Summary
従来のエピ蛍光イメージング、分子検出に基づく超解像イメージング、およびマルチカラー単一分子検出を結合、統合された顕微鏡システムの構築の実践的なガイドの紹介など単一分子蛍光共鳴エネルギー移動イメージング、コスト効率の高い方法の 1 つの設定にします。
Abstract
蛍光顕微鏡は、その場で生体分子の検出し、その動態とリアルタイムの相互作用を監視する強力なツールです。従来のエピ蛍光顕微鏡に加えて様々 なイメージング技術は実験の特定の目標を達成するために発達しました。Å の解像度と単一分子検出に基づく分子間相互作用の構造変化とに報告される単一分子蛍光共鳴エネルギー移動 (smFRET) を含むいくつかの広く使われている技術超解像度 (SR) イメージング、回折限界顕微鏡に比べて twentyfold に空間分解能約 10 を高めることができます。従来エピ蛍光イメージング、分子検出に基づく放射光イメージング、マルチカラー単一分子検出など、1 つの顕微鏡の複数の撮像方法をマージ顧客設計統合システムを紹介します。smFRET イメージングを含みます。光学素子を切り替えることにより、簡単かつ再現性をもってさまざまな撮像方法を実現できます。このセットアップは、ルーチンと多様なイメージング実験コストの削減と建物の個々 の目的別顕微鏡に比べて、領域の必要性と生物科学のすべての研究所によって採用する簡単です。
Introduction
蛍光顕微鏡は現代生物学研究のための重要なツールであり、蛍光イメージングは多くの生物学研究所で定期的に実行されます。Fluorophores が付いている興味の分子をタグ付け、直接顕微鏡の下で視覚化し、ローカリゼーション、構造、相互作用、およびアセンブリ状態で体内または体外で経時変化を記録できます。従来の蛍光顕微鏡は横方向に 200 ~ 300 nm と 500 ~ 700 nm 軸方向1、2、そして、したがっての 100 s でイメージングに限る回折限界の分解能があります。ナノメートル-ミクロン スケール。分子集合体または組織の細部を明らかにするため、回折限界を破ることができる様々 な SR 系が開発されています。SR を達成するために使用される戦略は、誘導放出の枯渇 (STED) 顕微鏡3,4や構造化照明顕微鏡 (SIM)5,6,などの非線型光学効果7、確率光再建顕微鏡 (嵐)8とセンサー ローカリゼーション顕微鏡 (パーム)9MINFLUX10など、両方の組み合わせなど、単一の分子の検出を確率。これらの SR 系の中で、単一分子の顕微鏡のセットアップから単一分子検出に基づく SR 顕微鏡を比較的簡単に変更できます。反復的な活性化と活性型蛍光タンパク質 (FPs) または興味の分子タグ写真切替可能な染料のイメージングは、空間分解能は 10-20 nm11を達することができます。分子間相互作用と立体構造情報を得るためには、リアルタイム ・ オングストローム-ナノメートル分解能動態が必要です。smFRET12,13は、この解像度を達成するために 1 つのアプローチです。一般に、生物学的興味に応じて、空間解像度の異なる撮像方法が必要です。
通常、各タイプのイメージ投射では、特定の励起および/または放射光の構成が必要です。例えば、単一分子検出のための最も一般的に使用される照明手法の 1 つは特定の励起角度がプリズムや対物レンズを通じて達成する必要があります内部全反射 (TIR) を通じてです。・空間的分離、電子-乗算の電荷結合素子 (EMCCD)、ミラー、ダイクロイック ビームスプリッターのセットを得ることができるのさまざまな部分に指示必要があります smFRET 検出、ドナーとアクセプターの染料からの排出量排出パスに配置されます。3 次元 (3-D) 排出パスの非点収差の影響を引き起こすこと SR イメージング、14シリンドリカル レンズなどの光学部品が必要です。したがって、自作や市販の統合された顕微鏡は、通常、機能的イメージング法の種類ごとに特化した、同じセッティングのさまざまなイメージング方法を切り替える柔軟ではありません。3 つの異なる撮像方法間調整で再現可能なスイッチを提供するコスト効率の高いハイブリッド システムの紹介: 単一分子検出に基づく SR の回折限界解像度と、従来のエピ蛍光イメージングイメージングおよびマルチカラー単一分子検出、smFRET イメージング (図 1 a) を含みます。具体的には、ここに示す設定を含む多波長励起入力レーザのファイバー結合型、商業照明アームにより、励起のパスにプログラム epi モードと TIR モードを切り替える、励起角度のコントロール。排出パス 3次元イメージングのための顕微鏡体内リムーバブル自作円筒レンズ カセットを配置し、複数の発光チャンネルを検出する選択的に有効にできる、EMCCD カメラ手前にある商業ビームスプリッター同時に。
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Protocol
1. 顕微鏡設計・組立
-
励起パス
注: レーザー、差動干渉の対照 (DIC) のコンポーネント、顕微鏡本体、照明アームに、励起パスが含まれます。- 振動分離光学テーブルを準備します。たとえば、48 × 96 × 12' の構造減衰テーブルは、すべてのコンポーネントの十分なスペースを与えます。
注: 構築 (例えば、21.4 ± 0.55 ° C) 温度制御付きの部屋の設定です。温度安定性は光学アライメントを維持するために重要です。 - 光ファイバー接続用照明アームが装備されている顕微鏡本体をインストール 100 倍油浸型全反射対物レンズと DIC のコンポーネント。
- 4 つのレーザー ヘッドを配置 (647 561 nm nm、488 nm、405 nm、図 1 bに囲まれて) 熱光学テーブル上にシンクし、同じ高さとは (例えば良好な安定性を確保するため可能な限り短い放出されるレーザー光あるを確認、' 3')。
注: レーザー ヘッドは、他のレーザーより短い高さで座っている場合、は、それの下に十分な厚さのアルミ板を置きます。常にヒート ・ シンクと最高の放熱 (図 1 b) の光学テーブル間最大の接触を確認します。レーザーは SR イメージングのために十分に強力なする必要があります。材料の表を参照してください。ダイオード レーザーの前にレーザー クリーン アップ フィルターを持っていることをお勧めします。 - 周辺機器コンポーネント インターコネクト (PCI) インターフェイスを介してデータ集録カードをワークステーションにインストールし、このカードでレーザーを接続します。トランジスタートランジ スター論理 (TTL) 出力でレーザーのオン/オフ動作し (図 1) このカードのアナログ出力で電力調整を制御します。顕微鏡本体だけでなく、適切な顕微鏡イメージング (商業または自作のいずれか) データ集録カードを制御するためのソフトウェアをインストールします。
- ミラー、ダイクロイック ビームスプリッター (590、525、ロングパス フィルター 470) をそれぞれのマウントにマウントします。ミラーの非常に安定したミラー マウントを使用します。止め輪と二色性ビームスプリッター (図 1) を曲げないように円形のスプリッターを使用します。
- レーザー (図 1 b) を結合する光学テーブルにミラー、ダイクロイック ビームスプリッターを配置します。最も安定した整列を成し遂げるためには、全体の配置を可能な限りコンパクトにして ' 1' 厚光ポストを使用します。以来、短波長光を放散空気中より短い波長のレーザーは光ファイバー結合 (図 1 b) に近いようにレーザーを配置します。
- シングル モード光ファイバーにレーザ光を結合します。これを行うには、ケージ システム以下の手順で繊維のカプラーをビルドします。
- (図 1E、左側のパネル) z 軸変換マウントで繊維のアダプター プレートをマウントします。
- 色消しレンズをマウント (焦点距離 = 7.5 mm) ケージ プレート (図 1E、左から 2 番目のパネル) で。
- ケージを形成する延長ロッドで上記 2 つの部分を接続します。光学テーブルにケージ マウント取付ブラケット 1'-厚光記事 (図 1E、中央のパネル)。
- シングル モード光ファイバー (カプラーに FC/APC 終了) まず 647 nm レーザーを合わせます。
注: 多モード光ファイバーを使用して、シングル モード光ファイバーを使用する前に大まかな配置は、配置プロセスを助けるかもしれない。色消しレンズとファイバー アダプター プレート (図 1E、z 軸変換マウントを調整することによって) 間の距離だけでなく、ミラー、ダイクロイック ビームスプリッター (図 1、調整ノブによって) の角度を調整を得るために光ファイバーを通じて最大のレーザー最大出力。 - 最初のレーザーの配置が完了すると、一時的に菖蒲のペアをインストールし、(図 1 f) レーザー 1 つずつの残りの部分を配置します。パワー メーターを配置効率を確認してください。
- レーザーの反射を低減するアダプター プレートの前部 1 つアイリスを残します。
注: 強い戻る反射レーザー光源の寿命を減らすことができます。必要に応じて、光アイソレータは、反射を完全に削除するには、各レーザー頭の前でインストールできます。
- (図 1 H) 顕微鏡の照明アームに光ファイバーのもう一方の端を接続します。
- デザインし、「倍率レンズ (レンズ等)」次の手順をインストールします。
注: レーザーは、サンプルのエピ蛍光イメージングの使用できますが、各レーザーの狭いビームのサイズが新しいため特に数回対応するカメラのセンサーの実際のサイズより小さい領域にサンプルの照射領域を制限(従来の 11.6 ミリメートルの長さと比較して対角線の長さ 18.8 mm) とカメラ。したがって、サンプルのより大きくより平らな照明を達成するためにビームを展開することをお勧めします。- 照明アーム (図 1 H) に合うことができるマグのレンズを設計します。
注: マグ レンズの設計は、それをインストールするのに依存します。図 1 Hは照明アームのインストールの例を示しますが、レーザ光線は平行 (ディスカッションを参照) 後に、任意の場所にインストールできます。コンピューター支援設計と製図ソフトウェアをデザインします。 - 2 つの色消しレンズ、1 つの凹面を配置 (焦点距離 = f1)、および 1 つの凸 (焦点距離 = f2) 自家製マグ レンズのホルダーが (図 2 aおよび2 C) f1、自分の焦点距離の合計に等しい距離に+ f2 = (-25) + 50 = 25 mm (図 2 b)。
注: この焦点距離の選択、マグ レンズ拡大ビーム f2/|1f |= 2 の襞。マグのレンズは、汎用性を提供します。梁 (図 2 D) を拡大することがなく正規の照明を再開する削除または強く励起強度を達成するためにレーザ光線を焦点に逆方向に挿入できます。
- 照明アーム (図 1 H) に合うことができるマグのレンズを設計します。
- 振動分離光学テーブルを準備します。たとえば、48 × 96 × 12' の構造減衰テーブルは、すべてのコンポーネントの十分なスペースを与えます。
2. 排出パス
注: 排出パスは取り外し可能な円筒レンズ、バリア フィルター ホイール、排出スプリッターと EMCCD カメラ (図 1) を成っています。単一分子の広がり関数 (PSF) を最高のポイントを達成するために、対物レンズから DIC プリズムを置きます。
- カスタム デザイン マニュアル DIC アナライザーに収まることができる円筒レンズ (3 D レンズ) カセットは、顕微鏡本体 (図 3) にスロットを挿入します。
注: このデザインを損なわない DIC アナライザー アナライザー ブロック フィルター タレットに挿入できるので。 - カセットに焦点距離 10 m の 3 D レンズ、乱視効果を単一分子14日ごとの z 座標を抽出するために必要な作成する発光ビーム光路に挿入します。
注: 必要に応じて、3 D レンズ カセット配置できますまたは排出パス (図 3)。 - 顕微鏡本体内部フィルター砲塔にマルチバンド二色性ビームスプリッターをインストールします。
- 放出フィルターをインストールします。
メモ: 発光フィルターは、最寄りの蛍光物質によって選択されます。イメージング モジュールによって以下のとおり異なる場所に配置排出フィルターを使用します。- シーケンシャル マルチカラー エピ蛍光イメージングまたは放射光イメージング、チャネル ・ スイッチ (図 1) の中に顕微鏡本体の振動を最小限に抑えるため排ガス浄化装置顕微鏡本体横に接続されているバリア フィルター ホイールに配置を使用します。
- 同時複数色の検出 (例えば、smFRET 実験)、放射分割 (詳細については手順 4 チェック) の設定別のフィルターを配置します。
注: 通常、商業放射分割は (すなわち、「従事」または「バイパス」モード) の 2 つの切り替えモードを持っています。半音階同時多色イメージング (「従事」モード) の発光ライトを分離する 2 つの二色性ビームスプリッターと 3 つの排出フィルターを保持フィルター キューブが使用されます (「トリプル キューブ」図 4および4 D)。バリア フィルター ホイールで空のスロットは、トリプル キューブとの組み合わせで使用されます。その一方で、シーケンシャルのマルチカラー イメージングのためトリプル キューブはちょうど (「バイパス キューブ、「図 4 aおよび4 D) 内部ミラーを持つキューブに置き換えられます。
- 排出パスの最後の部分として、EMCCD カメラをインストールします。利用した高速フレーム レートを実現する USB PCI 接続。
メモ: EMCCD カメラは最も敏感な単一分子検出の勧めが、高度な sCMOS カメラが代わりにすることができます。
3. 回折限定エピ励起によるイメージング
- 照明アームで epi モードに励起レーザの付随的角度調整します。
- (図 3、右パネル) に従事している場合の 3 D レンズを外します。
- 排出量分割ウィンドウ (図 4 aと4 e底板) のバイパス キューブに挿入します。
- (省略可能)拡大照射面積 (図 2 D、左パネル) のマグのレンズを挿入します。
注: マグ レンズと油浸対物レンズ × 100 の使用、約 91 × 91 μ m2点灯が可能、均等に白色光源とフィルターの複数のキューブを使用する必要があります。 - イメージング ソフトウェア多チャンネルを顕微鏡や z、および/またはコマ撮り画像を使用します。
注: 複数のプログラム利用できるある顕微鏡観察、顕微鏡の製造メーカーからのみならず、サードパーティやオープン ソース開発者のため。
4. マルチ チャネル分子イメージングなどを含む smFRET
注: は、任意の波長を持つすべての発光は、発光スプリッターのフィルター/ダイクロイック ビームスプリッターの 2 番目のセットにアクセスできるように、バリア フィルター ホイールで「空」の位置に移動します。
- 表面固定化分子15 smFRET 測定を含む全反射蛍光励起を用いたマルチカラー単一分子検出を設定するには、全反射角に励起レーザの付随的角度を調整します。マグのレンズと 3 D レンズを外します。
- 以下の手順で排出分割ウィンドウ (図 1) の 3 チャンネル モードを行います。
- 「校正キューブ」を使用してバイパス キューブを置き換えることができます (図 4 bと4 e) すべてチャンネルを通過する光。
- DIC (すなわち、バリア フィルター ホイールでない排出フィルター) の下でカメラの電源し、完全に区切られた 3 つのチャンネルが画面に表示されるまでに排出量の分割線の絞り値を調整します。
注: は、部屋の光が点灯し、すべてのチャンネルを可視化する、この手順を行います。 - 排出スプリッターの水平/垂直調整コントロールのノブ、大体 (図 4 eと4 階) の 3 つのチャンネルを合わせます。
- カメラの電源をオンにし、(図 4および4E) トリプル キューブに校正キューブを置き換えます。
- サンプルに 100 nm マルチ チャンネル ビーズ 100 倍の対物レンズと焦点の上にサンプルを配置します。
- カメラと 488 nm レーザーをオンに、明るいビーズの 1 つ上でズームインし、細かくノブを回して調整コントロール再び (図 4 eと4 G) の 3 つのチャンネルを合わせます。
注: 100 nm マルチ チャンネル ビーズは、488 nm 励起、3 チャネル配置を有効にする時に光の異なる波長を生成します。
- カメラとレーザー、フォーカス、および合理的なスポットの密度で良い位置を見つけます。許容可能な信号対雑音とフォトブリーチを行なったレベルを達成するためにレーザー パワーと暴露時間を調整します。コマの画像を撮影するのに顕微鏡のイメージング ソフトウェアを使用します。
5. 放射光イメージング
注: これは単一分子検出に基づく SR 顕微鏡です。
- 放射光イメージングをセットアップするには、3 D レンズを挿入し、マグ レンズを取り出します。適切なレーザーのチャンネル (例えば5-60 ms) でカメラの露光時間を設定します。決定し、手動で全反射角度を最適励起レーザの付随的角度を設定します。
- 画像バッファー16SR にサンプルを配置します。イメージングの前に少なくとも 10 分の平衡にバッファーを許可します。
注: 約 1 h 後に SR 画像バッファーが有効期限が切れるので、それに応じてバッファーをイメージング新しい SR です。 - 放射光イメージングの前に DIC イメージを取る。SR は、非点収差の影響を最適化する適切な客観的高さを見つけるために DIC イメージング細胞の中間の平面を見つけることを使用します。セルが「光」から「暗い」イメージへの移行し、透明になるよう高さによって平面を識別する (図 5 a 5 b、 5 C)。目的の焦点面が特定されると、z ドリフト補正システム (図 1 a) に従事します。
- 放射光イメージングを実施します。スポット ' 点滅 on' の適切な密度を維持するために 405 nm レーザーのパワーを変更します。
注: 405 nm レーザーを手動で変更することが可能ですが、「点滅の"スポット密度を維持するためにプログラムされたデータ集録コードを実行すると便利です。それが自動的に行われる方法の例です。ソース コードはリクエスト (図 6) です。- 0 W/cm2バイオレット レーザー パワーとイメージングの集録を開始します。
- 一定期間で点滅のスポットの数をカウントします。
- 点滅のスポットの数がしきい値を超えるユーザー定義"カウント"ビューのフィールドで維持されるようバイオレット レーザー パワーを調整します。点滅のスポット数がカウントのしきい値を下回ったときバイオレット レーザー力を高めます。
- 点滅のスポットの数が最大バイオレット レーザーのパワーを使用してカウントのしきい値を下回ったときは、取得を終了します。
注: 最大値はサンプルの明るさに応じて異なる設定が 130 W/cm2以上にすることができます。放射光イメージングの実際の目的に応じて、任意の目的のポイントでこの自動獲得コードを手動で終了できます。
- 取得を開始した後すぐに点滅動作とスポットの Psf を確認します。
注: 点滅動作は理想的な励起レーザの付随的角度を変更か画像バッファーを置き換えます。「垂直」、「水平」と「ダイヤモンド」図形を表す fluorophores が付いて、下から上、および焦点の平面内でそれぞれ、PSF (図 5) のサンプリングを期待してください。ほとんどスポットは、垂直方向または水平方向の Psf を表示、焦点面は、オフのセルの中心から、ので実験を終了し、再び焦点面を調整します。オイルを交換またはサンプルの別の撮像領域に変更が必要になる場合がありますので、イマージョン オイル等の気泡の存在は Psf の品質を及ぼします。 - データ分析のため各画像フレームの各スポットの重心を検出し、x と y の幅14から各スポットの z 値を抽出する (NIH ImageJ プラグイン) のオープン ソースまたは商業的に利用可能なコードを使用します。
注: このレポートでは、もともと早い単一分子検出に基づく SR8のいずれかで開発したソース コード 3次元検出16用に改造した、使用されました。 - 2 色画像の場合、励起波長の短いものが続く、長い励起波長と蛍光をイメージします。同様にステップ 5.4 ではなく、異なる撮像レーザーを説明した自動取得コードを実行します。
注: (例えば、赤い染料、黄緑色の染料) 異なった fluorophores が付いている画像の色収差を修正必要があります。手順を示します。- 複数クラスターの形成を回避するガラス基板に 100 nm マルチ チャンネル ビーズを固定します。
- 異なる励起チャンネルでそれらの画像を取る。
- ソフトウェア (ステップ 5.6) による座標の (X, Y, Z) を抽出します。
- ΔX は私のプロット X =1i -2 i ΔYi X = Y1i - Y2i (私は異なるビーズと 1 と 2 が別の色チャンネル) 別に適切な機能とそれらを適合。関数を保存します。
注: 線形関数は、ほとんどの場合で十分です。これらの関数が決まったら、この測定はイメージングのたびに繰り返されることはありません。 - 目的の標本の実際 2 色放射光イメージングで色収差を補正 (X, Y) に関数を適用します。Z 方向の色収差、ΔZ の取得によって行う Z1 - Z2マルチ チャンネル ビーズや関心のサンプルと共にシード既知の参照マルチ サンプルを =。
注: (X, Y) とは異なり色収差、z 方向の色収差はチャンネル切り替え時に不完全な z 方向集中メンテナンスのために主に、それぞれの実験でよく再現ではありません。したがって、補正するたびに行うことをお勧めします。ΔZ = Z1 - Z2ですので、ちょうどいくつかのビーズや標準試料は、各サンプルの対象領域あたり十分だろう (X, Y) の独立した主。3d 可視化ソフトウェアで構築された最終的な 2 色 SR イメージをプロットし、ΔZ を手動でチェックします。
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Representative Results
この顕微鏡では、柔軟性と再現性のあるさまざまなイメージング方法を切り替えることができます。ここで各イメージング モジュールで収集したサンプル画像を紹介します。
図 5は、SR 取得中に点滅に分子の PSF を示します。最終的な SR イメージ (図 5E) を生成する何千ものような画像が再現されます。図 5 eは、図 7Aのエピ蛍光イメージで示すように、同じ細菌規制 Rna を示しています。図 7は、U2OS 哺乳類細胞における大腸菌細胞における小規制 RNA と mRNA の代表的なエピ蛍光画像を示します。両方の Rna は、DNA オリゴの in situハイブリダイゼーション17までに蛍光タグが付いています。図 8は、ドナー色素 (緑色の染料) とアクセプター色素 (赤色色素) が付いた折り畳まれた RNA 分子の代表的な smFRET 測定を示しています。複合体は顕微鏡スライド上に固定された、全反射照明によって興奮しています。蛍光強度の軌跡は、時間の関数として FRET 効率を生成する個々 の単一分子から抽出できます。
図 1: 顕微鏡のセットアップのデザイン。(A) このパネル セットアップの図を示しています。M = ミラー、DBS 二色性ビームスプリッター、LCF を = = レーザー クリーン アップ フィルター私アイリス、L = = レンズ、AP ZTM アダプタ プレートを = = z 軸並進マウントの = 光ファイバー、OFC 光ファイバー結合、CL = = 円筒レンズ、TL チューブ レンズ、EF = 排出フィルター、Obj = = 目的レンズ、および SM のステップ モーターを =。Z ドリフト補正システムは、対物レンズのノーズピースでステップ モーターを z ドリフト独自の LED によって生成され、独自の検出器によって検出された赤外線 (IR) 信号によって計算されるの反対の方向に移動します。(B) このパネルのレーザー励起アセンブリを示します。4 レーザー ミラー、ダイクロイック ビームスプリッターを組み合わせるし、焦点レンズと並進マウント (写真下) の上に座ってアダプター プレートを光ファイバーに移動しますが。(C) このパネルは、レーザ変調を示しています。2 つの銃剣ニール Concelman (BNC) ケーブルは、TTL およびアナログ変調 (左側のパネル) レーザー (頭部または製造業者によって、コント ローラー) のそれぞれに接続されます。BNC ケーブルは、コンピューター制御のワークステーション (右側のパネル) でデータ集録カードに接続されている単一のケーブル (中央のパネル) に結合されます。(D) このパネルを示していますミラー、ダイクロイック ビームスプリッターをマウントします。(E) ケージ システムのファイバー結合器を構築します。繊維のアダプター プレート (AP) は、無彩色の二重レンズ (L1、図) に、その距離を変調することができますので、z 軸変換マウント (ZTM) にマウントされます。AP と ZTM スレッド、L1 と同じ、ケージ プレートが一致しています。アヤメ (F) A ペア (取り囲む) 複数のレーザーの配置処理中にインストールされます。647 nm レーザー (左のパネル)、561 nm レーザー (右側のパネル) が同じパスを通過することを確認に使用されます。(G) A 排出パスの部分が表示されます。顕微鏡本体の外排出フィルター ホイール、排出スプリッター、EMCCD カメラは順序でインストールされています。(H) このパネルは、照明アーム組立部品を示しています。マグ レンズは照明アームに挿入されます。励起レーザー光は、光ファイバーと結合 (画像の右側) に光ファイバーを通して照明腕に送信されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: マグ レンズ。(A) このパネル レーザー ビームを拡大住宅レンズ ホルダーの正投影を示しています (単位: mm)。このデザインは、照明の腕にフィットするものです。(B) このパネルのどこで 2 つのレンズ ホルダーに穴の内部の図面を示しています。L1 は凹レンズと L2 は、凸レンズとそれらの間の距離はその焦点距離の合計。(C) これはマグのレンズの写真です。(D) マグ レンズを展開または (左) レーザ光線の焦点を当てる照明アームに挿入できるまたは (右) そのままレーザー光を保つために削除することができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 3次元レンズ。(A) このパネルはバイパス モードの空白円孔と円筒のレンズを保持するための長方形の穴を持つ者の正投影を示しています (単位: mm)。このデザインは、顕微鏡本体の DIC アナライザー スライダーに合わせてものです。(B) これは 3次元のレンズの写真です。(C)、円筒レンズ、乱視 (左) と Psf を引き起こす放射ビーム パスに従事できるまたは Psf そのまま (右) を維持する、バイパス モードの婚約を解消することができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 排出のスプリッターのマルチ チャネル配置します。校正キューブ、および (C) トリプル キューブ、バイパス キューブ、(B) (A) と放射分割光学と光パスのスキームが表示されます。M = ミラー。バイパス キューブ (M5) 内部のミラーがありバリア フィルター ホイール放出フィルター (EF) に使用することになっています。校正のキューブは、すべてのチャンネルを通過するためにライトを許可するビームスプリッター (BS) をされています。トリプル キューブは、3 つの発光フィルターだけでなく、2 つの二色性ビームスプリッター (DBS) をされています。(D) 3 つのキューブの写真です。(E) 放射分割の内部が表示されますキューブ (上部パネル) とスライド キューブ (下段)。M3 M4 の背後にあるし、写真でキャプチャされません。ミラーのコントロール ・ ノブは排出スプリッター (上部パネル) の上にいます。(F) このパネルは、DIC の下で校正キューブを使用してチャネル配置を示しています。(G) このパネルはグリーン (上部パネル) と赤 (中央のパネル) チャンネル 100 nm マルチ チャンネル ビーズとトリプル キューブを使用しての細かい配置を示しています。2 つのチャネルの結合されたイメージが (底板) とも表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 代表的な SR 画像取得します。これらのパネルは、セルの中心の平面上、代表的な DIC 画像 (A)、(B) の下で、または (C) を表示します。(D) このパネルは点滅の fluorophores の PSF の例を示します。オレンジ色の円を囲む「垂直」PSF.緑色の円を囲む「水平」PSF.ブルー サークル囲む菱形 PSF、焦点面に蛍光物質を表します。(E) このパネルは、代表的な再建 SR イメージを示しています。小さな規制 RNA には赤い色素と蛍光性上皮内交配が付いています。白の枠線はセルの端をマークします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: SR 用プログラム データ集録コード。このプログラマブル集録モジュールで様々 な実行コマンド顕微鏡制御機能左パネルに記載されてし、プログラム コードを作成する選択ことができます。コマンドは、上から下へ順番に実行されます。このスクリーン ショット例を示しますが、定義済み買収を提起し、3 つの時系列画像フレーム内のスポットの数を計算するまで反復イメージング買収の特定の番号を実施します。これらのスポットの数の平均値 (細菌イメージング細胞数の 50% で定義) のしきい値を超える場合は、画像の取得は同じループで続けています。しきい値を下回る場合、画像の取得は次のループは強いバイオレット レーザー電源が使用されている (スクリーン ショットの下にカット) で続行します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 代表エピ蛍光イメージ。(A) このパネルはエシェリヒア属大腸菌細胞における小規制 RNA を示しています。(B) このパネルは、U2OS 哺乳類細胞における mRNA を示しています。Rna は、赤い色素と蛍光の in situハイブリダイゼーションによる青色色素が付いています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: smFRET 画像の例です。(A) 試料が 561 nm レーザーに興奮しました。緑と赤の染料から (B) 排出量は同時に収集およびそれぞれグリーン (右)、(左) レッド スポットとして表示されます。(C) このパネルを示しています、代表的な蛍光強度対緑の染料の時間軌跡 (緑) と 1 つの分子から赤い染料 (赤)。(D) このパネル表示、FRET 効率対アクセプターとして計算される時間軌道 (固体ブルーライン)/(私はドナー + I型受容体) のサンプルの 1 つの分子から。フレット トレースには、隠れマルコフ モデル (赤色の破線) が付いています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このハイブリッド顕微鏡システムには、複数の顕微鏡を購入する必要があります。光学テーブル、テーブル ・ インストレーション、ソフトウェア、およびワークステーションを含む全ての部品の総コストは約 $230,000。マグ レンズと 3 D レンズを含むカスタム加工部品コスト約 $700 (コストは異なる機関で実際の請求によって異なります) です。典型的な市販システムのための統合単一分子検出に基づく SR 顕微鏡コスト以上の $300,000 〜 400,000 と容易に使用できない smFRET 測定、または合理的な視野のエピ イメージング白ライトなしソース。したがって、ここで紹介した方法は、コスト大幅削減で複数の顕微鏡と同等の画像処理機能を実現できます。
この変調顕微鏡システムは、さまざまなメーカーから選べるボディをに基づいてできます。3 D レンズは、排出スプリッター、顕微鏡本体内またはフィルター ホイールと客観的ノーズピースと使用可能な領域を含む排出パス内の任意の位置で潜在的インストールことができます。ただし、3 D レンズの物理的な場所は 3次元イメージングのための最高の非点収差効果を達成するためには、その焦点距離を決定します。10 m の焦点距離で始まるをお勧めします。マグ レンズは、本質的には励起パスにインストールされているビーム エキスパンダーです。励起レーザー空中する場合 (すなわち。、光ファイバーなし)、任意の場所のレーザ光線を平行にこのような展開をインストールする簡単です。励起レーザ、ファイバー結合型された場合、(1 つの凹面および他の 1 つ凸) 2 つのレンズをインストールする余分なスロットを探します。たとえば、多くの商業照明の腕は、中立的な密度のフィルターのスロットを持っています。2 つのスロット間の距離と等しい彼らの焦点距離の長さの合計で 2 つのレンズを見つけます。その後、彼らがマグ レンズとして機能する挿入できます。また、フィールド ダイヤフラム スライダーのマウントは可能であれば別の場所である場合もあります。取り外し可能なカセットでマグ レンズを構築等レンズの向きの反転によって単に SR 用必要があります。 データのハイパワーを達成するために励起レーザーを集中する 1 つを有効にする追加の利点があります。
本報告では, 変調の顕微鏡を使用して 3 つの別のイメージング技術の柔軟な切り替えを行った。この設定より広範なより高度なアプリケーションに使用できます。たとえば、単一粒子写真切替での生細胞における追跡の SR 構成を使用できるまたは活性型蛍光タンパク質タグ生体の関心18,19。システム20生体内での分子間相互作用を研究する smFRET 構成を使用できます。発光分割に基づくマルチ チャンネル検出は、2 色放射光イメージングまたは単一粒子追跡同時に21を実行する SR 構成と組み合わせることができます。
このセットアップをさらに展開するより変調コンポーネントを有効にすると。たとえば、フィルターの砲塔と照明区画の別の層追加できます、イメージングの IR 染料が付いたサンプルの赤外線 (IR) レーザーなど、追加チャンネルの追加励起/蛍光パスを作成することができますように。追加画像チャンネルできるだけでなく、IR レーザーを放射光イメージング買収、イメージング中にまたは後の分析中にステージ ドリフトを修正する使用できます。画像集録中にドリフト補正のため z ドリフト補正システムは顕微鏡メーカーからは IR レーザーと代替システムどちらか自作14をすることができます。 またはサードパーティ企業から買収しました。買収後ドリフト補正のため体内マーカ追跡用 IR レーザーを使用できます。22
単一分子検出に基づく SR 顕微鏡には、ソフトウェア、データ集録とデータ分析の 2 つのセットが必要です。データ集録のためでも、画像カメラは、レーザの ON を制御しながら簡単な自作ソフトウェア/405 nm レーザー力、例えば、回転を手動で調節することはできますが、SR のイメージを生成する働くことができる行動をレーザーの前にインストールされているグラデーションの中立密度フィルター。ただし、実験を行うこの方法は点滅にスポットの密度の実験者の主観的な判断に依存しています。したがって、この方法は目的ではない、SR 画像データの定量化に使用することが適さない場合があります。ここで使用されるデータ集録コードには点の検出が含まれています/点滅のスポット (図 6) の密度に基づいてカウント アルゴリズム データ集録が進行、405 nm レーザー力の自動調整を有効化中。今日では、いくつかの顕微鏡の製造メーカーは、ので 1 つは、これらを利用したり、マイクロ マネージャーのようなオープン ソースのプラグインを探しますプログラム可能な画像処理モジュールを提供します。データ分析用顕微鏡メーカーから市販の分析モジュールを使ってや ImageJ のようなオープン ソースからのプラグインを探すことです。
要約すると、ここで紹介する設定は高い汎用性と低コストでさまざまなイメージング構成とスペースの簡単切り替えを提供します。このセットアップは、ルーチンと多様なイメージング実験の必要性と生物科学のすべての研究所によって採用する比較的簡単です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
J. f. は、サール学者プログラムおよび NIH のディレクターの新しいイノベーター賞からサポートを認めています。著者は、ポール セルビン ラボ (アーバナ平原イリノイ大学) 3 D レンズを配置するための有用な示唆をご了承ください。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
References
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