Summary
Qui vi presentiamo una guida pratica di costruzione di un sistema di microscopia integrato, che si fonde imaging epi-fluorescente convenzionale, singola molecola basata sul rilevamento di Super-risoluzione imaging e rilevamento di singola molecola multi-colore, tra cui trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza di singola molecola di imaging, in un set-up in modo efficiente.
Abstract
Microscopia di fluorescenza è un potente strumento per rilevare molecole biologiche in situ e monitorare le dinamiche e le interazioni in tempo reale. Oltre alla microscopia convenzionale epi-fluorescenza, varie tecniche di formazione immagine sono stati sviluppati per raggiungere specifici obiettivi sperimentali. Alcune delle tecniche ampiamente utilizzate includono il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza di singola molecola (smFRET), che può segnalare cambiamenti conformazionali e interazioni molecolari con angstrom risoluzione e singola molecola basata sul rilevamento Super-risoluzione (SR) di imaging, che può migliorare la risoluzione spaziale di circa dieci a twentyfold rispetto alla microscopia a diffrazione limitata. Qui presentiamo un sistema integrato di cliente-progettato, che fonde più metodi di imaging in un microscopio, compreso formazione immagine convenzionale di epi-fluorescente, singola molecola basata su rilevazione SR imaging e rilevamento di singola molecola multi-colore, compreso formazione immagine smFRET. Diversi metodi di imaging possono essere ottenute facilmente e riproducibile elementi ottici di commutazione. Questo set-up è facile da adottare presso un laboratorio di ricerca in scienze biologiche con una necessità di routine e diversi esperimenti di imaging a un costo ridotto e spazio rispetto a costruire microscopi separati per scopi individuali.
Introduction
Microscopi a fluorescenza sono strumenti importanti per la ricerca moderna scienza biologica e formazione immagine di fluorescenza è effettuata ordinariamente in molti laboratori di biologia. Applicando a biomolecole di interesse con fluorofori, possiamo direttamente visualizzarli sotto il microscopio e registrare i cambiamenti di tempo-dipendente nella localizzazione, conformazione, interazione e stato di assemblaggio in vivo o in vitro. Microscopi a fluorescenza convenzionali hanno una risoluzione spaziale di diffrazione limitata, che è ~ 200-300 nm in direzione laterale e ~ 500-700 nm in direzione assiale1,2e sono, pertanto, limitata a imaging presso il 100s di scala di nanometri micron. Al fine di rivelare i dettagli più fini nell'organizzazione o assemblaggio molecolare, sono stati sviluppati vari microscopie SR che possono rompere il limite di diffrazione. Strategie utilizzate per raggiungere SR includono effetti ottici non-lineari, quali emissione stimolata svuotamento (STED) microscopia3,4 e illuminazione strutturata microscopia (SIM)5,6, 7, stocastico rilevazione di singole molecole, come ricostruzione ottico stocastico microscopia (tempesta)8 e fotoattivazione localizzazione microscopia (PALM)9e una combinazione di entrambi, ad esempio MINFLUX10. Tra questi microscopie SR, microscopi SR basati sul rilevamento di singola molecola possono essere relativamente facilmente modificate da un set-up di microscopio di singola molecola. Con attivazione ripetitiva e la formazione immagine di proteine fluorescenti fuse (FPs) o coloranti foto-commutabile uploaded biomolecole di interesse, la risoluzione spaziale può raggiungere 10-20 nm11. Per ottenere informazioni sulle interazioni molecolari e conformazionale dinamica in tempo reale, angstrom-nanometri risoluzione è necessaria. smFRET12,13 è un approccio per ottenere questa risoluzione. Generalmente, a seconda le questioni biologiche di interesse, sono necessari metodi di formazione immagine con risoluzioni spaziali diverse.
In genere, per ogni tipo di imaging, configurazione ottica eccitazione e/o emissione specifica è necessaria. Per esempio, uno dei metodi più comunemente utilizzati illuminazione per il rilevamento di singola molecola è attraverso la riflessione interna totale (TIR), in cui un angolo specifico di eccitazione deve essere ottenuta attraverso un prisma o attraverso la lente dell'obiettivo. Per il rilevamento di smFRET, le emissioni da donatore e accettore coloranti devono essere spazialmente separate e diretto a diverse parti del elettrone-moltiplicando, charge coupled device (EMCCD), che può essere raggiunto con una serie di specchi e dicroico beam splitter inseriti nel percorso di emissione. Per tridimensionale (3D) SR imaging, un componente ottico, come una lente cilindrica14, è necessario per causare un effetto di astigmatismo nel percorso di emissione. Pertanto, autocostruito o commercialmente disponibile integrati microscopi sono, solitamente, funzionalmente specializzati per ogni tipo di metodo di imaging e non sono flessibili per passare tra diversi metodi di formazione immagine sull'assetto stesso. Qui presentiamo un sistema ibrido conveniente, che fornisce opzioni regolabili e riproducibili tra tre diversi metodi di imaging: imaging convenzionale di epi-fluorescente con diffrazione limitata risoluzione, singola molecola basata su rilevazione SR Imaging e rilevazione di singola molecola multi-colore, compresi smFRET imaging (Figura 1A). In particolare, il set-up presentato qui contiene accoppiati in fibra laser input per l'eccitazione di multi-colore e programmato un braccio commerciale illuminazione sul sentiero di eccitazione, che permette di controllo dell'angolo di eccitazione, per passare da epi-modalità e TIR. Nel percorso di emissione, una cassetta di lente cilindrica autocostruito rimovibile viene inserita all'interno del corpo del microscopio per l'imaging 3D SR e un divisore di fascio commerciale viene inserito prima di una macchina fotografica EMCCD che possa essere abilitata in modo selettivo per rilevare più canali di emissione contemporaneamente.
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Protocol
1. microscopio Design e assemblaggio
-
Percorso di eccitazione
Nota: Il percorso di eccitazione include laser, componenti (DIC) contrasto differenziale di interferenza, il corpo del microscopio e il suo braccio di illuminazione.- Preparare una tabella ottica vibrazione-isolato. Ad esempio, una tabella di smorzamento strutturale di 48 x 96 x 12 ' dà spazio sufficiente per tutti i componenti.
Nota: Costruire il set-up in una stanza con controllo della temperatura (ad es., 21,4 ± 0,55 ° C). Stabilità della temperatura è fondamentale per mantenere l'allineamento ottico. - Installare un corpo del microscopio che è equipaggiato con un braccio di illuminazione per il collegamento in fibra ottica, a 100 X lente obiettiva TIRF di immersione in olio e componenti DIC.
- Inserire quattro teste del laser (647 nm, 561 nm, 488 nm e 405 nm, circondata in Figura 1B) e dissipatori di calore di loro sul tavolo ottico, e assicurarsi che i raggi laser emessi hanno la stessa altezza e sono più corto possibile assicurare la buona stabilità (ad es. 3 ').
Nota: Se una testa laser si trova ad un'altezza inferiore rispetto alle altre stampanti laser, è possibile mettere una piastra di alluminio con spessore adeguato sotto di esso. Sempre garantire il massimo contatto tra i dissipatori di calore e la tabella ottica per la migliore dissipazione di calore (Figura 1B). I laser devono essere abbastanza potente per l'imaging di SR. Vedere la tabella dei materiali. Si consiglia di avere laser pulizia filtri davanti a diodi laser. - Installare una scheda di acquisizione dati attraverso un'interfaccia di peripheral component interconnect (PCI) in una workstation e collegare i laser con questa scheda. Controllare i comportamenti di ON/OFF dei laser di logica del transistore-transistore (TTL) uscita e loro regolazione della potenza di uscita analogica di questa scheda (Figura 1). Installare un'adeguato microscopia imaging software (commerciale o autocostruito) per controllare la scheda di acquisizione dati, così come il corpo del microscopio.
- Montare la specchi dicroici beam splitter (590, 525 e 470 filtri passa-lungo) ai loro rispettivi supporti. Utilizzare supporti specchio molto stabile per gli specchi. Utilizzare separatori circolari con anelli di sicurezza per evitare qualsiasi flessione dei dicroici beam splitter (Figura 1).
- Posizionare gli specchi e dicroico beam splitter sul tavolo ottico per combinare i raggi laser (Figura 1B). Per ottenere l'allineamento più stabile, rendere l'intera disposizione più compatto possibile e utilizzare 1 '-spessore ottico post. Disporre i laser in modo che i laser di lunghezza d'onda più corti sono più vicini all'accoppiamento di fibra ottica (Figura 1B) poiché onda corta luci dissipano più nell'aria.
- Combinare i raggi laser in una fibra ottica monomodale. A tale scopo, è necessario costruire un accoppiatore di fibra in un sistema di gabbia attraverso le seguenti fasi:
- Montare una piastra adattatore fibra in un Monte di traduzione dell'asse z (Figura 1E, pannello all'estrema sinistra).
- Monta un obiettivo di doppietto acromatico (lunghezza focale = 7,5 mm) in un piatto di gabbia (Figura 1E, secondo pannello da sinistra).
- Collegare le due parti sopra di aste di prolunga per formare una gabbia. Montare la gabbia sul tavolo ottico con staffe di montaggio sui posti 1 ' di spessore ottici (Figura 1E, pannello centrale).
- Allineare il laser 647-nm prima con una fibra ottica monomodale (conclusione FC/APC l'accoppiatore).
Nota: Un allineamento grossolano utilizzando una fibra ottica multi-mode prima di utilizzare la fibra ottica monomodale può aiutare il processo di allineamento. Regolare gli angoli di specchi e dicroico beam splitter (Figura 1, di manopole di regolazione), così come la distanza tra la lente doppietto acromatico e la piastra dell'adattatore della fibra (Figura 1E, regolando Monte traduzione di z-asse) per ottenere uscita di potenza massima laser attraverso la fibra. - Una volta fatto l'allineamento del primo laser, temporaneamente installare una coppia di Iris e allineare il resto dei laser uno (Figura 1F). Verificare l'efficienza di allineamento con un misuratore di potenza.
- Lasciare un iride nella parte anteriore della piastra di adattamento per ridurre i riflessi dei laser.
Nota: Strong indietro riflessioni possono ridurre la durata delle sorgenti laser. Facoltativamente, un isolatore ottico può essere installato fronte ogni testa laser per rimuovere completamente i riflessi.
- Collegare l'altra estremità della fibra ottica per il braccio di illuminazione del microscopio (Figura 1 H).
- Progettare e installare il "ingrandimento lente (mag)" attraverso le seguenti fasi:
Nota: Il laser può essere utilizzato per l'imaging di epi-fluorescenza del campione, ma la dimensione del fascio stretto di ogni laser limita l'area illuminata del campione di un'area più volte più piccola rispetto alle dimensioni effettive del sensore della fotocamera corrispondente, soprattutto per i più recenti macchine fotografiche (con 18,8 mm di lunghezza diagonale rispetto alla convenzionale lunghezza 11,6-mm). Pertanto, è auspicabile per espandere il raggio per ottenere un'illuminazione più grande e più piatta del campione.- Progettare la lente mag, che può adattarsi al braccio di illuminazione (Figura 1 H).
Nota: Il design della lente mag dipende dove che verrà installato. Figura 1 H Mostra un esempio dell'installazione del braccio di illuminazione, ma può essere installato in qualsiasi posto dopo i fasci laser sono collimato (Vedi discussione). Progettare con un computer-aided design e software di disegno. - Posizionare due lenti acromatiche, una concava (lunghezza focale = f1) e uno convesso (lunghezza focale = f2) nel porta-lente fatta in casa mag (Figura 2A e 2C), con la distanza uguale alla somma delle loro lunghezze focali, f1 + f2 = (-25) + 50 = 25 mm (Figura 2B).
Nota: Con questa scelta di lunghezze focali, la lente di mag si espande il fascio da f2/ | f1| = 2 pieghe. L'obiettivo di mag fornisce la versatilità. Può essere rimosso per riprendere la normale illuminazione senza espandere le travi (Figura 2D) o inserito nella direzione inversa per focalizzare il fascio laser per ottenere una maggiore intensità di eccitazione.
- Progettare la lente mag, che può adattarsi al braccio di illuminazione (Figura 1 H).
- Preparare una tabella ottica vibrazione-isolato. Ad esempio, una tabella di smorzamento strutturale di 48 x 96 x 12 ' dà spazio sufficiente per tutti i componenti.
2. percorso di emissione
Nota: Il percorso di emissione è composto da una lente cilindrica rimovibile, una ruota portafiltri barriera, uno splitter di emissione e una fotocamera EMCCD (Figura 1). Per raggiungere il miglior punto di diffondere la funzione (PSF) di singole molecole, il prisma DIC è messo dalla lente dell'obiettivo.
- -Progettazione personalizzata la cassetta cilindrica lente (3D), che può adattarsi l'analizzatore DIC manuale inserire slot nel corpo del microscopio (Figura 3).
Nota: Questo disegno non compromette l'analizzatore DIC poiché un blocco di analizzatore può essere inserito nella torretta filtro. - Posizionare la lente 3D di 10 m di lunghezza focale nella cassetta e inserire il percorso del raggio di emissione per creare l'effetto di astigmatismo necessari per l'estrazione la coordinata z di ogni singola molecola14.
Nota: Facoltativamente, la cassetta di lente 3D posizionabile in o fuori del percorso di emissione (Figura 3). - Installare un divisore di fascio dicroica multi-banda della torretta di filtro all'interno del corpo del microscopio.
- Emissione dei filtri.
Nota: I filtri di emissione vengono scelti a seconda i fluorophores preferito. A seconda del modulo imaging, filtri di emissione collocati in sedi diverse vengono utilizzati come descritto di seguito:- Per sequenziale multi-colore epi-fluorescenza o SR imaging, è possibile utilizzare filtri di emissione inseriti nella ruota filtro barriera collegata accanto al corpo del microscopio per ridurre al minimo le vibrazioni nel corpo del microscopio durante switch channel (Figura 1).
- Per la rilevazione simultanea multi-colore (per esempio, esperimenti di smFRET), inserire un altro filtro impostato in uno splitter di emissione (controllo passaggio 4 per i dettagli).
Nota: Solitamente, uno splitter commerciale emissione ha due modalità commutabile ("cioè, impegnato" o modalità di "bypassare"). Per separare le luci di emissione cromaticamente per simultanea multi-color imaging (modalità "impegnato"), viene utilizzato un cubo di filtro che tiene due divisori di fascio dicroici e tre filtri di emissione ("Tripla cubo," Figura 4 e 4 D). Uno slot vuoto nella ruota filtro barriera è usato in combinazione con il cubo triplo. D'altra parte, sequenziale multi-color imaging, per il cubo triplo è sostituito da un cubo che ha solo uno specchio all'interno ("bypass cubo," Figura 4A e 4D).
- Installare la telecamera EMCCD come l'ultima parte del percorso delle emissioni. Utilizzare la connessione USB-PCI per ottenere un veloce frame rate.
Nota: Una telecamera EMCCD è consigliata per la rilevazione di singola molecola più sensibile, ma una fotocamera avanzata sCMOS può essere un'alternativa.
3. diffrazione limitata di Imaging con Epi-eccitazione
- Regolare l'angolo incidentali dei laser di eccitazione epi-modalità al braccio di illuminazione.
- Disinnestare la lente 3D se impegnati (Figura 3, pannello di destra).
- Inserire il cubo di bypass nello splitter di emissione (Figura 4A e 4E, pannello inferiore).
- (Opzionale) Inserire l'obiettivo di mag per una zona di illuminazione ampliato (Figura 2D, pannello di sinistra).
Nota: Con l'uso di una lente di mag e un 100 X obiettivo di immersione in olio, circa 91 x 91 µm2 può essere illuminato in modo uniforme, eliminando la necessità di utilizzare una sorgente di luce bianca e più cubi di filtro. - Utilizzare una microscopia software di prendere multi-canale, di imaging e/o Z-stack e/o immagini time-lapse.
Nota: Ci sono più programmi disponibili per formazione immagine di microscopia, non solo da microscopio produttori, ma anche da società terze o sviluppatori open source.
4. multi-canale singola molecola Imaging compreso smFRET
Nota: Spostare in una posizione "vuota" nella ruota filtro barriera, affinché tutte le emissioni con qualsiasi lunghezza d'onda possono raggiungere per il secondo set di filtri/dicroico beam splitter nella barra di divisione di emissione.
- Per impostare il rilevamento di singola molecola multi-colore di molecole di superficie-immobilizzata15 con eccitazione TIRF, compreso la misura di smFRET, regolare il angolo accidentali dei laser di eccitazione per l'angolo TIRF. Disinnestare la lente mag e la lente 3D.
- Attivazione della modalità di tre canali nello splitter di emissione (Figura 1) attraverso le seguenti fasi:
- Sostituire il cubo di bypass con un "cubo di calibrazione" che permette alla luce di passare attraverso tutti i canali (Figura 4B e 4E).
- Accendere la fotocamera sotto DIC (cioè, nessun filtro di emissione nella ruota filtro barriera) e regolare l'apertura della barra di divisione di emissione fino a tre canali completamente separati appaiono sullo schermo.
Nota: Eseguire questo passaggio con la luce di camera illuminata, per visualizzare tutti i canali. - Ruotare le manopole di controllo regolazione verticale/orizzontale sulla barra di divisione di emissione e allineare approssimativamente i tre canali (Figura 4E e 4F).
- Spegnere la fotocamera e sostituire il cubo di calibrazione con un cubo triplo (Figura 4 e 4E).
- Posizionare un campione con perline multicanale di 100 nm in cima il 100x obiettivo e messa a fuoco sul campione.
- Accendere la fotocamera e il laser di 488 nm, zoomare su una delle perle luminose e finemente allineare i tre canali ruotando nuovamente la regolazione controllo manopole (Figura 4E e 4G).
Nota: 100 nm multicanale perline emettono lunghezze d'onda della luce di eccitazione 488 nm, che permette l'allineamento di tre canali.
- Accendere la fotocamera e laser, messa a fuoco e trovare una buona posizione con una densità del punto ragionevole. Regolare il tempo di esposizione e potenza laser per raggiungere livelli di segnale-rumore e photobleaching. Utilizzare il software di imaging microscopia per prendere immagini time-lapse.
5. SR Imaging
Nota: Questa è la microscopia SR basati sul rilevamento di singola molecola.
- Per impostare la formazione immagine SR, inserire la lente 3D e rimuovere la lente di mag. Impostare il tempo di esposizione della fotocamera nei canali laser appropriato (ad esempio, 5-60 ms). Determinare e impostare manualmente il angolo accidentali dei laser di eccitazione ottimale per essere l'angolo TIRF.
- Il campione viene posto in SR buffer16di imaging. Permettere al tampone di equilibrare per almeno 10 minuti prima di formazione immagine.
Nota: Buffer di imaging SR scade dopo circa 1 h, quindi assicuratevi di nuovo SR imaging buffer di conseguenza. - Prendete un'immagine DIC prima formazione immagine SR. Al fine di trovare la corretta altezza obiettiva per SR, che ottimizza l'effetto di astigmatismo, utilizzare DIC imaging per trovare il piano intermedio delle cellule. Identificare il piano per l'altezza a cui le cellule di transizione da "light" per immagini "scuri" e sembrano diventare trasparente (Figura 5A, 5Be 5C). Una volta determinato il piano focale desiderato, coinvolgere il sistema di correzione z-drift (Figura 1A).
- Condurre la formazione immagine SR. Modificare la potenza laser 405 nm per mantenere una ragionevole densità di 'lampeggiante-on' macchie.
Nota: Mentre è possibile modificare manualmente il laser di 405 nm, è più conveniente eseguire un codice di acquisizione dati programmati per mantenere la densità dei punti "lampeggiante-su". Ecco un esempio di come è condotta automaticamente. Il codice sorgente è disponibile su richiesta (Figura 6).- Iniziare l'acquisizione di immagine con 0 W/cm2 laser viola potenza.
- Contare il numero di lampeggiante su punti in un determinato periodo.
- Consente di modulare la potenza laser viola in modo che il numero di spot il lampeggiante è mantenuto soglia un user-defined"conteggio" nel campo visivo. Aumentare la potenza del laser viola quando il numero di lampeggiante su spot scende sotto la soglia di conteggio.
- Terminare l'acquisizione quando il numero di lampeggiante su spot scende sotto la soglia di conteggio utilizzando la potenza massima laser viola.
Nota: Il massimo può essere impostata in modo diverso a seconda della luminosità di campione, ma non superiore a 130 W/cm2. A seconda l'obiettivo reale dell'imaging SR, questo codice di acquisizione automatica può essere interrotta manualmente in qualsiasi punto desiderato.
- Controllare il comportamento lampeggia e PSF delle macchie presto dopo l'inizio dell'acquisizione.
Nota: Se il comportamento lampeggio non è ideale, cambiare angolo accidentali dei laser di eccitazione o sostituire il buffer di imaging. Aspettatevi un campionamento di "verticale", "orizzontale" e "diamond" forme di FPF, che rappresenta fluorofori da sotto, sopra e all'interno del piano focale, rispettivamente (Figura 5). Se la maggior parte delle macchie Visualizza PSF orizzontale o verticale, quindi il piano focale è fuori dal centro delle cellule, quindi terminare l'esperimento e regolare nuovamente il piano focale. Una presenza di bolle d'aria nell'olio di immersione o altri fattori locali può influenzare la qualità degli PSF, quindi potrebbe essere necessario sostituire l'olio o passare a una diversa area di imaging del campione. - Per l'analisi di dati, utilizzare open source (nel plugin di ImageJ NIH) o codici commercialmente disponibili per rilevare i centroidi di ogni spot in ogni fotogramma di imaging ed estrarre valori z di ogni spot da x - e y-larghezze14.
Nota: In questo rapporto, un codice sorgente sviluppato originariamente in una delle prime singola molecola basata su rilevazione SR8 fu modificato per rilevazione 3D16 ed è stato usato. - Nel caso di formazione immagine di due colori, immagini il fluoroforo con la lunghezza d'onda di eccitazione, seguito da quello con la minore lunghezza d'onda di eccitazione. Eseguire il codice di acquisizione automatizzata Analogamente a quello descritto al punto 5.4, ma con un diverso laser imaging.
Nota: è necessario correggere aberrazione cromatica tra le immagini con diversi fluorofori (ad es., colorante rosso e giallo-verde colorante). Ecco i passaggi.- Immobilizzare più 100 nm multicanale perline su vetrino coprioggetti, evitando che formano i mazzi.
- Prendere le immagini di loro in canali diversi di eccitazione.
- Estratto di (X, Y, Z) Coordinate dal software (punto 5.6).
- Trama ΔXho = X1i - X2i e ΔYi = Y1i - Y2i (i è per sfere diverse, e 1 e 2 sono i canali di colore diverso) separatamente e farli stare con funzioni proprie. Salvare le funzioni.
Nota: Le funzioni lineari sono sufficienti nella maggior parte dei casi. Una volta che queste funzioni sono determinate, questa misura non deve essere ripetuta ogni volta di imaging. - Nell'imaging di SR due colori effettivo di un campione di interesse, è possibile applicare le funzioni a (X, Y) correggere l'aberrazione cromatica. Per z-direzionale aberrazione cromatica, la condotta di ottenere ΔZ = Z1 - Z2 per perline multicanale o campioni multicanale di riferimento noto seminati insieme con il campione di interesse.
Nota: a differenza di (X, Y) aberrazione cromatica, aberrazione cromatica z-direzionale non è ben riproducibile in ogni esperimento, principalmente a causa di manutenzione incompleta z-direzionale focus sulla commutazione dei canali. Così, si consiglia di effettuare la correzione ogni volta. ΔZ = Z1 - Z2 è per lo più indipendenti di (X, Y), quindi, solo un paio di perline o campioni di riferimento sarebbe sufficienti per ciascuna area campione di interesse. Tracciare le immagini di SR due colori finali costruite in un software di visualizzazione 3D e controllare ΔZ manualmente.
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Representative Results
Questo microscopio permette flessibile e riproducibile di commutazione tra diversi metodi di imaging. Qui vi mostriamo immagini campione raccolti con ogni modulo imaging.
Figura 5 viene illustrato il PSF della molecola il lampeggiare durante l'acquisizione di SR. Migliaia di tali immagini vengono ricostruiti per generare l'immagine finale di SR (Figura 5E). Figura 5E Mostra lo stessi RNA regolatori batterici come illustrato nell'immagine epi-fluorescenza nella figura 7A. Figura 7 Mostra le immagini rappresentative epi-fluorescenza di un piccolo RNA regolamentazione in cellule di Escherichia coli e un mRNA in cellule di mammifero U2OS. Entrambi RNAs sono etichettati con etichetta fluoroforo oligo DNA attraverso in situ ibridazione17. Figura 8 Mostra la misurazione di smFRET rappresentante di molecole di RNA piegati etichettati con colorante donatore (colorante verde) e colorante accettore (colorante rosso). I complessi sono immobilizzati sul vetrino da microscopio ed eccitati da illuminazione TIRF. Traiettorie di intensità di fluorescenza possono essere estratta da singole molecole singole, generando l'efficienza FRET come funzione del tempo.
Figura 1: la progettazione dell'allestimento microscopio. (A), questo pannello mostra un diagramma dell'allestimento. M = specchio, DBS = divisore di fascio dicroici, LCF = laser pulizia filtro, io = iris, L = lente, AP = piastra adattatrice, ZTM = asse z traslazionale montare, di = fibra ottica, OFC = fibra ottica accoppiamento, CL = lente cilindrica, TL = tubo lente, EF = emissione filtro/i, Obj = obiettivo lente e SM = motore passo-passo. Il sistema di correzione z-drift sposta il motore passo-passo sul portaobiettivi della lente dell'obiettivo nella direzione opposta della z-deriva, che viene calcolata dal segnale a infrarossi (IR) generata da un LED e rilevato da un rilevatore. (B), questo pannello mostra il montaggio di eccitazione laser. Quattro laser sono combinati attraverso specchi e dicroico beam splitter e vengono quindi indirizzate a una fibra ottica attraverso una lente di focalizzazione e un piatto di adattatore che si siede su un Monte traslazionale (inferiore dell'immagine). (C), questo pannello mostra la modulazione laser. Due cavi di Bayonet Neill-Concelman (BNC) sono collegati a ciascuno del laser (la testa o il controller, a seconda del produttore) per TTL e modulazione analogica (pannello a sinistra). Cavi BNC sono combinati in un unico cavo (pannello centrale) che è connesso a una scheda di acquisizione di dati in una workstation (pannello a destra) per il controllo del computer. (D), questo pannello mostra lo specchio e il divisore di fascio dicroico monta. (E) costruzione di un accoppiatore di fibra in un sistema a gabbia. Una piastra adattatore in fibra (AP) è montata in un Monte di traduzione di z-axis (ZTM) in modo che la distanza per la doppia lente acromatica (L1, vista laterale indicato) può essere modulata. AP e ZTM avere discussioni, come L1 e il bilanciere in corrispondenza. (F), una coppia di Iris (circonda) vengono installati durante la procedura di allineamento per i laser di più. Essi sono utilizzati per garantire che il laser 647-nm (pannello di sinistra) e il laser 561 nm (pannello di destra) passare attraverso lo stesso percorso. Viene visualizzata la finestra di (G), una parte parziale del percorso delle emissioni. All'esterno il corpo del microscopio, la ruota di filtro di emissione, lo splitter di emissione e la fotocamera EMCCD vengono installati nell'ordine. (H), questo pannello mostra il montaggio del braccio di illuminazione. L'obiettivo di mag è inserito nel braccio illuminazione. I raggi laser di eccitazione vengono inviati per il braccio di illuminazione attraverso la fibra ottica e la fibra ottica accoppiamento (sul lato destro della foto). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: l'obiettivo di mag. (A), questo pannello mostra proiezioni ortografiche del titolare lenti di alloggiamento per l'ingrandimento di fasci laser (unità: mm). Questo disegno è destinato a essere inserito nel braccio illuminazione. (B) questo pannello mostra un disegno interno del foro nel supporto dove ottengono due lenti. L1 è una lente concava e L2 è una lente convessa, e la distanza tra loro è la somma delle loro lunghezze focali. (C) Questa è una foto della lente mag. (D) l'obiettivo di mag può essere inserito nel braccio illuminazione per espandere o concentrare i raggi laser (a sinistra) o può essere rimosso per mantenere i fasci laser invariati (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: la lente 3-d. (A), questo pannello mostra proiezioni ortografiche del titolare avendo un foro circolare in bianco per la modalità di bypass e un foro rettangolare per tenere la lente cilindrica (unità: mm). Questo disegno è destinato a essere in forma per il cursore per analizzatore DIC in un corpo del microscopio. (B) Questa è una foto della lente 3D. (C) il cilindrico lente possa essere impegnati nel percorso del fascio di emissione per causare PSF con astigmatismo (a sinistra) o può essere disinserito per la modalità di bypass, mantenendo intatto il PSF (destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: multi-canale allineamento dello splitter emissione. Schemi di ottica e percorso della luce sono mostrati nella barra di divisione di emissione con (A), un cubo di bypass, (B) un cubo di calibrazione e un cubo (C), una camera tripla. M = specchio. Il cubo di bypass ha uno specchio all'interno (M5) e dovrebbe essere utilizzato con un filtro di emissione (EF) nella ruota filtro barriera. Il cubo di calibrazione ha beam splitter (BS) che permette luci di passare attraverso tutti i canali. Il cubo triplo ha due divisori di fascio dicroico (DBS), così come tre filtri di emissione. (D) Queste sono le foto dei tre cubi. (E) l'interno della barra di divisione di emissione è indicato senza un cubo (pannello superiore) e con un cubo (pannello inferiore) scorrevole. M3 è dietro M4 e non catturato nella foto. Manopole di controllo per gli specchi sono sulla parte superiore della barra di divisione di emissione (pannello superiore). (F), questo pannello mostra allineamento di canale utilizzando il cubo di calibrazione sotto DIC. (G), questo pannello mostra un allineamento fine del verde (pannello superiore) e canali rosso (pannello centrale) tramite perline multicanale 100 nm e un cubo di triple. Un'immagine unita dei due canali è inoltre indicata (pannello inferiore). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: acquisizione di immagini rappresentative SR. Questi pannelli mostrano un'immagine DIC rappresentativa (A) di sotto, (B) a o (C) sopra il piano centrale delle cellule. (D), questo pannello mostra un esempio di FPF di fluorophores lampeggiante-su. Il cerchio arancione circonda un FPF "verticale". Il cerchio verde circonda un FPF "orizzontale". Il cerchio blu circonda un PSF a forma di diamante, che rappresenta fluorofori presso un piano mirato. (E), questo pannello mostra che un rappresentante ricostruita immagine SR. Un piccolo RNA regolamentazione viene etichettata mediante ibridazione in situ di fluorescenza con colorante rosso. I bordi bianchi segnano i bordi delle celle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: un codice di acquisizione dati programmati per l'imaging di SR. In questo modulo di acquisizione programmabile, vari comandi di esecuzione e le funzioni di controllo del microscopio sono elencate nel pannello di sinistra e possono essere selezionate per creare codice di acquisizione programmata. I comandi vengono eseguiti in sequenza dall'alto verso il basso. Questa schermata mostra un esempio dove un predefiniti che certo numero di acquisizioni di imaging iterati è condotte fino a quando l'acquisizione si pone e viene calcolato il numero di punti in tre fotogrammi sequenziali. Se il numero medio di queste macchie è sopra la soglia (definita come il 50% del numero di cellule batteriche Imaging), l'acquisizione di immagini continua nello stesso ciclo. Se sotto la soglia, quindi l'acquisizione di immagini continua nel ciclo successivo dove viene utilizzata la più forte potenza laser viola (tagliato nella parte inferiore della schermata). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: immagini rappresentante epi-fluorescenza. (A), questo pannello mostra un piccolo RNA regolamentazione in cellule di Escherichia coli . (B), questo pannello mostra un mRNA in cellule di mammifero U2OS. RNAs sono etichettati con colorante rosso e blu della tintura tramite l'ibridazione in situ di fluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: esempio di imaging smFRET. (A) i campioni sono stati eccitati con il laser di 561 nm. Emissioni (B) i coloranti verdi e rosse sono raccolti simultaneamente e mostrate come verde (a destra) e macchie rosse (a sinistra), rispettivamente. (C), questo pannello mostra il rappresentante fluorescenza intensità vs traiettorie di tempo del colorante verde (verde) e colorante rosso (rosso) da una molecola. (D) questo pannello mostra il FRET efficienza vs la traiettoria di tempo (linea blu continua) calcolata come hoAcceptor/ (iodonatore + IAcceptor) da una molecola del campione. La traccia FRET è equipaggiata con il modello di Markov nascosto (linea rossa tratteggiata). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo sistema di microscopio ibrido Elimina la necessità di acquistare più microscopi. Il costo totale per tutte le parti, compresa la tabella ottica, tabella installazione manodopera, software e workstation, è circa 230.000 $. Custom lavorati parti, tra cui la mag lente e lente 3D, un costo di circa $700 (il costo dipende da veri e propri addebiti presso diversi istituti). Tipico commercialmente disponibili sistemi integrati per la microscopia SR basati sul rilevamento di singola molecola costato più di $300.000 ~ 400.000 e non sono prontamente disponibile per la misura di smFRET, o epi-imaging per un campo di vista ragionevole, senza luce bianca origine. Così, l'approccio qui presentato può ottenere funzionalità di imaging equivalente a più microscopi ad un costo notevolmente ridotto.
Questo sistema di microscopio modulato può essere basato sui corpi di microscopio da produttori diversi. La lente 3D potenzialmente può essere installata in qualsiasi posizione nel percorso di emissione, compreso l'interno lo splitter di emissione, all'interno del corpo del microscopio, o nello spazio disponibile tra la ruota e il portaobiettivi. Tuttavia, la posizione fisica della lente 3D determinerà la sua lunghezza focale per ottenere il migliore effetto di astigmatismo per l'imaging 3D SR. Si consiglia di iniziare con una lunghezza focale di 10 m. La lente di mag è essenzialmente un espansore del fascio installato nel percorso di eccitazione. Se il laser di eccitazione sono accoppiati a aria (cioè., senza fibra ottica), è banale per installare un pulsante di espansione in qualsiasi posto dopo i fasci laser sono collimati. Se il laser di eccitazione sono accoppiati in fibra, quindi cercare slot extra installare due lenti (una concava e una convessa). Ad esempio, molte braccia di illuminazione commerciale hanno uno slot per filtri a densità neutra. Trovare due lenti con la somma delle loro lunghezze focali pari alla distanza tra i due slot. Quindi, possono essere inseriti per funzionare come una lente di mag. In alternativa, un supporto per lo scorrimento del diaframma di campo può essere un altro posto, se disponibile. Costruire la lente mag in una cassetta rimovibile ha l'ulteriore vantaggio di consentire di mettere a fuoco i laser di eccitazione per ottenere maggiore potenza, che può risultare necessaria per l'imaging di SR, semplicemente lanciando l'orientamento della lente mag.
In questo rapporto, abbiamo dimostrato flessibile di commutazione tra tre diverse tecniche di imaging utilizzando un microscopio modulato. Questo set-up può essere utilizzato per applicazioni più ampie e più avanzate. Ad esempio, la configurazione di SR può essere utilizzata per singola particella di monitoraggio nelle cellule vive, foto-invertibile o fuse fluorescente proteina-etichetta biomolecole di interesse18,19. La configurazione di smFRET può essere utilizzata per studiare le interazioni molecolari in vivo sistemi20. La rilevazione di multi-canale di emissione basati su splitter combinabile con la configurazione di SR per eseguire due colori SR imaging o singola particella21contemporaneamente di rilevamento.
Questo set-up può essere ulteriormente ampliato per consentire più modulate componenti. Ad esempio, un altro strato di torretta e illuminazione vano del filtro può aggiungersi, affinché i percorsi aggiuntivi eccitazione/emissione possono essere creati per altri canali, ad esempio uno con un laser infrarosso (IR) per l'imaging di campioni contrassegnati con le tinture IR. Oltre a consentire il canale imaging aggiunto, IR laser può essere utilizzato per correggere la deriva di fase nell'imaging SR durante l'acquisizione di imaging o durante l'analisi post. Per la correzione di deriva durante l'acquisizione di immagini, se il sistema di correzione z-deriva non è disponibile presso il produttore del microscopio, un sistema alternativo con laser IR può essere entrambi autocostruito14 o acquisiti da aziende di terze parti. Per la correzione di post-acquisizione deriva, un laser a infrarossi utilizzabile per tenere traccia di marker fiduciali. 22
Microscopia di singola molecola basata su rilevazione SR richiede due insiemi di software, uno per l'acquisizione dati e uno per l'analisi dei dati. Per l'acquisizione di dati, anche un software di semplice autocostruito che prende le immagini tramite la fotocamera mentre il controllo ON dei laser/OFF comportamenti possono lavorare per generare immagini di SR, mentre è possibile modulare manualmente la potenza del laser di 405 nm, per esempio, ruotando un filtro a densità neutra gradiente davanti il laser installato. Tuttavia, questo modo di condurre l'esperimento dipende dal giudizio soggettivo di sperimentatore della densità di lampeggiante su macchie. Così, in questo modo non è obiettivo e potrebbe non essere adatto ad essere utilizzato per la quantificazione della SR dati di imaging. Il codice di acquisizione dati utilizzato qui include il rilevamento di spot / un algoritmo conteggio mentre l'acquisizione dei dati è in corso, che consente la modulazione automatica della potenza laser 405 nm basato sulla densità del lampeggiante su macchie (Figura 6). Al giorno d'oggi, è possibile che alcuni produttori di microscopio forniscono moduli programmabili di imaging, così uno può utilizzare questi, o cercare il plugin da fonti aperte come Micro-Manager. Per l'analisi di dati, è possibile utilizzare i moduli di analisi disponibili in commercio da microscopio produttori o cercare plugin da fonti aperte come ImageJ.
In sintesi, il set-up qui presentato fornisce elevata versatilità e passare facilmente tra spazio e diverse configurazioni di imaging a un costo ridotto. Questo set-up è relativamente facile da adottare presso un laboratorio di ricerca in scienze biologiche con una necessità di routine e diversi esperimenti di imaging.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
J.F. riconosce sostegno dal programma di studiosi di Searle e il direttore di NIH nuovo Innovator Award. Gli autori riconoscono utili suggerimenti dal laboratorio di Paul Selvin (Università dell'Illinois, Urbana-Champaign) per il posizionamento della lente 3D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
References
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
