Summary
Hier präsentieren wir Ihnen eine praktische Anleitung für eine integrierte Mikroskopie Bausystem, das konventionelle Epi-fluoreszierende Bildgebung, Einzelmolekül-Erkennung-basierte Höchstauflösung Bildgebung und Multi-Color Einzelmolekül-Erkennung übergeht, einschließlich Einzelmolekül-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer imaging, in einer Aufspannung auf kostengünstige Weise.
Abstract
Fluoreszenz-Mikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug biologische Moleküle in Situ zu erkennen und ihre Dynamik und Interaktionen in Echtzeit zu überwachen. Neben konventionellen Epi-Fluoreszenz-Mikroskopie wurden verschiedene bildgebende Verfahren entwickelt, um spezifische experimentelle Ziele zu erreichen. Einige der weit verbreiteten Techniken umfassen Einzelmolekül-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (SmFRET), die Konformationsänderungen und molekulare Interaktionen mit Ångström Auflösung und Einzelmolekül-Erkennung-basierten berichten können Super-Resolution (SR) bildgebende Verfahren, die die räumliche Auflösung etwa zehn zu Lampentyp im Vergleich zur Beugung begrenzte Mikroskopie erhöhen kann. Hier präsentieren wir Ihnen ein Kunde entwickelt integriertes System, das mehrere bildgebende Verfahren in einem Gerät, einschließlich der konventionellen Epi-fluoreszierende Bildgebung, Einzelmolekül-Erkennung-basierte SR Bildgebung und Multi-Color Einzelmolekül-Erkennung übergeht, einschließlich SmFRET Bildgebung. Verschiedene bildgebende Verfahren können durch optische Schaltelemente leicht und reproduzierbar erreicht werden. Dieses Set-up ist einfach, von jedem Forschungslabor in den biologischen Wissenschaften mit einem Bedürfnis nach Routine und diverse bildgebenden Experimenten zu einem reduzierten Preis und Platz im Vergleich zu separaten Mikroskope für individuelle Zwecke bauen erlassen.
Introduction
Fluoreszenz Mikroskope sind wichtige Werkzeuge für die moderne biologische Forschung und Fluoreszenz-Bildgebung ist in vielen Biologie Labors routinemäßig durchgeführt. Durch tagging Biomoleküle mit Fluorophore, können wir direkt unter dem Mikroskop zu visualisieren und erfassen die zeitabhängige Änderungen in Lokalisierung, Konformation, Interaktion, und Montage Zustand in Vivo oder in Vitro. Herkömmlichen Fluoreszenz Mikroskope haben eine Beugung begrenzte Ortsauflösung, die ~ 200-300 nm in seitlicher Richtung und ca. 500-700 nm in axialer Richtung1,2, und sind daher beschränkt auf Bildgebung bei der 100 s von Nanometer-µm-Skala. Um Feinheiten in der molekularen Montage oder Organisation zu offenbaren, entstanden verschiedene SR-Microscopies, die die Beugungsgrenze brechen kann. Strategien zur Erreichung SR umfassen eine nichtlineare optische Effekte, wie z. B. stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie3,4 und strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM)5,6, 7, stochastische Erkennung von einzelnen Molekülen, wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm)8 und photoaktiviert Lokalisierung Mikroskopie (PALM)9und eine Kombination aus beidem, z. B. MINFLUX10. Unter diesen Microscopies SR können Einzelmolekül-Erkennung-basierte SR Mikroskope relativ leicht von einem Einzelmolekül-Mikroskop-Set-up geändert werden. Mit sich wiederholenden Aktivierung und Bildgebung von Photoactivatable fluoreszierenden Proteinen (FPs) oder Foto-schaltbare Farbstoffen markiert auf Biomoleküle von Interesse kann räumlicher Auflösung 10-20 nm11erreichen. Informationen über molekulare Interaktionen und Konformationsänderungen gewinnen ist Dynamik in Echtzeit, Ångström-Nanometer Auflösung erforderlich. SmFRET12,13 ist ein Ansatz, um diese Auflösung zu erreichen. In der Regel abhängig von der biologischen Fragen von Interesse, werden bildgebende Verfahren mit unterschiedlicher räumlicher Auflösung benötigt.
In der Regel ist für jede Art der Bildgebung, bestimmte Erregung und/oder Emission optische Konfiguration erforderlich. Zum Beispiel ist eines der am häufigsten verwendete Beleuchtung-Methoden für die Einzelmolekül-Erkennung durch Totalreflexion (TIR), in denen ein bestimmte Erregung Winkel durch ein Prisma oder durch das Objektiv erreicht werden muss. Für die Erkennung von SmFRET müssen Emissionen von Donor und Akzeptor Farbstoffe räumlich getrennt und gerichtet auf verschiedene Teile der Elektron-Multiplikation, – Coupled Ladegerät (EMCCD), die mit einer Reihe von Spiegeln und dichroitischen Strahlteilern erreicht werden kann in der Emission Weg gelegt. Für dreidimensionale (3D) ist SR imaging, eine optische Komponente, wie z. B. eine Zylinderlinse14, musste einen Astigmatismus-Effekt in der Emission Pfad führen. Daher Homebuilt oder kommerziell erhältliche integrierte Mikroskope sind in der Regel, funktionell für jede Art von bildgebendes Verfahren spezialisiert und sind nicht flexibel wechseln zwischen verschiedenen bildgebenden Verfahren auf die gleiche Set-up. Hier präsentieren wir Ihnen ein kostengünstige, Hybridsystem, das verstellbare und reproduzierbare wechselt zwischen drei verschiedenen bildgebenden Verfahren bietet: konventionelle Epi-fluoreszierende Bildgebung mit Beugung begrenzte Auflösung, Einzelmolekül-Erkennung-basierte SR Bildgebung und Multi-Color Einzelmolekül-Erkennung, einschließlich SmFRET imaging (Abbildung 1A). Insbesondere das Setup hier vorgestellten enthält fasergekoppelte Eingabe Laser für mehrfarbige Erregung und ein kommerzielle Beleuchtung Arm in die Erregung Weg, wodurch programmiert Kontrolle der Erregung Winkel zwischen Epi-Modus und TIR-Modus wechseln. In der Emission Weg eine abnehmbare Homebuilt Zylinderlinse Kassette befindet sich innerhalb des Körpers Mikroskop für SR 3D-Imaging und ein kommerziellen Strahlteiler befindet sich vor einer EMCCD Kamera, die selektiv aktiviert werden kann, um mehrere Kanäle der Emission zu erkennen gleichzeitig.
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Protocol
(1) Mikroskop Konstruktion und Montage
-
Erregung Weg
Hinweis: Der Erregung-Pfad enthält, Laser, differential Interferenz Kontrast (DIC) Komponenten, die Mikroskop-Körper und seine Beleuchtung Arm.- Bereiten Sie einen Vibration isoliert optischen Tisch. Beispielsweise bietet eine strukturelle Dämpfung Tabelle mit 48 x 96 x 12'' genügend Platz für alle Komponenten.
Hinweis: Erstellen Sie das Setup in einem Raum mit Temperaturregelung (z. B.21,4 ± 0,55 ° C). Temperaturstabilität ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der optischen Achse. - Installieren Sie einen Mikroskop-Körper, der ausgestattet ist mit Beleuchtung Arm für LWL-Anschluss, ein 100 X Objektiv Ölimmersion TIRF und DIC Komponenten.
- Legen Sie vier Laserköpfe (647 nm, 561 nm, 488 nm und 405 nm, umkreist in Abbildung 1 b) ihre Kühlkörper auf dem optischen Tisch und stellen Sie sicher die ausgesandten Laserstrahlen haben die gleiche Höhe und sind so kurz wie möglich (z.B. gute Standfestigkeit 3'').
Hinweis: Wenn eine Laser-Kopf in einer kürzeren Höhe als andere Laser sitzt, setzen Sie eine Alu-Platte mit ausreichend dicke darunter. Immer gewährleisten Sie maximalen Kontakt zwischen dem Kühlkörper und der optischen Tisch für die beste Wärmeabfuhr (Abbildung 1 b). Die Laser müssen stark genug sein für die SR-Bildgebung. Siehe Tabelle der Materialien. Es wird empfohlen, die Aufräumarbeiten Laserfilter vor Diodenlaser haben. - Installieren Sie eine Datenkarte für die Übernahme durch eine periphere Component Interconnect (PCI)-Interface in einer Workstation zu und verbinden Sie Laser mit dieser Karte. Kontrollieren Sie die Laser ON/OFF Verhaltensweisen von Transistor-Transistor-Logik (TTL) Ausgang und ihre Leistungsanpassung durch den analogen Ausgang dieser Karte (Abbildung 1). Installieren Sie eine richtige Mikroskopie imaging-Software (kommerziell oder Homebuilt), die Datenkarte Übernahme zu kontrollieren sowie die Mikroskop-Körper.
- Montieren Sie Spiegel und dichroitischen Strahlteilern (590, 525 und 470 lange pass Filter) zu ihren jeweiligen Halterungen. Verwenden Sie sehr stabile Spiegelhalter für die Spiegel. Verwenden Sie kreisförmige Splitter mit Sicherungsringen um zu vermeiden, ein Verbiegen der dichroitischen Strahlteilern (Abbildung 1).
- Legen Sie die Spiegel und dichroitischen Strahlteilern auf dem optischen Tisch, die Laserstrahlen (Abbildung 1 b) zu kombinieren. Um die stabilsten Ausrichtung zu erreichen, machen Sie das ganze Arrangement so kompakt wie möglich zu, und verwenden Sie Dicke 1'' optische Beiträge. Ordnen Sie die Laser so an, dass die kürzere Wellenlänge Laser näher an der LWL-Kupplung (Abbildung 1 b), sind da kurzwellige Licht mehr in der Luft zu zerstreuen.
- Kombinieren Sie Laserstrahlen in eine Monomode-Glasfaser. Hierzu bauen Sie ein LWL-Koppler in einem Käfig-System folgende Schritte durch:
- Montieren Sie eine Adapterplatte Faser in eine z-Achse Übersetzung montieren (Abb. 1E, linken Panel).
- Montieren Sie eine achromatische Wams Objektiv (Brennweite = 7,5 mm) in einer Führungsscheibe (Abb. 1E, zweiten Fenster von links).
- Verbinden Sie die zwei Teile oben von Verlängerungsstangen in einem Käfig zu bilden. Montieren Sie den Käfig auf dem optischen Tisch mit Halterungen an den 1'' dicken optische Pfosten (Abb. 1E, mittleren Bereich).
- Ausrichten des 647-nm-Lasers zuerst mit einem Monomode-Glasfaser (FC/APC Ende der Koppler).
Hinweis: Eine grobe Ausrichtung mit einem Multimode-Glasfaser, bevor die Monomode-Glasfaser den Alignment-Prozess mit Hilfe kann. Passen Sie den Winkel der Spiegel und dichroitischen Strahlteilern (Abbildung 1, von Einstellknöpfen), sowie der Abstand zwischen der achromatischen Doublet Linse und die Faser-Adapterplatte (Abbildung 1E, durch Anpassen der z-Achse Übersetzung Mount) zu gewinnen maximale Laserleistung durch die Faser. - Sobald die Ausrichtung des ersten Lasers erfolgt, vorübergehend ein paar Iris zu installieren und den Rest der Laser eins nach dem anderen (Abb. 1F) ausrichten. Überprüfen Sie die Ausrichtung Effizienz mit einem Leistungsmesser.
- Lassen Sie eine Iris an der Vorderseite der Adapterplatte, die Reflexionen der Laser zu reduzieren.
Hinweis: Strong wieder Reflexionen reduzieren die Lebensdauer der Laserquellen. Optional kann ein optischer Isolator vor jeder Laserkopf, die Reflexionen vollständig zu entfernen installiert werden.
- Verbinden Sie das andere Ende des Lichtleiters Beleuchtung Arm des Mikroskops (Abbildung 1 H).
- Entwerfen Sie und installieren Sie die "Vergrößerungslinse (Mag Objektiv)" durch die folgenden Schritte:
Hinweis: Der Laser können für Epi-Fluoreszenz-Bildgebung der Probe verwendet werden, aber die schmalen Strahlgröße jeder Laser beschränkt das Leuchtfeld der Probe zu einer Fläche kleiner als die tatsächliche Größe der entsprechenden Kamera-Sensor, vor allem für die neuere Kameras (mit 18,8 mm Diagonale Länge im Vergleich zu den herkömmlichen 11,6 mm Länge). Daher ist es wünschenswert, erweitern Sie den Strahl um eine größere und flachere Beleuchtung der Probe zu erreichen.- Design der Mag-Linse, die in der Beleuchtung Arm (Abbildung 1 H) passen.
Hinweis: Das Design des Objektivs Mag hängt davon ab, wo es installiert werden soll. Abbildung 1 H zeigt ein Beispiel für die Installation im Studienarm mit Beleuchtung, aber es kann in jeder beliebigen Stelle installiert werden, nachdem die Laserstrahlen kollimierten (siehe Diskussion) sind. Mit einem Computer-aided-Design und Erstellung Software zu entwerfen. - Legen Sie zwei achromatische Linsen, eine konkave (Brennweite = f1), und eine konvexe (Brennweite = f2) in den hausgemachten Mag Objektivhalter (Abbildung 2A und 2 C), mit dem Abstand gleich der Summe ihrer Brennweiten f1 + f2 = (-25) + 50 = 25 mm (Abb. 2 b).
Hinweis: Mit dieser Auswahl an Brennweiten, erweitert das Mag Objektiv den Strahl durch f2/ | f1| = 2 Falten. Das Mag Objektiv bietet Vielseitigkeit. Es kann entfernt, um die normale Beleuchtung wieder aufzunehmen, ohne Ausbau der Balken (Abb. 2D) oder eingefügt in die umgekehrte Richtung zu konzentrieren, den Laserstrahl um eine stärkere Anregung Intensität zu erreichen.
- Design der Mag-Linse, die in der Beleuchtung Arm (Abbildung 1 H) passen.
- Bereiten Sie einen Vibration isoliert optischen Tisch. Beispielsweise bietet eine strukturelle Dämpfung Tabelle mit 48 x 96 x 12'' genügend Platz für alle Komponenten.
2. Emission Pfad
Hinweis: Die Emission Pfad besteht aus abnehmbaren Zylinderlinse, ein Barriere-Filterrad, eine Emission Splitter und einer EMCCD Kamera (Abbildung 1). Um den optimalen Punkt zu erreichen verteilt Funktion (PSF) von einzelnen Molekülen, das DIC Prisma ist gesetzt, Weg von der Objektivlinse.
- Custom-Design der Zylinderlinse (3-d-Objektiv)-Kassette, die in der manuellen DIC Analyzer passen kann einfügen Slot im Mikroskop Körper (Abbildung 3).
Hinweis: Das Design den DIC-Analyzer beeinträchtigt nicht da ein Analysator-Block in der Filterrevolver eingefügt werden kann. - Legen Sie das 3-d-Objektiv 10 m Brennweite in der Kassette und legen Sie sie in den Strahlengang der Emission den Astigmatismus-Effekt für die Z-Koordinate jedes einzelne Molekül14extrahieren schaffen.
Hinweis: Optional kann die 3-d-Objektiv-Kassette in oder aus dem Emissions-Weg (Abbildung 3) platziert werden. - Installieren Sie einen Multiband dichroitischer Strahlteiler in Filterrevolver innerhalb der Mikroskop-Körper.
- Installieren Sie Emission-Filter.
Hinweis: Die Emission Filter sind abhängig von der bevorzugten Fluorophore gewählt. Je nach imaging Modul dienen Emission Filter an verschiedenen Orten platziert, wie nachfolgend beschrieben:- Verwenden Sie für sequentielle Multi-Color-Epi-Fluoreszenz-Bildgebung oder SR Bildgebung Emission Filter platziert in die Barriere Filterrad neben dem Mikroskop Körper verbunden, um die Schwingung im Mikroskop Körper während Kanalumschalter (Abbildung 1) zu minimieren.
- Legen Sie für gleichzeitige Multi-Color-Erkennung (z.B., SmFRET Experimente) einen weiteren Filter inmitten einer Emission-Splitter (Prüfschritt 4 für Details).
Hinweis: In der Regel hat ein kommerzielle Emission Splitter zwei schaltbare Modi (d.h., "engagiert" oder "umgehen" Modi). Um Emissionen Lichter chromatisch für gleichzeitige Multi-Color Imaging ("engagiert" Modus) zu trennen, ein Filter Cube hält zwei dichroitischen Strahlteilern und drei Emission Filter verwendet ("dreifache Würfel," Abbildung 4 und 4 D). Ein leeres Feld in das Filterrad Barriere dient in Kombination mit dem dreifachen Würfel. Auf der anderen Seite für sequentielle Multi-Color Imaging wird der dreifache Würfel mit einem Quader ersetzt, die nur einen Spiegel im Inneren ("Bypass Würfel," Abbildung 4A und 4D) hat.
- Installieren Sie die EMCCD Kamera, als der letzte Teil des Weges Emission. Nutzen Sie die USB-PCI-Verbindung um eine schnelle Bildrate zu erreichen.
Hinweis: Eine EMCCD Kamera empfiehlt sich für die empfindlichsten Einzelmolekül-Erkennung, sondern eine erweiterte sCMOS Kamera kann eine Alternative sein.
(3) Beugung begrenzte Imaging mit Epi-Anregung
- Stellen Sie die Erregung Laser anfallende Winkel Epi-Modus im Studienarm mit Beleuchtung.
- Lösen Sie die 3-d-Objektiv wenn (Abbildung 3, rechts) engagiert.
- Die Bypass-Cube in der Emission-Splitter (Abbildung 4A und 4E, Bodenplatte) einfügen.
- (Optional) Legen Sie das Mag Objektiv für eine erweiterte Beleuchtung Bereich (Abb. 2D, links).
Hinweis: Mit der Verwendung von einem Mag Objektiv und ein 100 X Objektiv Öl-Immersion, kann ca. 91 x 91 µm2 gleichmäßig beleuchtet werden entfällt die Notwendigkeit, eine weiße Lichtquelle und mehrere Filter Cubes verwenden. - Verwenden Sie eine imaging-Software zu Multi-Channel, Mikroskopie und/oder Z-Stapel und/oder Zeitraffer Bilder.
Hinweis: Es gibt mehrere Programme für die Mikroskopie Bildgebung, nicht nur von Mikroskop-Herstellern, sondern auch von Drittfirmen oder open-Source-Entwickler.
4. Multi-Channel Einzelmolekül-Bildgebung einschließlich smFRET
Hinweis: Verschieben Sie, eine "leere" Position in der Barriere Filterrad, so dass die Emission mit beliebiger Wellenlänge, der zweite Satz von Filtern/dichroitischen Strahlteilern Emission Splitter erreichen kann.
- Zum Einrichten von Multi-Farberkennung Einzelmolekül-Oberfläche immobilisiert Moleküle15 mit TIRF Erregung, einschließlich SmFRET-Messung, einstellen Sie die Erregung Laser anfallende Winkel TIRF Winkel. Das Mag Objektiv und dem 3-d-Objektiv zu lösen.
- Der drei-Kanal-Modus in der Emission-Splitter (Abbildung 1) durch die folgenden Schritte zu engagieren:
- Den Bypass-Würfel mit einem "Kalibrierung Cube" zu ersetzen, die lässt Licht durch alle Kanäle (Abbildung 4 b und 4E) gehen.
- Schalten Sie die Kamera unter DIC (d.h. keine Emission Filter in das Filterrad Barriere) und stellen Sie die Blende des Splitters Emission bis drei vollständig getrennte Kanäle auf dem Bildschirm angezeigt werden.
Hinweis: Führen Sie diesen Schritt mit dem Raumlicht beleuchtet, um alle Kanäle zu visualisieren. - Die Emission Splitter schalten Sie die vertikale/horizontale Anpassung Regler und grob richten Sie der drei Kanäle (Abbildung 4E und 4F aus).
- Schalten Sie die Kamera und ersetzen Sie die Kalibrierung Cube mit einem dreifachen Würfel (Abbildung 4 und 4E) zu.
- Legen Sie eine Probe mit 100 nm Multichannel-Perlen auf dem 100 X Objektiv und konzentrieren sich auf die Probe.
- Schalten Sie die Kamera und der 488 nm Laser, vergrößern Sie eines hellen Perlen und richten Sie fein der drei Kanäle durch drehen die Einstellung Regler wieder (Abbildung 4E und 4 G aus).
Hinweis: Multichannel-Perlen 100 nm emittieren verschiedene Wellenlängen des Lichts auf 488 nm Anregung, damit die Dreikanal-Ausrichtung.
- Schalten Sie die Kamera und Laser, Fokus, und finden Sie eine gute Position mit einer vernünftigen spot Dichte zu. Stellen Sie den Laser Power und Belichtung auf akzeptables Signal-Rausch- und Immunofluoreszenz Niveau zu erreichen. Verwenden Sie die Mikroskopie imaging-Software, um time-lapse Bilder zu nehmen.
5. SR Imaging
Hinweis: Dies ist Einzelmolekül-Erkennung-basierte SR Mikroskopie.
- Um SR Bildgebung einzurichten, legen Sie die 3-d-Objektiv und entfernen Sie die Linse Mag. Legen Sie die Belichtungszeit der Kamera in den entsprechenden Laserkanälen (z.B.5-60 ms). Bestimmen Sie und legen Sie manuell die optimale Erregung Laser anfallende Winkel der TIRF Winkel sein.
- Legen Sie die Probe in SR imaging Puffer16. Lassen Sie den Puffer für mindestens 10 Minuten vor Bildgebung equilibrate.
Hinweis: SR bildgebenden Puffer läuft nach etwa 1 h, so machen neue SR imaging Puffer entsprechend. - Nehmen Sie eine DIC-Bild vor SR-Bildgebung. Verwenden Sie, um die richtige Höhe der Objektive für SR, finden, die den Astigmatismus Effekt optimiert, DIC imaging um zu der Mittelebene der Zellen zu finden. Das Flugzeug durch die Höhe, bei dem die Zellen Übergang von "Light", "dunkle" Bilder und durchsichtig scheinen, zu identifizieren (Abb. 5A, 5 bund 5 C). Sobald die gewünschte Schärfeebene feststeht, engagieren Sie die Z-Drift-Korrektur-System (Abbildung 1A).
- Führen Sie SR-Bildgebung. Ändern Sie die 405 nm Laserleistung weiterhin eine angemessene Dichte "blinkt-on" stellen.
Hinweis: Es ist, zwar möglich, die 405 nm Laser manuell zu ändern ist es bequemer, führen Sie einen programmierten Daten Akquisition Code, um die Dichte der "blinken-ein" Flecken zu erhalten. Hier ist ein Beispiel des wie sie automatisch durchgeführt wird. Der Quellcode ist verfügbar auf Anfrage (Abbildung 6).- Beginnen Sie die bildgebende Übernahme mit 0 W/cm2 violette Laser-Energie.
- Die Anzahl der blinken auf Flecken in einem bestimmten Zeitraum.
- Die violetten Laserleistung zu modulieren, so dass die Anzahl der blinkenden auf Flecken über eine benutzerdefinierte "zählen Schwelle" in das Blickfeld gehalten wird. Die violetten Laserleistung zu erhöhen, die Zählung Schwelle sinkt die Anzahl der blinkenden auf Flecken.
- Beenden Sie die Übernahme, sinkt die Anzahl der blinkenden auf Flecken unter der Zählung Schwelle mit der maximalen Violett Laser macht.
Hinweis: Die maximale kann unterschiedlich je nach Probe Helligkeit einstellen, aber nicht höher als 130 W/cm2. Je nach das eigentliche Ziel der SR Bildgebung kann diese automatische Erfassung Code manuell zu jedem gewünschten Zeitpunkt gekündigt werden.
- Überprüfen Sie die blinkende Verhalten und PSFs der Spots bald nach Beginn der Übernahme.
Hinweis: Wenn das blinkende Verhalten nicht ideal ist, die Erregung Laser anfallende Winkel ändern oder ersetzen des bildgebenden Puffers. Erwarten Sie eine Auswahl der "vertikalen", "horizontal" und "Rauten" PSF, repräsentieren Fluorophore von unten, oben und in der Brennebene jeweils (Abbildung 5). Wenn die meisten Spots entweder vertikal oder horizontal PSFs zeigen, dann die Brennebene ist weg von der Mitte der Zellen, also das Experiment zu beenden und die Brennebene erneut einstellen. Eine Präsenz der Luftblase in der Immersionsöl oder anderen lokalen Faktoren auswirken kann das PSFs Qualität, es kann notwendig sein, das Öl zu wechseln oder wechseln zu einem anderen bildgebenden Bereich der Probe. - Verwenden Sie für die Datenanalyse open Source (im NIH ImageJ Plugins) oder kommerziell verfügbaren Codes erkennen Zentroide von jedem Fleck in jedem bildgebenden Frame und Z-Werte von jedem Ort aus x und y-Breite14extrahieren.
Hinweis: In diesem Bericht ein Quellcode, die ursprünglich in einem der frühesten Einzelmolekül-Erkennung-basierte SR8 entwickelt wurde für 3-d-Erkennung16 geändert und diente. - Im Fall von zwei-Farben-Bildgebung, Bild der Fluorophor mit der längeren Wellenlänge der Erregung, gefolgt von den mit der kürzeren Wellenlänge der Erregung. Führen Sie den automatisierten Übernahme Code ähnlich beschrieben im Schritt 5.4, aber mit einem anderen bildgebenden Laser.
Hinweis: chromatische Aberration sollten zwischen den Bildern mit verschiedenen Fluorophore (z.B., roten Farbstoff und gelb-grüne Färbung) korrigiert werden. Hier sind die Schritte.- Mehrere 100 nm Multichannel-Perlen auf der Glas-Deckglas, Vermeidung von bilden Cluster zu immobilisieren.
- Nehmen Sie Bilder von ihnen in verschiedenen Erregung Kanälen.
- Auszug ihrer (X, Y, Z) durch Software (Schritt 5.6) koordiniert.
- Plot ΔXich = X1i - X2i und ΔYi = Y1i - Y2i (i steht für verschiedene Perlen und 1 und 2 sind die verschiedenen Farbkanäle) getrennt und mit entsprechenden Funktionen passen. Speichern Sie die Funktionen.
Hinweis: Lineare Funktionen sind in den meisten Fällen ausreichend. Sobald diese Funktionen bestimmt sind, muss diese Messung nicht jedes Mal der Bildgebung wiederholt werden. - Gelten Sie in der eigentlichen Zweifarben-SR Bildgebung eine Stichprobe von Interesse die Funktionen für richtig (X, Y) chromatische Aberration. Für die Z-direktionale chromatische Aberration, führen es durch den Erwerb von ΔZ = Z1 – Z2 für Mehrkanal-Perlen oder bekannten Mehrkanal-Referenzproben ausgesät zusammen mit der Probe von Interesse.
Hinweis: im Gegensatz zu (X, Y) chromatische Aberration, Z-direktionale chromatische Aberration ist nicht gut reproduzierbar in jedem Experiment, hauptsächlich aufgrund von unvollständigen Z-direktionale Fokus Wartungsarbeiten beim Kanalwechsel. Daher empfiehlt es sich, die Korrektur jedes Mal durchführen. ΔZ = Z1 – Z2 ist meist unabhängig von (X, Y), nur ein paar Perlen oder Referenzproben würde ausreichen pro jeder Probe-Bereich von Interesse. Grundstück errichteten letzten Zweifarben-SR Bilder in eine 3-d-Visualisierungs-Software und ΔZ manuell zu überprüfen.
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Representative Results
Dieses Mikroskop ermöglicht flexible und reproduzierbare Umschalten zwischen verschiedenen bildgebenden Verfahren. Hier zeigen wir Beispielbilder mit jedem imaging Modul gesammelt.
Abbildung 5 zeigt die PSF des Moleküls blinken auf während der SR-Übernahme. Tausende solcher Bilder sind rekonstruiert worden, um das endgültige Bild SR (Abb. 5E) zu generieren. Abbildung 5E zeigt die gleiche bakterielle regulatorischen RNAs, wie in der Epi-Fluoreszenz-Bild in Abbildung 7Agezeigt. Abbildung 7 zeigt die repräsentative Epi-Fluoreszenzbilder eine kleine regulatorische RNA in Escherichia coli Zellen und eine mRNA in Säugerzellen U2OS. Beide RNAs sind mit Fluorophor-markierten DNA-Oligo durch in Situ Hybridisierung17gekennzeichnet. Abbildung 8 zeigt die repräsentative SmFRET Messung der gefalteten RNA-Moleküle mit Spender Farbstoff (grüne Farbe) und Akzeptor Farbstoff (roter Farbstoff) gekennzeichnet. Die Anlagen sind auf dem Objektträger immobilisiert, und begeistert von TIRF Beleuchtung. Fluoreszenz-Intensität-Trajektorien können einzelne einzelne Moleküle, Generierung von FRET-Effizienz als Funktion der Zeit entnommen werden.
Abbildung 1: das Design des Mikroskop-Set-up. (A) dieses Panel zeigt ein Diagramm des Aufbaus. M = Spiegel, DBS = dichroitischer Strahlteiler, LCF = Laser Aufräum Filter, ich = Iris, L = Linse, AP = Adapterplatte, ZTM = z-Achse translationale montieren, der = optische Faser, OFC LWL Kupplung, CL = Zylinderlinse, TL = = Rohr-Objektiv, EF = Emission Filter, Obj = Ziel Objektiv und SM = Schrittmotor. Die Z-Drift-Korrektur-System bewegt sich den Schrittmotor auf der Nasensteg der Objektivlinse in die entgegengesetzte Richtung der Z-Drift, die durch das Infrarot (IR)-Signal durch eine eigene LED erzeugt und durch einen eigenen Detektor erkannt berechnet wird. (B) dieses Panel zeigt die Laser Erregung Assembly. Vier Laser durch Spiegel und dichroitischen Strahlteilern kombiniert werden und sind dann zu einer optischen Faser durch eine Linse und eine Adapterplatte sitzen auf einem translationalen Reittier (unten im Bild) geleitet. (C) dieses Panel zeigt die Laser-Modulation. Zwei Bajonett Neill-Concelman (BNC) Kabel sind mit jedem des Lasers (der Kopf oder der Controller, je nach Hersteller) für TTL und analoge Modulation (am weitesten links stehende Panel) verbunden. BNC-Kabel sind in ein einziges Kabel (mittlere Panel) kombiniert, die mit einer Datenkarte Erwerb in einer Workstation (ganz rechts Panel) für die Steuerung des Computers verbunden ist. (D) dieses Panel zeigt den Spiegel und dichroitischen Strahlteiler Reittiere. (E) Aufbau einer LWL-Koppler in einem Käfig-System. Eine Faser Adapterplatte (AP) ist in der z-Achse Übersetzung Anschluss (ZTM) montiert, so dass die Entfernung zu den achromatischen Doppellinse (L1, Seitenansicht gezeigt) moduliert werden kann. AP und ZTM haben passende Threads, identisch mit L1 und Führungsscheibe. (F) A paar Iris (umkreist) werden bei der Ausrichtung für mehrere Laser installiert. Sie werden verwendet, um sicherzustellen, dass die 647-nm-Laser (links) und der 561-nm-Laser (rechte Abbildung) durch den gleichen Weg gehen. (G) A teilweise Teil des Pfads Emission wird angezeigt. Außerhalb des Körpers Mikroskop werden das Filterrad Emission, Emission-Splitter und die EMCCD Kamera in Reihenfolge installiert. (H) dieser Bereich zeigt die Beleuchtung Armpaket. Das Mag Objektiv wird in der Beleuchtung Arm eingefügt. Die Erregung Laserstrahlen werden an die Beleuchtung Arm durch die optische Faser und die optische Faser Kupplung (auf der rechten Seite des Bildes) gesendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Das Mag Objektiv. (A) dieses Panel zeigt orthographische Projektionen des Inhabers Gehäuse-Objektive für Lupe Laserstrahlen (Einheit: mm). Dieses Design soll in der Beleuchtung Arm passen. (B) dieses Panel zeigt eine interne Zeichnung des Lochs in der Halterung, wo zwei Linsen in bekommen. L1 ist eine konkave Linse L2 ist eine konvexe Linse und der Abstand zwischen ihnen ist die Summe ihrer Brennweiten. (C) Dies ist ein Foto von der Linse Mag. (D) Mag Objektiv kann im Studienarm mit Beleuchtung zu erweitern oder zu konzentrieren die Laserstrahlen (links) eingefügt werden oder entfernt werden, um die Laserstrahlen (rechts) unverändert zu halten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: das 3-d-Objektiv. (A) dieses Panel zeigt orthographische Projektionen des Inhabers, ein leeres kreisrundes Loch für den Bypass-Modus und ein rechteckiges Loch für die Abhaltung der Zylinderlinse (Einheit: mm). Dieses Design soll in der DIC Analyzer Regler in einem Mikroskop Körper fit zu sein. (B) Dies ist ein Foto von der 3-d-Linse. (C) die zylindrische Linse kann die Emission Strahlengang PSFs mit Astigmatismus (links) zu verursachen teilnimmt oder für den Bypass-Modus, hält der PSFs intakt (rechts) gelöst werden kann. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Multi-Channel-Ausrichtung der Emission Splitter. Regelungen der Optik und Lichtweg Emission-Splitter mit (A) ein Bypass-Würfel, (B) eine Kalibrierung Würfel und (C) eine dreifache Würfel entnehmen. M = Spiegel. Die Bypass-Cube hat einen Spiegel im Inneren (M5) und soll mit einer Emission Filter (EF) in die Barriere Filterrad verwendet werden. Die Kalibrierung Würfel hat Strahlteiler (BS), die Lichter gehen durch alle Kanäle zu ermöglichen. Der dreifache Würfel hat zwei dichroitischen Strahlteilern (DBS), sowie drei Emission Filter. (D) das sind Fotos von den drei Würfeln. (E) wird ohne einen Würfel (obere Abdeckung) und mit einem Würfel (untere Leiste) gleiten in der internen Emission Splitter angezeigt. M3 ist hinter M4 und nicht auf dem Foto festgehalten. Schaltknöpfe für den Spiegel auf die Emission-Splitter (obere Leiste). (F) dieses Panel zeigt Kanal Ausrichtung mit dem Cube Kalibrierung unter DIC. (G) dieses Panel zeigt eine Feinausrichtung der grünen (Oberseite) und rot (mittlere Panel) Kanäle mit 100 nm Multichannel-Perlen und eine dreifache Würfel. Eine zusammengefügte Bild der beiden Kanäle wird auch (Bodenplatte) angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: repräsentative SR Bildaufnahme. Diese Tafeln zeigen ein repräsentatives DIC Bild (A) unter (B) an, oder (C) über die zentrale Ebene der Zellen. (D) dieses Panel zeigt ein Beispiel für die PSF blinken auf Fluorophore. Der orange Kreis umgibt eine "vertikale" PSF Der grüne Kreis umgibt eine "horizontale" PSF Der blaue Kreis umgibt eine rautenförmige PSF, Fluorophore bei einer fokussierten Ebene vertreten. (E) dieses Panel zeigt, dass ein Vertreter SR Bild rekonstruiert. Eine kleine regulatorische RNA wird mit Fluoreszenz in Situ Hybridisierung mit roten Farbstoff gekennzeichnet. Die weißen Ränder markieren die Kanten der Zellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: einen programmierten Daten Akquisition Code für SR Bildgebung. In diesem Modul programmierbar Erwerb verschiedener Ausführung Befehle und Mikroskop-Control-Funktionen werden im linken Fensterbereich aufgelistet und können programmierte Übernahme-Code erstellen ausgewählt werden. Die Befehle werden nacheinander von oben nach unten ausgeführt. Dieser Screenshot zeigt ein Beispiel, wo eine vordefinierte, dass bestimmte Anzahl von iterierten bildgebenden Akquisitionen durchgeführt werden, bis die Übernahme fertig gestellt ist und die Anzahl der Plätze in drei sequenziellen Bildrahmen errechnet. Wenn die durchschnittliche Anzahl der diese Flecken oberhalb der Schwelle (definiert als 50 % der Anzahl der Zellen in der bakteriellen Bildgebung) sind, setzt sich die Bildaufnahme in die gleiche Schleife. Wenn unterhalb der Schwelle, dann die Bildaufnahme weiter in die nächste Schleife wo stärker violett Laserleistung verwendet wird (Schnitt am unteren Rand der Abbildung). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Vertreter Epi-Fluoreszenzbilder. (A) dieses Panel zeigt eine kleine regulatorische RNA in E. Coli Zellen. (B) dieses Panel zeigt eine mRNA in Säugetierzellen U2OS. RNAs sind mit roten Farbstoff und blauen Farbstoff durch Fluoreszenz in Situ Hybridisierung beschriftet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: Beispiel für SmFRET Bildgebung. (A) Proben waren begeistert, mit dem 561-nm-Laser. (B) Emissionen von den grünen und roten Farbstoffe sind gleichzeitig gesammelt und als grün (rechts) und rot (links) Flecken, bzw. angezeigt. (C) dieser Bereich zeigt die repräsentative Fluoreszenz Intensität vs. Zeit Bahnen der grüne Farbstoff (grün) und rot färben (rot) aus einem Molekül. (D) dieses Panel zeigt der Bund Effizienz vs. Zeit Flugbahn (durchgezogene blaue Linie) als ichAkzeptor berechnet/ (ichSpender + IAkzeptor) aus einem Molekül der Probe. Die Bund-Ablaufverfolgung ist mit der Hidden-Markov-Modell (gestrichelte rote Linie) ausgestattet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Mikroskop Hybridsystem entfällt die Notwendigkeit, mehrere Mikroskope zu kaufen. Die Gesamtkosten für alle Teile, einschließlich der optischen Tisch, Tisch Einbau Arbeit, Software und Workstation, ist ungefähr $230.000. Benutzerdefinierte bearbeitet Teile, einschließlich der Mag Objektiv und 3-d-Objektiv kostet ca. $700 (der Preis hängt von der tatsächlichen Gebühren an verschiedenen Instituten). Typische kommerziell verfügbare integrierte Systeme für Einzelmolekül-Erkennung-basierte SR Mikroskopie mehr als 300.000 $ Kosten ~ 400.000 und sind nicht ohne weiteres zur SmFRET Messung, oder Epi-Imaging für eine vernünftige Sichtfeld ohne weißes Licht Quelle. So kann die hier vorgestellten Ansatz imaging-Funktionen mehrere Mikroskope zu einem deutlich reduzierten Preis entspricht erreichen.
Diese modulierte Mikroskopsystem kann auf Mikroskop Körpern unterschiedlicher Hersteller beruhen. Das 3-d-Objektiv kann potenziell an beliebiger Stelle in der Emission Pfad, einschließlich innerhalb des Emission Splitters, innerhalb des Körpers Mikroskop oder in verfügbaren Platz zwischen das Filterrad und der objektiven Nasensteg installiert werden. Jedoch wird der physische Speicherort der 3-d-Linse der Brennweite zur Erzielung der besten Astigmatismus Wirkung für SR 3D-Imaging bestimmen. Es wird empfohlen, mit einer 10 m Brennweite ab. Das Mag Objektiv ist im Wesentlichen ein Beam Expander in der Erregung-Pfad installiert. Wenn die Erregung Laser Luft gekoppelt sind (zB., ohne optische Faser), es ist trivial, um solch ein Expander in jedem Ort zu installieren, nachdem die Laserstrahlen kollimiert werden. Wenn die Erregung Laser fasergekoppelte sind, dann schauen Sie für zusätzliche Slots, zwei Objektive (eine konkave und eine konvexe) zu installieren. Zum Beispiel haben viele kommerzielle Beleuchtung Arme Slots für Neutral-Dichte-Filter. Zwei Linsen mit der Summe ihrer Brennweiten gleich dem Abstand zwischen den beiden Schlitzen zu finden. Dann können sie eingefügt werden, um als Mag Objektiv funktionieren. Alternativ kann eine Halterung für den Bereich Zwerchfell Schieberegler ein weiterer Ort, falls vorhanden. Aufbau der Mag Objektiv in einer herausnehmbaren Kassette hat den Vorteil, dass man sich die Erregung Laser um höhere Leistung zu erreichen, die für SR Bildgebung erforderlich sind, einfach durch Umlegen der Ausrichtung des Objektivs Mag.
In diesem Bericht haben wir flexible Wechsel zwischen drei verschiedenen bildgebenden Verfahren mit einem modulierten Mikroskop gezeigt. Diese Einrichtung kann für größere und modernere Anwendungen verwendet werden. Zum Beispiel die SR-Konfiguration eignet sich für Single-Partikel-tracking in lebenden Zellen auf Foto-schaltbare oder Photoactivatable fluoreszierendes Protein-Tags Biomoleküle von Interesse18,19. Die SmFRET-Konfiguration lässt sich in in Vivo Systeme20molekulare Interaktionen zu untersuchen. Die Emission Splitter-basierte Multi-Channel-Erkennung kombinierbar mit der SR-Konfiguration, Zweifarben-SR Bildgebung oder Single-Particle tracking gleichzeitig21durchzuführen.
Diese Einrichtung kann weiter ausgebaut werden, um mehr modulierten Komponenten zu ermöglichen. Beispielsweise kann eine weitere Schicht von Turm und Beleuchtung Fach Filter hinzugefügt werden, damit zusätzliche Anregung/Emission Pfade für zusätzliche Kanäle, wie man mit einem Infrarot (IR) Laser Imaging-Proben mit IR Farbstoffe beschriftet erstellt werden können. Darüber hinaus ermöglicht es die zusätzlichen bildgebenden Kanal, können IR-Laser verwendet werden, um die Bühne Drift in der SR-Bildgebung während imaging Erwerb oder bei der Post-Analyse zu korrigieren. Für Drift-Korrektur während der Bildgebung Akquisition wenn die Z-Drift-Korrektur-System nicht verfügbar vom Mikroskop Hersteller, ist kann ein alternatives System mit IR-Laser entweder Homebuilt14 oder von Drittfirmen erworben. Nach der Übernahme Drift Korrektur kann ein IR-Laser für die Verfolgung von Kugelmarker verwendet werden. 22
Einzelmolekül-Erkennung-basierte SR Mikroskopie erfordert zwei Arten von Software für die Datenerfassung und Datenanalyse. Für die Datenerfassung, auch eine einfache Homebuilt-Software, die Bilder durch die Kamera führt, während die Kontrolle der Laser ON/OFF Verhaltensweisen können zusammenarbeiten, um SR-Bilder zu erzeugen, es ist zwar möglich, manuell modulieren die 405 nm Laserleistung, z. B. durch Drehen ein Gradienten Neutral-Dichte-Filter vor dem Laser installiert. Diese Art der Durchführung des Experiments ist jedoch abhängig von der Experimentator subjektive Beurteilung der Dichte von blinken auf Flecken. So, auf diese Weise ist nicht objektiv und möglicherweise nicht geeignet für die Quantifizierung der SR Bilddaten verwendet werden. Der Datencode Akquisition verwendet hier schließt Spoterkennung / ein Zählung Algorithmus während der Datenerfassung ist im Gange, so dass automatische Modulation der 405 nm Laserleistung basierend auf die Dichte von blinken auf Flecken (Abbildung 6). Heute bieten einige Mikroskop Hersteller programmierbare imaging Module, sodass man diese nutzen oder Plugins aus öffentlich zugänglichen Quellen wie Micro-Manager suchen kann. Für die Datenanalyse ist es möglich, im Handel erhältlichen Analysemodule Mikroskop Hersteller verwenden oder suchen nach Plugins aus öffentlich zugänglichen Quellen wie ImageJ.
Zusammenfassend bietet das Set-up hier vorgestellten hohe Vielseitigkeit und einfaches Umschalten zwischen verschiedenen bildgebenden Konfigurationen zu einem reduzierten Preis und Raum. Diese Einrichtung ist relativ einfach, bis alle Forschungslabor in den biologischen Wissenschaften mit einem Bedürfnis nach Routine und verschiedenen bildgebenden Experimenten zu verabschieden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
J.f. räumt Unterstützung von Searle Scholars Program und der NIH Direktor neue Innovator Award. Die Autoren erkennen nützliche Anregungen aus Paul Selvins Labor (University of Illinois, Urbana-Champaign) für die Positionierung der 3-d-Objektiv.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
References
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
