jag är för olika pärlor och 1 och 2 är olika färgkanaler) separat och passar dem med rätt funktioner. Spara funktionerna.
Obs: Linjära funktioner är tillräckliga i de flesta fall. När dessa funktioner bestäms, har inte denna mätning skall upprepas varje gång Imaging. - I den faktiska tvåfärgad SR imaging av ett urval av intresse, att gälla rätt (X, Y) kromatisk aberration funktioner. För z-directional kromatisk aberration, genomföra det genom att skaffa ΔZ = Z1 - Z2 för flerkanals pärlor eller kända flerkanaliga referensprov seedade tillsammans med provet av intresse.
Obs: till skillnad från (X, Y) kromatisk aberration, z-directional kromatisk aberration är inte brunn-reproduceras i varje experiment, främst på grund av ofullständig z-directional fokus underhåll på kanalväxling. Således, det rekommenderas att utföra korrigeringen varje gång. ΔZ = Z1 - Z2 är mestadels oberoende av (X, Y), så det är bara några pärlor eller referensprover skulle räcka per varje prov intresseområde. Rita de konstruerade sista två SR färgbilder i en 3D-visualisering programvara och kontrollera ΔZ manuellt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta Mikroskop tillåter flexibla och reproducerbara växling mellan olika avbildningsmetoder. Här visar vi prov bilder som samlats in med varje tänkbar modul.
Figur 5 d visar polyesterstapelfibrer av blinkar-på molekylen under SR förvärv. Tusentals sådana bilder rekonstrueras för att generera den slutliga SR bilden (figur 5E). Figur 5E visar samma bakteriella regulatoriska RNASEN se påljusfluorescens bilden i figur 7A. Figur 7 visar representativa påljusfluorescens bilder av en liten regulatoriska RNA i Escherichia coli celler och en mRNA i U2OS däggdjursceller. Båda RNAs är märkta med fluorophore-taggade DNA oligo genom i situ -hybridisering-17. Figur 8 visar representativa smFRET mätning av vikta RNA-molekyler som märkt med givare färgämne (grön dye) och acceptor färgämne (röd färg). Komplexen är orörlig på objektglas och upphetsad av Frida belysning. Fluorescens intensitet banor kan extraheras från enskilda enstaka molekyler, generera bandet effektivitet som en funktion av tiden.
Figur 1: utformningen av mikroskopet set-up. (A) denna panel visar ett diagram över upplägget. M = spegel, DBS = dikroisk stråldelare, LCF = laser sanering filter, jag = iris, L = objektiv, AP = adapterplatta, ZTM = z-axeln translationell montera, av = optisk fiber, OFC = optisk fiber koppling, CL = cylindrisk lins, TL = tube objektiv, EF = utsläpp filter, Obj = mål lins och SM = stegmotorn. Z-drift korrigering systemet flyttar stegmotorn revolvern av objektivet i motsatt riktning av z-drivan, som beräknas genom infraröd (IR) signalen genereras av dess egna LED och upptäcks av en egen detektor. (B) denna panel visar laser excitation församlingen. Fyra lasrar kombineras genom speglar och dichroic beam splitters och dirigeras sedan till en optisk fiber genom en fokuserande lins och en adapterplatta som sitter på en translationell mount (längst ned på bilden). (C), denna panel visar laser moduleringen. Två bajonett Neill-Concelman (BNC) kablar är anslutna till var och en av laser (huvudet eller handkontrollen, beroende på tillverkaren) för TTL och analog modulation (längst till vänster panel). BNC kablar kombineras till en enda kabel (mellersta panelen) som är ansluten till ett förvärv datakort i en arbetsstation (längst till höger panel) för datorstyrning. (D), denna panel visar spegel och dikroisk stråldelare fästen. (E) bygga en fiber koppling i en bur-systemet. En fiber adapterplatta (AP) är monterad i en z-översättning montera (ZTM) så att dess avstånd till akromatisk dubbel linsen (L1, sidovy visas) kan anpassas. AP och ZTM har matchande trådar, samma som L1 och bur plattan. (F), A par Iris (omsluter) installeras under justering förfarandet för flera lasrar. De används för att säkerställa att 647-nm laser (till vänster) och 561-nm laser (höger panel) gå samma väg. (G), A partiell del av utsläpp sökvägen visas. Utanför Mikroskop kroppen installeras utsläpp filter hjulet, utsläpp splitter och elektrisk kameran i ordning. (H), denna panel visar belysning arm montering. Mag linsen sätts in belysning armen. Magnetiseringen laserstrålar skickas till belysning armen genom optisk fiber och den optiska fibern koppling (på höger sida av bilden). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: mag linsen. (A) denna panel visar ortografisk projektioner av innehavaren av bostäder linser för förstoringsglas laserstrålar (enhet: mm). Denna design är avsedd till att passa in belysning armen. (B) i denna panel visas en inre ritning av hålet i hållaren där två linser få i. L1 är en konkav lins L2 är en konvex lins och avståndet mellan dem är summan av deras brännvidder. (C) Detta är ett foto av mag linsen. (D) mag linsen kan infogas i belysning armen att expandera eller fokusera laserstrålar (vänster) eller kan tas bort för att hålla laserstrålar oförändrad (till höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: 3D-linsen. (A) denna panel visar ortografisk projektioner av innehavaren av att ha en tom cirkulärt hål för läget och ett rektangulärt hål för att hålla den cylindriska linsen (enhet: mm). Denna design är avsedd att passa till DIC analyzer reglaget i en Mikroskop kropp. (B) Detta är ett foto av 3D-linsen. (C) den cylindriska linsen kan vara engagerade i de utsläpp strålgång att orsaka vävda med astigmatism (vänster) eller kan vara inaktiverad för Bypassläge, att hålla vävda intakt (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Multi-Channel justering av utsläpp splitter. System av optik och ljusbanan visas i utsläpp splitter med (A), en bypass kub, (B) en kalibrering kuben, och (C), en trippel kub. M = spegel. Bypass kuben har en spegel inuti (M5) och är tänkt för att användas med ett utsläpp filter (EF) i barriär filter hjulet. Kalibrering kuben har beam splitters (BS) som tillåter ljus att gå igenom alla kanaler. Trippel kuben har två dichroic beam splitters (DBS), samt tre utsläpp filter. (D) dessa är bilder av tre kuber. (E) den inre av utsläpp splitter visas utan en kub (övre panelen) och med en kub (nedre panelen) glider i. M3 är bakom M4 och fångas inte i fotot. Rattar för speglarna är ovanpå utsläpp splitter (övre panel). (F) panelen visar kanal justering med hjälp av kalibrering kuben under DIC. (G), denna panel visar en fin justering av den gröna (övre panelen) och röd (mellersta panelen) kanaler med 100-nm flerkanaliga pärlor och en trippel kub. En sammanslagen bild av de två kanalerna visas också (nedre panelen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa SR bild förvärvandet. Dessa paneler visar en representativ DIC bild (A) nedan, (B) på, eller (C) ovan centrala planet av cellerna. (D) i denna panel visas ett exempel av polyesterstapelfibrer av den blinkar-på-fluorophores. Den orange cirkeln omger en ”vertikal” polyesterstapelfibrer. Den gröna cirkeln omger en ”horisontell” polyesterstapelfibrer. Den blå cirkeln omger en diamant-formade polyesterstapelfibrer, som representerar fluorophores på ett fokuserat plan. (E), denna panel visar en representant rekonstruerade SR bild. En liten regulatoriska RNA är märkt med fluorescens i situ hybridisering med rött färgämne. De vita kanter markerar kanterna på cellerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: en programmerad data förvärvet kod för SR imaging. I denna programmerbara förvärv modul, olika utförande kommandon och Mikroskop kontrollfunktioner listas i den vänstra panelen och kan väljas för att skapa programmerade förvärvet kod. Kommandona körs sekventiellt från topp till botten. Denna skärmdump visar ett exempel där ett fördefinierat antal upprepade imaging förvärv genomförs tills förvärvet ställs och antalet ställen i tre sekventiella bildrutor beräknas. Om det genomsnittliga antalet dessa ställen ligger över tröskelvärdet (definierad som 50% av antalet celler i bakteriell imaging), fortsätter bild förvärvet i samma slingan. Om under tröskeln, fortsätter sedan bild förvärv i den nästa slinga där starkare violett laser power används (skär längst ned på skärmbilden). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: representant påljusfluorescens bilder. (A) denna panel visar en liten regulatoriska RNA i E. coli celler. (B) denna panel visar en mRNA i U2OS däggdjursceller. RNAs är märkta med rött färgämne och blått färgämne genom fluorescens i situ hybridisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: exempel på smFRET imaging. (A) prover var glada med 561-nm laser. (B) utsläpp från de gröna och röda färgämnena samlas in samtidigt och visas som gröna (höger) och röd (vänster) ställen, respektive. (C), denna panel visar representativa fluorescens intensitet vs. tid banor av grön dye (grön) och rött färgämne (röd) från en molekyl. (D) i denna panel visas de FRET effektivitet vs. tid banan (heldragen blå linje) beräknat som jagAcceptor/ (jaggivare + IAcceptor) från en molekyl av provet. FRET tracen är försedd med en dold Markovmodell (streckad röd linje). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna hybrid Mikroskop system eliminerar behovet av att köpa flera Mikroskop. Den totala kostnaden för alla delar, inkluderande den optiska tabell, tabell installation arbete, programvara och arbetsstation, är ca $230.000. Custom-maskinbearbetade delar, inklusive mag linsen och 3D-lins, kosta runt $700 (kostnaden beror på de faktiska avgifterna på olika institut). Typiska kommersiellt tillgängliga integrerade system för singel-molekyl baseras på upptäckt SR mikroskopi kosta mer än $300.000 ~ 400.000 och är inte lätt tillgänglig för smFRET mätning eller epi-imaging för en rimlig synfält, utan vitt ljus källa. Den strategi som presenteras här kan således uppnå imaging funktioner motsvarar flera Mikroskop till betydligt lägre kostnad.
Detta modulerade Mikroskop system kan baseras på mikroskopet organ från olika tillverkare. 3D-linsen kan potentiellt installeras i valfri position i utsläpp sökvägen, inklusive inuti utsläpp splitter, inom Mikroskop kroppen, eller i utrymmet mellan Filterhjul och objektiva revolvern. Men avgör den fysiska platsen för 3D-objektivet dess brännvidd för att uppnå bästa astigmatism effekt för 3D-SR avbildning. Vi rekommenderar att du börjar med en 10-m brännvidd. Mag linsen är i huvudsak en balk expander installerat i sökvägen excitation. Om magnetiseringen lasrar är luft-tillsammans (dvs., utan optisk fiber), det är trivialt att installera sådan en expander i någon fläck efter laserstrålar är parallell. Om magnetiseringen lasrar är fiber-tillsammans, sedan leta efter extra slots att installera två linser (en konkav och den andra en konvex). Exempelvis har många kommersiella belysning vapen slots för neutral densitet filter. Hitta två objektiv med summan av deras brännvidder lika med avståndet mellan de två kortplatserna. De kan sedan infogas för att fungera som en mag-lins. Alternativt kan ett fäste för skjutreglaget fältet membran vara en annan plats, om tillgängligt. Bygga mag linsen i en flyttbara kassett har den extra fördelen att göra det möjligt för en att fokusera excitation lasrar för att uppnå högre makt, som kan vara nödvändiga för SR imaging, helt enkelt genom att vända orienteringen för mag linsen.
I denna rapport visade vi flexibelt växla mellan tre olika avbildningstekniker med modulerade Mikroskop. Detta upplägg kan användas för bredare och mer avancerade applikationer. Till exempel SR konfigurationen kan användas för single-particle tracking i levande celler, på foto-omkopplingsbar eller photoactivatable fluorescerande protein-taggade biomolekyler av intresse18,19. SmFRET konfiguration kan användas för att studera molekylära interaktioner i i vivo system20. Utsläpp splitter-baserade Multi-Channel detektion kan kombineras med SR konfigurationen att utföra två färger SR imaging eller singel-particle tracking samtidigt21.
Detta upplägg kan utökas ytterligare för att möjliggöra mer modulerade komponenter. Ytterligare ett lager av filtret torn och belysning fack kan exempelvis läggas, så att ytterligare excitering/utsläpp sökvägar kan skapas för ytterligare kanaler, såsom en med en infraröd (IR) laser för imaging prover märkta med IR färgämnen. Förutom att ge extra bildbehandling kanalen, kan IR lasrar användas att rätta scenen drivan i SR imaging antingen under imaging förvärv eller under den post-analysen. För drift korrigering under imaging förvärvet, om z-drift korrigering systemet inte är tillgänglig från Mikroskop tillverkaren, ett alternativt system med IR laser kan vara antingen hembyggda14 eller förvärvas från tredje part-företag. För efter förvärvet drift korrigering, kan en IR-laser användas för att spåra relaterat markörer. 22
Singel-molekyl baseras på upptäckt SR mikroskopi kräver två uppsättningar av programvara, en för datainsamling och en för dataanalys. För datainsamling, ens en enkel hemmabyggd programvara som tar bilder genom kameran samtidigt kontrollera lasrar ON/OFF beteenden kan arbeta för att generera SR bilder, medan det är möjligt att manuellt modulera 405-nm laser makt, t.ex. genom att rotera en gradient neutral densitet filter installerat framför lasern. Detta sätt att genomföra experimentet är dock beroende av de experimenter's subjektiv bedömning av tätheten av blinkar-på ställen. Således, hitåt är inte objektiva och kanske inte lämpliga att använda för kvantifiering av SR imaging data. Data förvärvet koden används här innehåller spot detection / en räknar algoritm medan dataförvärvet är pågående, aktivera automatisk modulering av 405-nm laser kraften baserat på tätheten av blinkar-på ställen (figur 6). Nuförtiden, tillhandahåller några Mikroskop tillverkare programmerbara imaging moduler, så man kan utnyttja dessa eller leta efter plugins från öppna källor som mikro-Manager. För dataanalys är det möjligt att använda kommersiellt tillgängliga analys moduler från Mikroskop tillverkare eller leta efter plugins från öppna källor som ImageJ.
Sammanfattningsvis ger det upplägget presenteras här hög mångsidighet och lätt växla mellan olika imaging konfigurationer till lägre kostnad och utrymme. Detta upplägg är relativt lätt att anta av någon research laboratory i biologiska vetenskaper med behöver rutin och olika imaging experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
J.F. erkänner stöd från programmet Searle forskare och NIH regissörens nya innovatör Award. Författarna erkänner användbara förslag från Paul Selvin's lab (University of Illinois, Urbana-Champaign) för positionering 3D-linsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
References
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
