Summary
כאן אנו מציגים מדריך מעשי של בניית מערכת משולבת מיקרוסקופ, אשר ממזג הדמיה epi-פלורסנט קונבנציונלי הדמיה המבוססת על זיהוי סופר-ברזולוציה מולקולה בודדת, גילוי מולקולה בודדת צבע רב, כולל מולקולה בודדת פלורסצנטיות תהודה העברת האנרגיה הדמיה, לתוך הגדרת אחד באופן יעיל.
Abstract
קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ הוא כלי רב עוצמה כדי לזהות מולקולות ביולוגיות בחיי עיר ולנטר את הדינמיקה ואת אינטראקציות בזמן אמת. בנוסף מיקרוסקופ אפינפרין קונבנציונלי-זריחה, פותחו טכניקות הדמיה שונות כדי להשיג את מטרותיה ניסיוני. כמה הטכניקות בשימוש נרחב כוללים קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת תהודה העברת אנרגיה (smFRET), אשר יכול לדווח על שינויים הסתגלותי ואינטראקציות מולקולרית עם רזולוציה אנגסטרום, המבוססת על זיהוי מולקולה בודדת סופר רזולוציה (SR) הדמיה, אשר יכול לשפר את הרזולוציה המרחבית כ עשר כדי twentyfold בהשוואה מיקרוסקופ עקיפה-מוגבלת. כאן אנו מציגים מעוצבת ללקוח משולב מערכת, אשר ממזג שיטות הדמיה מרובות במיקרוסקופ אחד, כולל הדמיה epi-פלורסנט קונבנציונלי, יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR הדמיה של צבע רב גילוי מולקולה בודדת, כולל הדמיה smFRET. שיטות הדמיה שונות ניתן להשיג בקלות, reproducibly על ידי החלפת רכיבים אופטיים. זה קל לאמץ על ידי כל מעבדה למחקר במדעי הביולוגיה עם צורך השגרה וניסויים הדמיה מגוונות עלות מופחתת וחלל ביחס בניין נפרד מיקרוסקופים לצורכי הפרט.
Introduction
קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופים כלים חשובים למחקר במדעי הביולוגיה המודרנית, הדמיה פלורסנט מתבצע באופן שגרתי על מעבדות ביולוגיה רבות. על-ידי תיוג מולקולות של עניין עם fluorophores, אנו יכולים ישירות לדמיין אותם תחת המיקרוסקופ, לתעד את השינויים תלויי-זמן לוקליזציה, קונפורמציה, אינטראקציה, ואת מכלול המדינה vivo בתוך או במבחנה. קרינה פלואורסצנטית קונבנציונאלי מיקרוסקופים יש רזולוציה מרחבית עקיפה-מוגבלת, אשר ~ 200-300 ננומטר בכיוון לרוחב ו ~ 500-700 nm, הכיוון צירית1,2, והם, לכן, מוגבל לדימות-שים את הכסף בתיק של סולם ננומטר-כדי-מיקרו. על מנת לחשוף פרטים עדינה הרכבה מולקולרי או הארגון, פותחו microscopies SR שונים שיכולים לשבור את מגבלת עקיפה. אסטרטגיות כדי להשיג SR כוללים אפקטים אופטיים ליניארי, כגון פליטה מאולצת דלדול (STED) מיקרוסקופיה3,4 , תאורה מובנית מיקרוסקופ (SIM)5,6, 7, זיהוי סטוכסטי של מולקולות יחיד, כגון שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ (סערה)8 ו photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופ (דקל)9, שילוב של שניהם, כגון MINFLUX10. בין אלה microscopies SR, יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR מיקרוסקופים ניתן לשנות בקלות יחסית של מלכודת מיקרוסקופ מולקולה בודדת. עם הפעלת החוזרות על עצמן, הדמיה של חלבונים פלורסנט photoactivatable (FPs) או צבעי תמונה-להחלפה מתויגים על מולקולות של עניין, רזולוציה מרחבית יכולים להגיע nm 10-2011. כדי לקבל מידע על אינטראקציות מולקולרית הסתגלותי נדרש דינאמיקה של רזולוציה בזמן אמת, אנגסטרום-כדי-ננומטר. 12,smFRET13 היא גישה אחת כדי להשיג החלטה זו. באופן כללי, בהתאם השאלות הביולוגי של עניין, נדרשים בשיטות הדמיה עם רזולוציות שונות מרחבית.
בדרך כלל, עבור כל סוג של הדמיה, נדרשת תצורה אופטי מסוים עירור ו/או פליטה. למשל, באחת השיטות הנפוצות ביותר תאורה לגילוי מולקולה בודדת היא באמצעות החזרה גמורה (טיר), שבו זווית עירור ספציפי צריך להיות מושגת דרך פריזמה או דרך העדשה אובייקטיבי. עבור זיהוי smFRET, פליטת התורם והן מקבל צבע צריך להיות מופרדים במרחב ו בוים על חלקים שונים האלקטרון-הכפלת, תשלום מצמידים מכשיר (EMCCD), אשר יכולה להיות מושגת עם סדרה של מראות, מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר ממוקם בנתיב פליטה. עבור תלת-ממדיים (3-D) SR הדמיה, רכיב אופטי, כגון עדשה גלילית14, יש צורך לגרום אפקט אסטיגמציה בנתיב פליטה. לכן, homebuilt או זמינים מסחרית מיקרוסקופים משולב, בדרך כלל, באופן פונקציונלי התמחה עבור כל סוג של הדמיה שיטה, אינם גמישים כדי לעבור בין שיטות הדמיה שונות על הסידור זהה. כאן אנו מציגים מערכת היברידית חסכונית, המספקת מתגים מתכווננת, לשחזור בין שלוש שיטות הדמיה שונות: הדמיה epi-פלורסנט קונבנציונלי עם רזולוציה מוגבלת עקיפה, יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR הדמיה, זיהוי חד-מולקולה צבע רב, כולל smFRET הדמיה (איור 1 א'). באופן ספציפי, הסידור המובאת כאן מכיל סיבים מצמידים לייזרים קלט של צבע רב עירור, זרוע תאורה מסחרי בנתיב עירור, אשר מאפשר מתוכנת השליטה הזווית עירור, כדי לעבור בין epi-מצב ומצב טיר. בנתיב פליטה, קלטת עדשה גלילית homebuilt נשלף ממוקם בתוך הגוף מיקרוסקופ לדימות SR תלת-ממדי ולאחר במפצל קרן מסחרי ממוקמת לפני מצלמה EMCCD שיכול להפוך לזמין באופן סלקטיבי כדי לזהות ערוצים מרובים פליטה בעת ובעונה אחת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מיקרוסקופ ועיצוב ההרכבה
-
עירור נתיב
הערה: הנתיב עירור כולל לייזרים התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC), הגוף מיקרוסקופ, ורכיבים זרוע תאורה שלה.- הכן טבלה בודדים רטט אופטי. לדוגמה, טבלה השיכוך מבנית של 48 x 96 x 12'' נותן די שטח פנוי עבור כל הרכיבים.
הערה: לבנות את הסידור בחדר עם בקרת טמפרטורה (למשל, נמצא 21.4 ± 0.55 ° C). יציבות טמפרטורה חיוני לשמירה על היישור אופטי. - התקן גוף מיקרוסקופ הינו מצויד עם זרוע תאורה עבור חיבור סיב אופטי, של 100 X שמן-טבילה TIRF המטרה עדשות ורכיבים DIC.
- מקום 4 ראשים לייזר (647 nm, 561 nm, 488 ננומטר, 405 ננומטר, כיתרו ב איור 1B) שלהם חום כיורים על השולחן האופטי, ודא קרני לייזר הנפלט שיש באותו גובה ובאותו הם קצר ככל האפשר להבטיח יציבות טובה (למשל 3'').
הערה: אם ראש לייזר יושב בגובה קצר יותר מאשר אחרים לייזרים, לשים צלחת אלומיניום בעובי נאותה מתחתיו. תמיד להבטיח מקסימום קשר בין מפזרי חום את טבלת אופטי עבור פליטת חום הטוב ביותר (איור 1B). הלייזרים צריך להיות חזק מספיק עבור SR הדמיה. עיין בטבלה של חומרים. מומלץ לעשות לייזר מסננים לנקות לפני דיודות לייזר. - להתקין כרטיס רכישה נתונים דרך ממשק רכיבים היקפיים (PCI) interconnect תחנת עבודה וחבר לייזרים עם הכרטיס הזה. שליטה ON/OFF התנהגויות של הלייזרים לפי ההיגיון טרנזיסטור-טרנזיסטור (TTL) פלט, והתאמה שלהם כוח, פלט אנלוגי של הקלף (איור 1C). התקן של מיקרוסקופיית נאות imaging התוכנה (מסחרי או homebuilt) כדי לשלוט כרטיס רכישה הנתונים, כמו גם הגוף מיקרוסקופ.
- לטעון את המראות ואת מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר (590, 525 ו- 470 זמן לעבור מסננים) על סוסיהם בהתאמה. השתמש בטעינות יציב מאוד מראה על המראות. השתמש מפצלי מעגלית עם שמירה על טבעות כדי להימנע כל כיפוף מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר (איור 1D).
- מקם את המראות ואת מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר על השולחן האופטי כדי לשלב את קרני לייזר (איור 1B). כדי להשיג את היישור היציב ביותר, להפוך את כל הסידור כמה קומפקטי ככל האפשר, השתמש בעמודי אופטי 1''-עובי. לסדר את הלייזרים כך לייזרים אורך גל קצר יותר קרובים יותר צימוד סיבים אופטיים (איור 1B) מאז קצר באורך הגל אורות להתפזר יותר באוויר.
- לשלב קרני לייזר סיב אופטי במצב יחיד. לשם כך, לבנות מצמד סיבים בתוך מערכת כלוב באמצעות השלבים הבאים:
- הר צלחת מתאם סיבים ב הר תרגום ציר z (איור 1E, החלונית הימנית).
- הר של עדשה כפיל אכרומטי (אורך מוקד = 7.5 מ מ) לתוך צלחת הכלוב (איור 1E, הפאנל השני מצד השמאל).
- לחבר את שני החלקים מעל באמצעות מוטות הארכה כדי ליצור כלוב. לטעון את הכלוב על השולחן אופטי עם הרכבה מרובעים על 1''-עבה ההצבות אופטי (איור 1E, בחלונית האמצעית).
- יישר את הלייזר 647-nm קודם עם סיב אופטי במצב יחיד (FC/APC סוף מחבר).
הערה: יישור קשה באמצעות סיבים אופטיים רב במצב לפני באמצעות סיבים אופטיים במצב יחיד עשוי לסייע בתהליך יישור. להתאים את הזוויות של מראות, מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר (איור 1D, על ידי התאמת ידיות), כמו גם המרחק בין העדשה כפיל אכרומטי לצלחת מתאם סיבים (איור 1E, על-ידי התאמת הר תרגום ציר z) כדי לזכות לייזר המרבי פלט חשמל באמצעות הסיבים. - ברגע היישור של הלייזר הראשון נעשה, באופן זמני להתקין זוג קשתיות העין, ליישר את שאר לייזרים אחד (איור 1F). בדקו את יעילות יישור עם מד הכוח.
- השאר איריס אחד בחזית הלוח מתאם לצמצם ההשתקפויות של הלייזרים.
הערה: חזק בחזרה השתקפויות. המצמצמים את אורך החיים של מקורות לייזר. לחלופין, ניתן להתקין isolator אופטי לפני כל ראש לייזר כדי להסיר לחלוטין את ההשתקפויות.
- חבר את הקצה השני של סיבים אופטיים הזרוע תאורה של המיקרוסקופ (איור 1 H).
- עיצוב ולהתקין "הגדלה העדשה (mag עדשה)" את השלבים הבאים:
הערה: הלייזרים ניתן להשתמש עבור הדמיה epi-זריחה של המדגם, אך הגודל קרן צרה של כל לייזר מגביל את השטח של המדגם לאזור מספר פעמים קטן יותר מאשר הגודל הממשי של חיישן המצלמה המתאימה, במיוחד עבור החדשים מצלמות (עם 18.8 מ מ אורך אלכסון לעומת אורך 11.6 מ מ המקובלת). לפיכך, רצוי להרחיב את הקרן להשיג תאורה גדול ושטוח של המדגם.- עיצוב העדשה mag, אשר יכול להתאים לתוך הזרוע תאורה (איור 1 H).
הערה: העיצוב של העדשה mag תלוי איפה זה יותקן. איור 1 H מראה דוגמה של ההתקנה בזרוע תאורה, אבל זה יכול להיות מותקן בכל מקום. אחרי הקורות לייזר הן מקבילות (ראה דיון). עיצוב זה עם תכנון בעזרת מחשב, תוכנות שרטוט. - במקום שתי עדשות אכרומטית, אחת קעורה (אורך מוקד = f1), ואחת קמורה (אורך מוקד = f2) ב- mag תוצרת בית עדשה המחזיק (איור 2 א ו- 2 C), עם מרחק שווה לסכום של אורכי מוקד שלהם, f1 + f2 = (--25) + 50 = 25 מ מ (איור 2B).
הערה: כאשר בחירה זו של אורכי מוקד העדשה מאג מתרחבת הקרן ב- f2/ | f1| = קפלי 2. העדשה mag מספק רב-תכליתיות. שניתן יהיה להסיר כדי לחדש את תאורה רגיל מבלי להרחיב את הקורות (איור דו-ממדי) או הוספת בכיוון ההפוך למקד את קרן הלייזר כדי להשיג של העוצמה עירור חזק יותר.
- עיצוב העדשה mag, אשר יכול להתאים לתוך הזרוע תאורה (איור 1 H).
- הכן טבלה בודדים רטט אופטי. לדוגמה, טבלה השיכוך מבנית של 48 x 96 x 12'' נותן די שטח פנוי עבור כל הרכיבים.
2. פליטת נתיב
הערה: הנתיב פליטה מורכב של עדשה גלילית נשלף, גלגל מסנן מכשול, ספליטר פליטה של מצלמה EMCCD (איור 1 ג'י). כדי להשיג את הנקודה הטובה ביותר להפיץ את הפונקציה (PSF) של מולקולות יחיד, המנסרה DIC שם מן העדשה אובייקטיבי.
- מותאמת אישית-עיצוב בקלטת עדשה גלילית (עדשה תלת-ממדי), אשר יכול להשתלב במנתח DIC ידנית להוסיף חריץ בגוף מיקרוסקופ (איור 3C).
הערה: עיצוב זה לא מתפשרים במנתח DIC מאז בלוק מנתח יכול להיות מוכנס על הצריח מסנן. - הכנס את עדשת תלת-ממדי של 10 מ' אורך מוקד בקלטת והוספתו לתוך הנתיב קרן פליטה כדי ליצור את אפקט אסטיגמציה הדרושה עבור חילוץ הקואורדינטה z של כל מולקולה בודדת14.
הערה: לחלופין, בקלטת עדשת תלת-ממדי ניתן להניח בתוך או מחוץ הנתיב פליטה (איור 3C). - להתקין מפצל קרן ודיקרואיק זוהר הלהקה רב על הצריח מסנן שבתוך הגוף מיקרוסקופ.
- להתקין מסננים פליטה.
הערה: המסננים פליטה נבחרים בהתאם fluorophores מועדף. בהתאם מודול ההדמיה, מסנני פליטה ממוקמים במקומות שונים משמשים כמפורט להלן:- צבע רב רציפים epi-קרינה פלואורסצנטית לדימות או SR הדמיה, להשתמש במסנני פליטה להציב בגלגל מסנן מכשול מחובר ליד הגופה מיקרוסקופ כדי למזער את הרטט בגוף מיקרוסקופ במהלך ערוץ הבורר (איור 1 ג'י).
- לצורך זיהוי צבע רב בו זמנית (למשל, smFRET ניסויים), במקום אחר מסנן הממוקם על הפיצול פליטה (הסימון שלב 4 לפרטים).
הערה: בדרך כלל, למפצל פליטה מסחרי יש שני מצבי להחלפה (קרי, "מאורסים" או "לעקוף" מצבי). כדי להפריד פליטת האור chromatically עבור צבע רב סימולטני הדמיה (מצב "מאורסים"), משמש קוביה מסנן מחזיק שני מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר ומסננים פליטה שלוש ("טריפל קוביה," דמות 4C ו- 4 D). חריץ ריק בגלגל מסנן מכשול משמש בשילוב עם הקוביה משולשת. מצד שני, להדמיית צבע רב רציפים, הקוביה טריפל מוחלף על ידי קוביה לו מראה בתוך ("עוקף קוביה," דמות 4A ו- 4 D).
- להתקין את המצלמה EMCCD כמו החלק האחרון של השביל פליטה. לנצל את החיבור USB-PCI להשגת קצב מהיר.
הערה: מצלמה EMCCD מומלצת גילוי מולקולה בודדת הרגישים ביותר, אך מצלמת sCMOS מתקדם יכול להיות חלופה.
3. עקיפה מוגבל הדמיה עם אפי-עירור
- להתאים את הזווית מקריים של לייזרים עירור למצב epi-בזרוע תאורה.
- נתק את העדשה תלת-ממדי אם מאורסת (איור 3C, לוח נכון).
- להוסיף לקוביה מעקף המפצל פליטה (איור 4A ו- 4E, החלונית התחתונה).
- (אופציונלי) הכנס את העדשה mag לאזור והורחבו תאורה (איור דו-ממדי, פאנל שמאלי).
הערה: עם השימוש עדשה מג 100 X עדשה המטרה שמן-טבילה, בערך 91 x 91 מיקרומטר2 יכול להיות מואר בצורה שווה, ומבטל את הצורך להשתמש מקור אור לבן והקוביות סינון מרובים. - השתמש של מיקרוסקופיית imaging התוכנה לקחת רב ערוצית, ו/או Z-מחסנית, ו/או תמונות בצילום מואץ.
הערה: יש תוכניות מרובות זמינים עבור הדמיה במיקרוסקופ, לא רק מיצרנים מיקרוסקופ, אלא גם מחברות צד שלישי או מפתחי קוד פתוח.
4. רב ערוצית מולקולה בודדת הדמיה כולל smFRET
הערה: להזיז למשרת "ריק" במערכת סינון מחסום, כך כל הפליטה לכל אורך הגל יכול להגיע עד הסט השני של ודיקרואיק זוהר/מסננים מפצלי הקרן ב המפצל פליטה.
- כדי להגדיר את צבע רב גילוי מולקולה בודדת של מולקולות השטח. מרותק למיטה15 באמצעות עירור TIRF, כולל מדידה smFRET, להתאים את הזווית מקריים של לייזרים עירור לזווית TIRF. נתק את העדשה mag, עדשת תלת-ממדי.
- לעסוק את מצב שלושה ערוצים המפצל פליטה (איור 1 ג'י) את השלבים הבאים:
- להחליף לקוביה מעקף עם קוביה"כיול" זה מאפשר לאור לעבור דרך כל הערוצים (איור 4B ו- 4E).
- תדליק את המצלמה תחת DIC (כלומר, לא מסנן פליטה בגלגל מסנן מכשול) ולהתאים את הצמצם של המפצל פליטה עד שלושה ערוצים נפרדים לחלוטין יופיעו על המסך.
הערה: לבצע שלב זה עם האור בחדר מואר, שתדמיין לעצמך את כל הערוצים. - הפעל את ידיות שליטה אנכיים/אופקיים התאמת המפצל פליטה ויישר בערך שלושת הערוצים (איור 4E ו- 4F).
- כבה את המצלמה והחלף את הקוביה כיול קוביה טריפל (איור 4C ו- 4E).
- במקום מדגם עם חרוזים רב-ערוצי 100 ננומטר על גבי ה-100 X עדשה המטרה ונוחות על המדגם.
- הפעל את המצלמה ואת הלייזר 488 ננומטר, תקריב על אחד של חרוזים בהיר, דק ליישר את שלושת הערוצים על-ידי הפעלת את התאמת ידיות שליטה שוב (איור 4E ו- 4g).
הערה: 100-nm חרוזים רב-ערוצי פולטים אורכי גל שונים של אור על עירור 488 ננומטר, המאפשר את היישור שלושה ערוצים.
- להפעיל את המצלמה, לייזרים, מיקוד, למצוא משרה טובה עם צפיפות מקום סביר. להתאים את כוח לייזר וזמן חשיפה כדי להשיג רמות מקובל אות לרעש ו- photobleaching. השתמש מיקרוסקופיה של תוכנות ליצירת תמונות תמונות בצילום מואץ.
5. SR הדמיה
הערה: זהו יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR מיקרוסקופ.
- כדי להגדיר את SR הדמיה, עדשת תלת-ממדי האצוהו הסנכה העדשה מג. להגדיר את זמן החשיפה של המצלמה הערוצים לייזר מתאים (למשל, ms 5-60). לקבוע ולהגדיר באופן ידני את זווית מקריים של לייזרים עירור אופטימלית להיות הזווית TIRF.
- מקם את הדגימה SR הדמיה מאגר16. לאפשר מאגר המשמש equilibrate לפחות 10 דקות לפני הדמיה.
הערה: מאגר הדמיה SR יפוג לאחר בערך 1 h, כך שעליך SR חדש הדמיה מאגר בהתאם. - קח תמונה של DIC לפני SR הדמיה. כדי למצוא את הגובה אובייקטיבית המתאים עבור SR, אשר מייעל את האפקט אסטיגמציה, להשתמש DIC הדמיה כדי למצוא את המטוס האמצעי של התאים. לזהות את המטוס על-ידי הגובה שבו תאי המעבר מ- "אור" תמונות "כהה" ומופיעים להפוך שקוף (איור 5A, 5B, ו- 5 C). ברגע שהמטוס מוקד הרצוי נקבע, לעסוק z-להיסחף תיקון המערכת (איור 1 א').
- התנהגות SR הדמיה. לשנות את הכוח 405 ננומטר לייזר כדי לשמור על צפיפות סבירה של כתמים 'מהבהב-על'.
הערה: אמנם זה ניתן לשנות באופן ידני את הלייזר 405 ננומטר, זה יותר נוח להפעיל קוד רכישת נתונים מתוכנת כדי לשמור על הצפיפות של כתמים "מהבהב-על". הנה דוגמה של איך זה מתבצע באופן אוטומטי. קוד המקור זמין על פי בקשה (איור 6).- להתחיל הרכישה הדמיה עם עוצמת הלייזר סגול2 W/ס מ 0.
- לספור את מספר המקומות מהבהב על תוך תקופה מסוימת.
- לווסת את עוצמת הלייזר סגול כך מספר מהבהב על כתמים נשמרת לעיל על-ידי המשתמש "הספירה סף" בתוך שדה הראייה. להגדיל את עוצמת הלייזר סגול כאשר מספר כתמים מהבהב על טיפות מתחת לסף ספירה.
- לסיים את הרכישה כאשר מספר כתמים מהבהב על טיפות מתחת לסף ספירה באמצעות כוח מרבי לייזר סגול.
הערה: המקסימום ניתן להגדיר באופן שונה בהתאם הבהירות דגימה, אך גבוה מ- W/cm 1302. בהתאם המטרה בפועל של ההדמיה SR, קוד זה רכישה אוטומטית יופרו באופן ידני בכל עת הרצוי.
- בדוק את התנהגות מהבהב ואת PSFs נקודות זמן קצר לאחר תחילת הרכישה.
הערה: אם ההתנהגות מהבהב אינה אידיאלית, לשנות את זווית מקריים של לייזרים עירור או להחליף את המאגר הדמיה. מצפה דגימה של "אנכי", "אופקי" ו "diamond" צורות של PSF, המייצג fluorophores מלמטה, מעל, ובתוך המטוס מוקד, בהתאמה (איור 5D). אם כתמים מרבית מציגות PSFs לאנכי או אופקי, ואז המטוס מוקד מבוטל מהמרכז של התאים, לסיים את הניסוי, להתאים את המישור מוקד שוב. נוכחות של בועת האוויר מהשמן טבילה או גורמים מקומיים אחרים יכולים להשפיע על האיכות של PSFs, ולכן יהיה צורך להחליף את השמן או שינוי אזור הדמיה שונות המדגם. - לניתוח נתונים, להשתמש בקוד פתוח (ב NIH ImageJ תוספים) או קודים זמינים מסחרית לשם זיהוי centroids של כל מקום בכל מסגרת הדמיה לחלץ ערכים-z של כל נקודה מ- x ו- y-ברוחב14.
הערה: בדו ח זה, קוד מקור שפותחה במקור באחת המוקדם יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR8 שונה עבור זיהוי תלת-ממדי16 , היה בשימוש. - במקרה של שני צבעים הדמיה, תמונה של fluorophore עם הגל ארוך יותר עירור, ואחריו עם אורך גל קצר יותר עירור. להפעיל את הקוד רכישה אוטומטית באופן דומה לזו המתוארת בשלב 5.4, אבל עם לייזר הדמיה שונות.
הערה: אברציה כרומטית אמור להיפתר בין תמונות שונות fluorophores (למשל, צבע אדום, צבע צהוב, ירוק). להלן השלבים.- לשתק מספר החרוזים רב-ערוצי 100-nm coverslip זכוכית, הימנעות להרכיב אשכולות.
- קח תמונות של אותם בערוצים עירור שונות.
- תמצית שלהם (X, Y, Z) נקודות ציון על ידי תוכנה (שלב 5.6).
- מגרש ΔXאני = X1i - X2i וΔYi = Y1i - Y2i (על כך חרוזים שונים, ו 1 ו-2 הם ערוצי צבע שונה) בנפרד ולהתאים אותם עם פונקציות נאותה. שמור את הפונקציות.
הערה: פונקציה קווית מספיקים ברוב המקרים. ברגע פונקציות אלה נקבעים, מדידה זו אין צורך לחזור בכל פעם הדמיה. - בבפועל שני צבעים SR ההדמיה של מדגם של עניין, להחיל בפונקציות על הנכון (X, Y) אברציה כרומטית. עבור z-directional אברציה כרומטית, לנהל אותה על ידי קבלת ΔZ = Z1 - Z2 חרוזים רב-ערוצי או דגימות רב-ערוצי הייחוס המוכרת נזרע יחד עם הדוגמה של עניין.
הערה: בניגוד (X, Y) אברציה כרומטית, אברציה כרומטית z-directional אינו טוב-לשחזור ניסוי, בעיקר בשל תחזוקה המוקד z-directional לא שלם על ערוץ מיתוג. לכן, מומלץ לבצע את התיקון בכל פעם. ΔZ = Z1 - Z2 הוא בעיקר תלוי (X, Y), אז רק כמה חרוזים או דוגמיות יהיה מספיק לכל כל אזור הדגימה של עניין. מגרש בנוי הסופי שני צבעים SR תמונות תוכנה להדמיה תלת-ממדי וסמנו ΔZ באופן ידני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מיקרוסקופ זה מאפשר גמישות לשחזור מעבר בין שיטות הדמיה שונות. הנה אנחנו מראים תמונות לדוגמה הנאספים יחד עם כל מודול ההדמיה.
איור 5D מדגים את PSF של המולקולה מהבהב על במהלך רכישת SR. אלפי תמונות כאלה משוחזרים כדי ליצור את התמונה הסופית SR (איור 5E). איור 5E מראה את אותו RNAs רגולטוריות חיידקי כפי שמוצג בתמונה epi-זריחה איור 7 א. איור 7 מראה הדימויים נציג epi-זריחה של RNA רגולטוריות קטנים בתאים Escherichia coli ו של mRNA בתאים בתרבית של U2OS. RNAs הן מסומנות עם מתויג fluorophore oligo דנ א דרך בחיי עיר הכלאה17. איור 8 מראה את המדידה smFRET הנציגה של מולקולות RNA מקופל המסומנת התורם צבע (צבען ירוק) מקבל וצבע (צבע אדום). מתחמי ותשמרו על השקופית במיקרוסקופ הינם נרגש TIRF תאורה. מסלולים עוצמת קרינה פלואורסצנטית יכול להיות מופק מולקולות יחיד בודדים, יצירת סריג יעילות כפונקציה של הזמן.
איור 1: העיצוב של הסידור מיקרוסקופ. (א) בלוח זה הופעות תרשים של הסידור. M = מראה, DBS = קרן ודיקרואיק זוהר מפצל, LCF = לייזר לנקות מסנן, אני איריס, L = = עדשה, AP = מתאם צלחת, ZTM = ציר z translational הר, של = סיב אופטי, אוקיאניה = סיבים אופטיים מצמד, קלרנית = עדשה גלילית, TL = צינור עדשה, EF = פליטת את המסנן, Obj = המטרה עדשה, ו SM = מנוע צעד. Z-להיסחף תיקון המערכת נעה המנוע צעד על nosepiece של העדשה המטרה בכיוון הפוך לכיוון z-והרשע, אשר מחושב ע י האות אינפרה-אדום (IR) שנוצר על ידי LED משלו והוא זוהה על ידי גלאי משלו. (B) לוח זה מראה את מכלול עירור לייזר. לייזרים ארבע משולבים באמצעות מראות, מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר, לאחר מכן מופנים של סיב אופטי דרך עדשת המיקוד, צלחת מתאם יושב על הר translational (בחלק התחתון של התמונה). (ג) לוח זה מראה את אפנון לייזר. שני הכידון ניל-Concelman (BNC) כבלים מחוברים לכל אחד הלייזר (הראש או הבקר, בהתאם ליצרן ה) TTL, אפנון אנלוגי (החלונית הימנית). BNC כבלים משולבים לתוך כבל יחיד (לוח האמצעי) אשר מחובר לכרטיס רכישת נתונים בתחנת עבודה (החלונית הימנית) עבור בקרת מחשב. (ד) לוח זה מראה את מראה ו ספליטר ודיקרואיק זוהר קרן טוען. (E) בבניין מצמד סיבים מערכת הכלוב. צלחת מתאם סיבים (AP) נטענה הר תרגום ציר z (ZTM) כך המרחק שלו על העדשה זוגי אכרומטי (L1, מבט צד המוצג) יכול להיות מאופנן. AP ZTM יש התאמת הליכי משנה, בדיוק כמו L1, את הצלחת הכלוב. (F) של זוג קשתיות (מקיף) מותקנים במהלך ההליך היישור עבור לייזרים מרובים. הם משמשים כדי להבטיח כי הלייזר 647-nm (החלונית הימנית), 561-ננומטר לייזר (לוח נכון) לעבור באותו הנתיב. חלק הנתיב פליטה חלקית (G) A מוצג. מחוץ לגוף מיקרוסקופ, ההגה מסנן פליטה פליטה המפצל, המצלמה EMCCD מותקנים הסדר. (H) לוח זה מראה את מכלול זרוע תאורה. העדשה mag מוכנס לתוך הזרוע תאורה. קרני לייזר עירור נשלחים זרוע תאורה באמצעות סיבים אופטיים, סיבים אופטיים מצמד (בצד השמאלי של התמונה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: העדשה mag. (א) לוח זה מראה orthographic תחזיות של בעל עדשות דיור מגדלת קרני לייזר (יחידה: מ מ). עיצוב זה נועד להתאים לתוך הזרוע תאורה. (B) לוח זה מציג ציור פנימי של החור המחזיק בו שתי עדשות להיכנס. L1 עדשה קעורה, L2 הוא עדשה קמורה, המרחק ביניהם הוא הסכום של אורכי מוקד שלהם. (ג) שזו תמונה של העדשה מג. (ד) העדשה מג יכול להיות מוכנס בזרוע תאורה כדי להרחיב או למקד את קרני לייזר (משמאל) או ניתן להסיר כדי לשמור את קרני לייזר ללא שינוי (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: עדשת תלת-ממדי. (א) לוח זה מראה orthographic תחזיות של בעל שיש חור עגול ריק עבור מצב מעקף חור מלבני עבור החזקת העדשה גלילי (יחידה: מ מ). עיצוב זה נועד להיות בכושר כדי במחוון מנתח DIC בגוף מיקרוסקופ. (B) שזו תמונה של העדשה תלת-ממדי. (ג) גלילי עדשה יכול להיות מעורב בנתיב קרן פליטה כדי לגרום PSFs עם אסטיגמציה (משמאל) או יכול להיות מנותק עבור מצב העוקף, לשמור את PSFs שלמות (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: יישור רב ערוצית של המפצל פליטה. ערכות של אופטיקה, נתיב האור מוצגים המפצל פליטה עם (A) קוביה העוקף, (B), כיול קוביה ו (ג) משולש קוביית. M = מראה. לקוביה מעקף יש מראה בתוך (M5) והוא אמור לשמש עם מסנן פליטה (EF) בגלגל מסנן מכשול. הקוביה כיול יש מפצלי הקרן (BS) המאפשרים אורות לעבור דרך כל הערוצים. הקוביה משולשת יש קרן ודיקרואיק זוהר שני מפצלי (DBS), כמו גם שלושה מסננים פליטה. (ד) אלו תמונות של שלוש קוביות. (E) הפנימי של המפצל פליטה מוצג ללא קוביה (החלונית העליונה) ועם קוביה (החלונית התחתונה) משחילים פנימה. M3 מאחורי M4, לא נתפס בתמונה. ידיות שליטה על המראות הן על המפצל פליטה (החלונית העליונה). (F) לוח זה מציג את ערוץ יישור באמצעות הקוביה כיול תחת DIC. (G) לוח זה מראה על יישור בסדר של ירוק (החלונית העליונה), אדום (לוח האמצעי) ערוצים באמצעות קוביה טריפל ושרשרות רב-ערוצי 100 ננומטר. תמונת הממוזג של בין שני הערוצים מוצג גם (פאנל התחתונה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: ייבוא תמונות נציג SR- הפאנלים הצג נציג DIC תמונה (א) להלן, (B)-, או (ג) מעל המטוס המרכזי של התאים. (ד) לוח זה מציג דוגמה הביטחון של fluorophores מהבהב-. עיגול כתום המקיף של PSF. "אנכי" העיגול הירוק המקיף של PSF. "אופקי" העיגול הכחול המקיף PSF בצורת יהלום, המייצג fluorophores-מטוס ממוקד. (E) לוח זה מציג שנציג שיחזר תמונה SR. ה-RNA רגולטוריות קטן מסומן עם פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה עם צבע אדום. גבולות לבן לסמן את הקצוות של התאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: רכישת נתונים מתוכנת קוד עבור הדמיה SR- מודול זה רכישת לתכנות, שונים של ביצוע פקודות ופונקציות הבקרה מיקרוסקופ מפורטים בחלונית השמאלית, ניתן לבחור כדי ליצור קוד הרכישה מתוכנתים. הפקודות מתבצעות ברצף מלמעלה עד למטה. מסך זה מציג דוגמה שם מוגדרים מראש מספר מסוים של רכישות הדמיה iterated נערכים עד הרכישה נשקפת מספר נקודות שלוש מסגרות תמונה רציפה מחושב. אם המספר הממוצע של הכתמים מעל הסף (כהגדרתו של 50% מספר התאים בתחום ההדמיה חיידקי), רכישת התמונה ממשיכה אותה לולאה. אם מתחת לסף, לאחר מכן רכישת התמונה ממשיך בתוך המעגל הבא שבו עוצמת הלייזר סגול חזק משמש (לחתוך בתחתית המסך). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: נציג epi-זריחה תמונות. (א) לוח זה מראה RNA רגולטוריות קטנים בתאים e. coli . (B) לוח זה מראה של mRNA בתאים בתרבית של U2OS. RNAs מסומנות עם צבע אדום, צבע כחול באמצעות קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8: דוגמה של הדמיה smFRET. (א) דגימות היו נרגשים עם לייזר 561-nm. (B) פליטת צבעים ירוק ואדום שנאספו בו זמנית, כמוצג ירוק (מימין), כתמים אדומים (משמאל), בהתאמה. (ג) לוח זה מראה הנציגה פלורסצנטיות בעוצמה נגד הזמן מסלולים של צבע ירוק (ירוק), אדום צבע (אדום) של מולקולה אחת. (ד) לוח זה מראה את סריג יעילות לעומת המסלול הזמן (קו כחול מלא) מחושבת אנימקבל/ (אניתורם + אנימקבל) של מולקולה אחת של המדגם. המעקב סריג מצוידים מודל מרקוב חבוי (קו מקווקו אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת מיקרוסקופ היברידית זו מבטלת את הצורך לרכוש מיקרוסקופים מרובים. הסכום הכולל עבור כל החלקים, כולל שולחן אופטי, שולחן העבודה ההתקנה, התוכנה, תחנת עבודה, הוא בערך דולר ועל 230,000 שמו. חלקים במכונה מותאם אישית, כולל עדשה mag, עדשת תלת-ממדי, עולה בסביבות 700 דולר (המחיר תלוי האישום בפועל במוסדות שונים). טיפוסי זמין מסחרית מערכות משולבות עבור יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR מיקרוסקופ עולה למעלה מ 300,000 דולר ~ 400,000 והם לא בקלות ניתן למדידה smFRET או אפינפרין-הדמיה עבור שדה מבט סבירה, ללא אור לבן מקור. לפיכך, הגישה המובאות כאן ניתן להשיג יכולות הדמיה מקביל מיקרוסקופים מרובות בעלות מופחתת באופן משמעותי.
מערכת מיקרוסקופ מאופנן זו יכולה להתבסס על מיקרוסקופ גופות של יצרנים שונים. עדשת תלת-ממדי פוטנציאלי יכול להיות מותקן בכל תנוחה בנתיב פליטה, כולל בתוך המפצל פליטה, בתוך הגוף מיקרוסקופ, או שטח פנוי בין ההגה מסנן את nosepiece אובייקטיבי. עם זאת, המיקום הפיזי של העדשה תלת-ממדי יקבע את אורך המוקד שלה להשגת האפקט אסטיגמציה הטוב ביותר עבור הדמיה SR תלת-ממדי. אנו ממליצים להתחיל עם אורך מוקד 10-m. העדשה מג היא במהותה במותחן קרן מותקן בנתיב עירור. אם הלייזרים עירור מצמידים אוויר (כלומר., ללא סיבים אופטיים), זה לא חשוב להתקין כזה מרחיב במקום כלשהו לאחר קרני לייזר הן ממוקדת. אם הלייזרים עירור מצמידים סיבים, ואז לחפש משבצות נוספות להתקין שתי עדשות (קעורה אחד ואת השני קמורה). לדוגמה, זרועות תאורה מסחריים רבים יש חריצים עבור מסנני דחיסות נייטרלית. למצוא שתי עדשות עם הסכום של אורכי מוקד שלהם שווה המרחק בין שני החריצים. לאחר מכן, הם יכול להיות מוכנס לתפקד כמו עדשה מג. לחלופין, הטעינה עבור המחוון הסרעפת השדה יכול להיות במקום אחר, אם זמין. מבנה העדשה מג ב קלטת נשלף יש יתרון נוסף של דבר שמאפשר למקד את הלייזרים עירור כדי להשיג כוח עליון, אשר עשוי להיות נחוץ עבור הדמיה SR, פשוט על-ידי היפוך הכיוון של העדשה מג.
בדו ח זה, הפגנו מעבר גמיש בין שלוש טכניקות הדמיה שונים באמצעות מיקרוסקופ מאופנן. זה יכול לשמש ליישומים רחבה יותר ומתקדם יותר. לדוגמה, תצורת SR יכול לשמש עבור יחיד-חלקיקים מעקב בתאים חיים, על צילום-להחלפה או photoactivatable פלורסנט מתויג חלבון מולקולות של עניין18,19. תצורת smFRET ניתן ללמוד אינטראקציות מולקולרית ויוו מערכות20. פליטה המבוסס על הפיצול זיהוי מרובה ערוצים יכול להיות משולב עם תצורת SR לבצע שני צבעים SR הדמיה או יחיד-חלקיק מעקב בו זמנית21.
זה ניתן להרחיב עוד יותר כדי לאפשר מאופנן רכיבים נוספים. לדוגמה, ניתן להוסיף שכבה נוספת של מסנן הצריח ואת האור התא, כך ניתן ליצור נתיבים נוספים עירור/פליטה עבור ערוצים נוספים, כגון אחד עם לייזר אינפרא-אדום (IR) הדמיה דגימות עם צבעי IR תוויות. בנוסף מאפשר את הערוץ הדמיה נוספת, IR לייזר יכול לשמש כדי לתקן את הסחף הבמה בתחום ההדמיה SR במהלך הדימות רכישה או במהלך הניתוח פוסט. לתיקון להיסחף במהלך דימות, אם מערכת תיקון z-להיסחף אינם זמינים מהיצרן מיקרוסקופ, מערכת חלופית עם לייזר אינפרא-אדום יכול להיות גם homebuilt14 או נרכש מחברות צד שלישי. לתיקון שלאחר הרכישה להיסחף, IR לייזר יכול לשמש למעקב אחר סמנים fiducial. 22
מולקולה בודדת המבוסס על זיהוי SR מיקרוסקופ דורשת שתי ערכות של התוכנה, אחד עבור רכישת נתונים ואחד לניתוח נתונים. עבור ייבוא נתונים, אפילו תוכנה פשוטה homebuilt לוקח תמונות דרך המצלמה תוך שליטה של הלייזרים/את התנהגויות יכול לעבוד כדי ליצור תמונות SR, אמנם זה אפשרי באופן ידני לווסת את עוצמת הלייזר 405 ננומטר, למשל, על ידי סיבוב הדרגתיות דחיסות נייטרלית מסנן מותקן לפני הלייזר. עם זאת, בדרך זו של עריכת הניסוי תלויה שיפוט של הנסיין סובייקטיבי של הצפיפות של מהבהב על כתמים. לפיכך, בדרך זו אינה אובייקטיבית והיא בהכרח מתאים לשימוש עבור כימות של SR הדמיה נתונים. רכישת נתונים הקוד המשמש כאן כולל זיהוי ספוט / באלגוריתם הספירה בזמן הרכישה נתונים שוטף, המאפשר אפנון אוטומטית של הכוח 405 ננומטר לייזר בהתבסס על צפיפות מהבהב על נקודות (איור 6). כיום, חלק מהיצרנים מיקרוסקופ מספקים מודולים הדמיה ניתן לתכנות, כך ניתן לנצל את אלה, או לחפש תוספים ממקורות פתוח כמו מיקרו-מנהל. לניתוח נתונים, זה אפשרי להשתמש מודולי ניתוח זמינים מסחרית מיצרנים מיקרוסקופ או לחפש תוספים ממקורות פתוח כמו ImageJ.
לסיכום, קביעת המובאת כאן מספק רב-תכליתיות, מעבר קל בין תצורות הדמיה שונות בעלות מופחתת ומרחב. זה קל יחסית לאמץ על ידי כל מעבדה למחקר במדעי הביולוגיה עם צורך השגרה וניסויים הדמיה מגוונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ג'יי מאשר תמיכה של התוכנית מלומדים סרל ופרס הבמאי NIH חדש חדשן. המחברים לאשר הצעות שימושיות מהמעבדה של פול Selvin (באוניברסיטה של אילינוי באורבנה-שמפיין) לצורך מיקום העדשה תלת-ממדי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
References
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
