Summary
Здесь мы представляем практическое руководство построения интегрированных микроскопии системы, которая объединяет обычные epi флуоресцентных изображений, сингл молекула на основе обнаружения суперразрешением изображений и многоцветные сингл молекула обнаружения, включая Одноместный молекула флуоресценции передачи энергии резонанса изображений в один настройки в экономически эффективным способом.
Abstract
Микроскопии флуоресцирования является мощным инструментом для выявления биологических молекул на месте и мониторинга их динамики и взаимодействия в режиме реального времени. Помимо обычных epi флуоресцентной микроскопии для достижения конкретных экспериментальных целей были разработаны различные методы обработки изображений. Некоторые из широко используемых методов включают сингл молекула флуоресценции передачи энергии резонанса (smFRET), который может сообщить конформационные изменения и молекулярных взаимодействий с Ангстрем резолюцией и одной молекулы на основе обнаружения супер-резолюции (SR) изображений, которые могут повысить пространственным разрешением около десяти в twentyfold по сравнению с дифракционный микроскопии. Здесь мы представляем клиентов разработана комплексной системы, которая объединяет несколько методов обработки изображений в одном Микроскоп, включая обычных epi флуоресцентных изображений, изображений на основе обнаружения SR одной молекулы и многоцветные сингл молекула обнаружения, включая smFRET изображений. Различные методы обработки изображений можно легко и можно воспроизвести путем переключения оптических элементов. Эта установка легко принять любой научно-исследовательской лаборатории в биологических наук с необходимостью для рутинных и различных изображений экспериментов на снижение стоимости и пространстве относительно создания отдельных микроскопы для индивидуальных целей.
Introduction
Флуоресценции Микроскопы являются важными инструментами исследований современной биологической науки и флуоресцентных изображений регулярно проводится во многих лабораториях биологии. Путем пометки биомолекул интерес с флуорофоров, мы можем непосредственно визуализировать их под микроскопом и записывать время зависимых изменения в локализации, конформации, взаимодействия и Ассамблея государств в естественных условиях или в пробирке. Обычных флуоресценции Микроскопы имеют дифракционный пространственным разрешением, который является ~ 200-300 Нм в боковую сторону и ~ 500-700 Нм в осевом направлении1,2и, таким образом, ограничивается изображений на 100s Шкала нанометров до микрона. Для того, чтобы выявить тонкие детали в молекулярной сборки или организации, были разработаны различные SR microscopies, которые могут нарушить дифракционного предела. Стратегии, используемые для достижения SR включают нелинейных оптических эффектов, таких как простимулированное излучение истощения (интереса) микроскопия3,4 и структурированного освещения микроскопии (SIM)5,6, 7, стохастический обнаружения одного молекул, например стохастических оптических реконструкции микроскопии (шторм)8 и photoactivated локализации микроскопии (PALM)9и сочетание обоих, например, MINFLUX10. Среди этих SR microscopies сингл молекула на основе обнаружения SR Микроскопы могут быть относительно легко изменены из одной молекулы Микроскоп set-up. С повторяющихся активации и изображений photoactivatable флуоресцентных белков (FPs) или фото переключаемый красители, отмеченных на биомолекул интерес пространственное разрешение может достигать 10-20 Нм11. Чтобы получить информацию о молекулярных взаимодействий и конформационные динамика в режиме реального времени, Ангстрем нанометровая резолюции не требуется. smFRET12,13 является одним из подходов к достижению этой резолюции. Как правило в зависимости от биологических вопросов интерес, необходимы методы обработки изображений с различным пространственным разрешением.
Как правило для каждого типа изображения, необходима возбуждения и/или выбросов оптических конфигурации. Например один из наиболее часто используемых освещения методов для обнаружения одной молекулы — посредством полного внутреннего отражения (МДП), в котором конкретные возбуждения угол необходимо достичь через призму или объектива. Для обнаружения smFRET выбросы от доноров и акцепторов красители нужно быть пространственно разделены и направлены в различные части электрон умножения, зарядовой (EMCCD), которое может быть достигнуто с набором зеркал и дихроичный пучка сплиттер помещены в пути выбросов. Для трехмерной (3-D) SR изображений, оптические компоненты, такие как Цилиндрические линзы14, необходимо вызвать эффект астигматизма по пути выбросов. Таким образом homebuilt или коммерчески доступных интегрированных Микроскопы обычно, функционально специализированные для каждого типа изображений метод и не являются гибкими, чтобы переключаться между различными методами визуализации на же настройки. Здесь мы представляем экономически, гибридная система, которая обеспечивает регулируемый и воспроизводимые переключает трех различных методов обработки изображений: обычные epi люминесцентные изображений с разрешением дифракционный, сингл молекула на основе обнаружения SR изображений и многоцветные сингл молекула обнаружения, включая smFRET изображений (рис. 1A). Конкретно здесь представлены настройки содержит волокна в сочетании входных лазеры для возбуждения многоцветные и коммерческого освещения руку в пути возбуждения, который позволяет запрограммированы контроля возбуждения угла, чтобы переключаться между epi режиме и в режиме МДП. В пути выбросов съемный homebuilt Цилиндрические линзы кассету помещается внутри тела микроскоп для 3-D визуализации SR, и коммерческие пучка сплиттер помещается перед EMCCD камеры, которые могут быть выборочно включены обнаружить множественные каналы выбросов одновременно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Микроскоп проектирование и монтаж
-
Возбуждения путь
Примечание: Возбуждения путь включает лазеры, дифференциальной помехи контраст (DIC) компоненты, Микроскоп тело и его руку освещения.- Подготовьте таблицу оптически изолированы вибрации. Например структурные демпфирования Таблица 48 x 96 x 12'' дает достаточно места для всех компонентов.
Примечание: Построение set-up в комнате с контролем температуры (например, 21,4 ± 0,55 ° C). Стабильность температуры имеет решающее значение для поддержания оптическое выравнивание. - Установите Микроскоп орган, который оснащен с arm освещения для волоконно-оптических соединений, a 100 X нефти погружение TIRF объектива и компоненты DIC.
- Место четыре лазерных головок (647 Нм, 561 Нм, 488 нм и 405 нм, окружили в рис. 1B) и их тепла раковины на таблицы оптики, и убедитесь, что излучаемый лазерные лучи имеют те же высоту и являются, как можно обеспечить хорошую стабильность (например короче 3'').
Примечание: Если лазерная головка находится на высоте короче чем другие лазеры, положите алюминиевой пластины с достаточной толщины под ним. Всегда обеспечить максимальный контакт между радиаторами и таблицы оптики для лучших тепловыделение (рис. 1B). Лазеры должны быть достаточно мощными для SR изображений. Смотрите таблицу материалов. Рекомендуется иметь лазерного фильтры очистки перед диодных лазеров. - Установите карточку приобретение данных через интерфейс периферийных компонентов соединительный (PCI) в рабочую станцию и подключите лазеры с этой картой. Контролировать поведение ON/OFF лазеры, Транзисторно транзисторная логика (ТТЛ) выход и их регулировка мощности, аналоговый выход этой карты (рис. 1 c). Установите надлежащий микроскопии изображений (коммерческого или homebuilt) контролировать сбор данных карты, а также Микроскоп тела.
- Смонтируйте их соответствующих крепления зеркала и дихроичный пучка сплиттер (590, 525 и 470 длинный пас фильтры). Используйте очень стабильная зеркало монтирует для зеркала. Используйте круговые сплиттеры с стопорного кольца, чтобы избежать любой изгиб дихроичных пучка сплиттер (рис. 1 d).
- Место зеркала и дихроичный пучка сплиттер оптический таблицы, чтобы объединить лазерные лучи (рис. 1B). Для достижения наиболее стабильных выравнивание, сделать целую договоренность как компактный, насколько это возможно и использовать 1''-толщина оптических должностей. Организовать лазеры, так что короче длина волны лазеров ближе к волоконно-оптических муфта (рис. 1B), так как короткие волны света рассеивается более в воздухе.
- Объедините лазерных лучей в одномодовое оптоволокно. Чтобы сделать это, построить волокна стяжки в клетке системы через следующие шаги:
- Подключите адаптер плиты в гору перевод по оси z (Рисунок 1E, левой панели).
- Смонтировать Дуплет ахроматический объектив (Фокусное расстояние = 7,5 мм) в клетке пластине (Рисунок 1E, вторая группа слева).
- Подключите две части выше, удлинительных штанг сформировать в клетке. Установите клетку таблицы оптики с монтажными кронштейнами на 1''-толщиной оптического сообщения (Рисунок 1E, средняя группа).
- Совместите сначала 647-Нм лазер с одномодовое оптическое волокно (FC/APC конец стяжка).
Примечание: Предварительное выравнивание с помощью волоконно-оптических многорежимный перед использованием одномодовое оптическое волокно может помочь процесс выравнивания. Регулировка углов установки зеркала и дихроичный пучка сплиттер (рис. 1 d, путем регулировки ручки), а также расстояние между Дуплет ахроматические линзы и адаптер плита (Рисунок 1E, регулируя z-axis перевод гора) для получения Выходная мощность максимальная лазера через волокна. - После выравнивания первого лазера, временно установить пару ирисов и выровнять остальные лазеров по одному (Рисунок 1F). Проверьте эффективность выравнивания с измеритель мощности.
- Оставьте одну Ирис передней пластины адаптера для уменьшения отражения лазеров.
Примечание: Сильные обратно размышления может сократить срок службы лазерных источников. При необходимости оптический изолятор может устанавливаться перед каждой Лазерная головка полностью удалить размышления.
- Подключите другой конец оптоволоконного освещения руку микроскопа (рис. 1 H).
- Проектирование и установку «увеличение объектив (МАГ)» через следующие этапы:
Примечание: Лазеры могут быть использованы для визуализации epi флуоресценции образца, но узкий пучок размер каждого лазерного ограничивает освещенную зону образца в несколько раз меньше, чем фактический размер соответствующего датчика камеры, район особенно для новых камеры (с 18,8 мм Длина диагонали, по сравнению с обычными 11,6 мм длины). Таким образом желательно расширить луча для достижения большего и льстить освещение образца.- Дизайн mag объектива, который может поместиться в руку освещения (рис. 1 H).
Примечание: Конструкция объектива mag зависит где она будет установлена. Рисунок 1 H показывает пример установки освещения руку, но он может быть установлен в любом месте после лазерных лучей коллимированных (см. обсуждение). Его дизайн с компьютерного проектирования и разработки программного обеспечения. - Место два ахроматические линзы, одной вогнутой (Фокусное расстояние = f1) и один выпуклый (Фокусное расстояние = f2) в держатель объектива домашний mag (рисунок 2A и 2 C), с расстоянием, равным сумме их фокусных расстояний, f1 + f2 = (-25) + 50 = 25 мм (рис. 2B).
Примечание: С этим выбором фокусных, маг линза расширяет луч, f2/ | f1| = 2 складки. Маг объектив обеспечивает универсальность. Это могут быть удалены для возобновления регулярного освещения без расширения балки (Рисунок 2D) или вставлены в обратном направлении, чтобы сфокусировать лазерный луч для достижения сильной интенсивности возбуждения.
- Дизайн mag объектива, который может поместиться в руку освещения (рис. 1 H).
- Подготовьте таблицу оптически изолированы вибрации. Например структурные демпфирования Таблица 48 x 96 x 12'' дает достаточно места для всех компонентов.
2. выбросов путь
Примечание: Выбросов путь состоит из съемных Цилиндрические линзы, колесо фильтр барьер, разделитель выбросов и EMCCD камеры (рис. 1 g). Для достижения лучших точки распространения функция (PSF) из одной молекулы, Призма DIC ставится вдали от объектива.
- Пользовательские Дизайн кассеты цилиндрические (3-D объектив), который может поместиться в ручной анализатор DIC вставить слот в организме микроскоп (рис. 3 c).
Примечание: Этот дизайн не компромисс анализатор DIC, поскольку блок анализатор может быть вставлен в башне фильтр. - Место 3-D объектив фокусное расстояние 10 м в кассету и вставьте его в путь луча выбросов для создания эффекта астигматизм, необходимые для извлечения каждый одной молекулы14координата z.
Примечание: При необходимости, кассеты с 3-D объектив может помещаться в или из пути выбросов (рис. 3 c). - Установите многополосный дихроичных пучка сплиттер в башне фильтр внутри тела микроскопа.
- Установите фильтры выбросов.
Примечание: Фильтры выбросов выбираются в зависимости от предпочтительного флуорофоров. В зависимости от модуля обработки изображений используются фильтры выбросов, размещены в разных местах, как описано ниже:- Для последовательного многоцветные epi флуоресценции изображений или изображений SR использовать фильтры выбросов в барьер фильтра колесо связаны рядом с телом микроскоп для сведения к минимуму вибрацию в организме микроскопа при переключении канала (рис. 1 g).
- Для одновременного обнаружения многоцветные (например, smFRET экспериментов) место другой фильтр в выбросов разделителя (проверить шаг 4 для подробной информации).
Примечание: Как правило, коммерческие выбросов разделитель имеет два переключаемых режима (то есть, «участие» или «обойти» режимы). Для разделения выбросов огни хроматически для одновременного многоцветные изображения («занято» режим), используется фильтр куб, проведение двух дихроичных пучка сплиттер и три фильтра выбросов («тройной куб, « фигура 4 c и 4 D). Пустой слот в барьер фильтра колесо используется в сочетании с тройной куб. С другой стороны для последовательного многоцветные изображения, тройной кубов заменяется куб, который просто имеет зеркало внутри («обход куб, « Рисунок 4A и 4 D).
- Установите камеру EMCCD как последняя часть пути выбросов. Используйте подключения USB-PCI для достижения высокой частоте кадров.
Примечание: EMCCD камеры рекомендуется для наиболее чувствительных обнаружения одной молекулы, но расширенные sCMOS камеры может быть альтернативой.
3.-дифракционный изображений с Epi возбуждения
- Отрегулируйте возбуждения лазеры случайный угол epi-режим освещения руку.
- Освободите 3-D объектив если участвуют (рис. 3 c, правая панель).
- Вставьте в обход куб в разделитель выбросов (рис. 4A и 4E, Нижняя панель).
- (Необязательно) Вставьте mag объектив для расширения освещения области (Рисунок 2D, левой панели).
Примечание: С помощью mag объектива и 100 X нефти погружение объектива, около 91 x 91 мкм2 может быть освещен ровно, устраняя необходимость использования источника белого света и несколько кубов фильтр. - Использование микроскопии изображений программное обеспечение для многоканальных, Z-стека или промежуток времени изображения.
Примечание: Существует несколько программ для микроскопии изображений, не только от Микроскоп производителей, но и от сторонних компаний или разработчиков открытого исходного кода.
4. Многоканальные сингл молекула изображений, включая smFRET
Примечание: Перейти к «пустой» позиции в барьер фильтра колесо, так что все излучение с любой длиной волны может достигать до второй набор фильтров/дихроичных луч сплиттеры в выбросов разделителя.
- Многоцветные сингл молекула автоопределения иммобилизованных поверхности молекул15 с использованием TIRF возбуждения, включая измерение smFRET, настройте случайный угол возбуждения лазеры на угол TIRF. Разъединение объектива маг и 3-D объектив.
- Трехканальный режим заниматься выбросов разделителя (рис. 1 g) через следующие этапы:
- Заменить обход куб с кубом «калибровка» что позволяет свету проходить через все каналы (рис. 4B и 4E).
- Включите камеру под ДВС (то есть, фильтр не выбросов в колесе фильтр барьер) и регулировки диафрагмы разделителя выбросов до тех пор, пока три полностью отдельные каналы появляются на экране.
Примечание: Проведите этот шаг с номер свет горит, чтобы визуализировать все каналы. - Вертикальная/горизонтальная регулировка ручки управления включите выбросов разделителя и приблизительно выровняйте трех каналов (Рисунок 4E и 4F).
- Выключите камеру и заменить калибровки куб с тройной Куба (рис. 4 c и 4E).
- Поместите образец с 100-Нм многоканальные бисер на вершине 100 X объектив и сосредоточиться на образце.
- Включите камеру и 488 нм лазер, увеличить на один из ярких бусин и мелко выровнять трех каналов, повернув регулировки ручки управления снова (Рисунок 4E и 4 G).
Примечание: 100 Нм многоканальные бисер выделяют различные длины волн света на 488 нм возбуждения, включение 3 канальный выравнивания.
- Включите камеру и лазеры, фокус и найти хорошее положение с разумной пятно плотностью. Отрегулируйте время мощности и воздействия лазера для достижения приемлемого уровня сигнала к шуму и Фотообесцвечивание. Использование микроскопии изображений принять промежуток времени изображения.
5. SR изображений
Примечание: Это сингл молекула на основе обнаружения SR микроскопии.
- Чтобы настроить SR изображений, вставьте 3-D объектив и удалить объектив маг. Установите время экспозиции камеры в соответствующий лазерный каналов (например, 5-60 мс). Определить и вручную установить оптимальный возбуждения лазеры случайный угол угол TIRF.
- Поместите образец в SR визуализации буфера16. Разрешить буфер, чтобы сбалансировать для по крайней мере 10 минут до изображений.
Примечание: SR визуализации буфера истекает после примерно 1 h, так что новый SR визуализации буфера соответственно. - Возьмите DIC изображения до SR изображений. С целью нахождения надлежащих объективных высоту для SR, которая оптимизирует эффект астигматизма, используйте DIC изображений найти средней плоскости клетки. Определение плоскости на высоте, на которой клетки переход от «свет» в «темные» образы и появляются стать прозрачным (Рисунок 5A, 5Bи 5 C). Как только желаемый фокальной плоскости определяется, заниматься коррекции системы z смещения (рис. 1A).
- Проводить SR изображений. Измените мощность лазера 405 нм для поддержания разумного плотность «мигает на» пятна.
Примечание: Хотя это можно изменить 405 нм лазер вручную, это более удобно для запуска код приобретение запрограммированных данных для поддержания плотности «мигает на» пятна. Вот пример того как это осуществляется автоматически. Исходный код доступен по запросу (рис. 6).- Начало обработки изображений приобретения с 0 Вт/см2 фиолетовый лазер мощностью.
- Подсчитать количество мигает на места в течение определенного периода.
- Модулировать фиолетовый лазерного луча, так что количество мигает на пятна хранится выше определяемых пользователем «подсчета порог» в поле зрения. Увеличьте мощность фиолетового лазера, когда количество мигает на пятна падает ниже порогового значения подсчета.
- Прекратить приобретение, когда количество мигает на пятна падает ниже порога подсчета, используя мощность максимальная фиолетового лазера.
Примечание: Максимальная можно задать по-разному в зависимости от яркости образец, но не более чем 130 Вт/см2. В зависимости от фактической цели SR изображений этот код автоматического приобретения вручную может быть прекращено в любой нужный момент.
- Проверьте мигающий поведение и PSFs пятна вскоре после начала приобретения.
Примечание: Если мигающий поведение не является идеальным, измените возбуждения лазеры случайный угол или заменить буфере визуализации. Ожидаете выборки «вертикальной», «горизонтальной» и «алмаз» формы ПСФ, представляющие флуорофоров ниже, выше и в пределах фокальной плоскости, соответственно (рис. 5 d). Если большинство пятен Показать вертикальные или горизонтальные PSFs, затем фокальной плоскости отключен от центра клетки, так прекратить эксперимент и повторно настроить фокальной плоскости. Наличие воздушных пузырьков в Масло иммерсионное или другие местные факторы могут повлиять на PSFs качества, поэтому оно может быть необходимо заменить масло или изменить на другую область изображения образца. - Для анализа данных используйте open source (в плагинов NIH ImageJ) или коммерчески доступные коды для обнаружения центроиды каждое пятно в каждом кадре изображений и извлечь z значения каждого пятна от x - и y ширина14.
Примечание: В настоящем докладе, исходный код, первоначально разработанный в одной из ранних одной молекулы на основе обнаружения SR8 была изменена для 3-D обнаружения16 и был использован. - В случае двух цветные изображения, изображение Флюорофор с больше длины волны возбуждения, следуют один с короче длина волны возбуждения. Запустите код автоматического приобретения аналогично описанному в шаге 5.4, но с помощью различных изображений лазера.
Примечание: следует исправить хроматические аберрации между изображениями с различными флуорофоров (например, красный краситель и желто зеленый краситель). Вот шаги.- Иммобилизации несколько 100 Нм многоканальные бисер на стекло coverslip, избегая формирования кластеров.
- Возьмите изображения их в каналах различных возбуждения.
- Экстракт их (X, Y, Z) координаты программного обеспечения (шаг 5.6).
- Участок ΔX,я = X1i - X2i и ΔYi = Y1i - Y2i (я это для разных бусинок, и 1 и 2 являются различные цветовые каналы) отдельно и соответствовать их соответствующие функции. Сохраните функции.
Примечание: Линейной функции достаточно в большинстве случаев. После того, как эти функции определены, это измерение не должны повторяться каждый раз изображений. - В фактической визуализации SR-двухцветный образца интерес, применить функции к правильным (X, Y) хроматической аберрации. Для z направленного хроматических аберраций, проводить его путем получения ΔZ = Z1 -2 Z для многоканальные бисер или известных многоканальный образцов посеян вместе с образцом интерес.
Примечание: в отличие от (X, Y) хроматические аберрации, z направленного хроматической аберрации не хорошо воспроизводимые в каждом эксперименте, главным образом из-за неполной z направленного фокус обслуживание при переключении каналов. Таким образом рекомендуется проводить коррекцию каждый раз. ΔZ = Z1 - Z2 главным образом независимо от (X, Y), так что просто несколько шариков или эталонных образцов будет достаточно за каждого образца области интересов. Сюжет построен окончательного изображения-двухцветный SR в 3-D визуализации программного обеспечения и вручную проверить ΔZ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот микроскоп позволяет гибкое и воспроизводимые переключения между различными методами обработки изображений. Здесь мы покажем примеры изображений, собранных с каждым тепловизионный модуль.
Рисунок 5 d демонстрирует ПСФ мигает на молекулы во время приобретения SR. Тысячи таких изображений реконструированы для создания окончательного изображения SR (Рисунок 5E). 5E рисунок показывает же бактериальных регулирования РНК, как показано в изображении epi флуоресценции в Рисунок 7а. Рисунок 7 показывает изображения представитель epi флуоресценции небольшой регулирования РНК в клетках Escherichia coli и мРНК в mammalian клетках U2OS. Обе RNAs помечены меткой Флюорофор ДНК oligo через в situ гибридизация17. На рисунке 8 показана представитель smFRET измерение сложенном молекул РНК, помечены доноров краситель (зеленый краситель) и акцептор краситель (красный краситель). Комплексы, иммобилизованных на микроскопа и возбужденные TIRF освещения. Траекторий интенсивности флуоресценции могут быть извлечены из отдельных одной молекулы, генерации ладу эффективность как функцию от времени.
Рисунок 1: конструкция микроскопа set-up. (A) Эта панель показывает схему установки. M = зеркало, DBS = дихроичных пучка сплиттер, LCF = лазерная Очистка фильтра, я Ирис, L = = объектив, AP = пластина адаптера, ЗТМ = z-axis трансляционная горе, о = волоконно-оптических, ОФК = волоконно-оптических муфты, CL = Цилиндрические линзы, TL = трубка объектива EF = выбросов фильтр(-ы), Obj = цель объектив и SM = шагового двигателя. Система коррекции z дрейф перемещает шагового двигателя на Стволы пожарные объектива в противоположном направлении z дрейф, который рассчитывается путем инфракрасного (ИК) сигнал формируется свой собственный индикатор и определяется его собственный детектор. (B) Эта группа показывает лазерного возбуждения Ассамблеи. Четыре лазеры объединяются через зеркала и дихроичный пучка сплиттер и затем направляются в оптическом волокне через фокусирующей линзы и пластина адаптера, сидя на поступательной горе (внизу рисунка). (C) Эта группа показывает модуляции лазера. Два штык Нейл-Concelman (BNC) кабели подключены к каждому из лазера (руководитель или контроллера, в зависимости от производителя) для TTL и аналоговый модуляции (левой панели). BNC кабелей объединяются в один кабель (средняя группа), который подключен к сбор данных карты в Рабочая станция (на правой панели) для управления компьютером. (D) Эта группа показывает зеркало и дихроичный пучка сплиттер монтирует. (E) строительство волоконно стяжки в клетке системы. Пластина переходник волокна (AP) монтируется в гору перевод по оси z (ЗТМ) так, что можно модулировать его расстояние ахроматического двойной линзы (L1, вид сбоку показан). AP и ЗТМ имеют соответствующие потоки, так же, как L1 и пластину клетке. (F) A пара ирисов (окружает) устанавливаются при процедуре выравнивания для нескольких лазеров. Они используются для обеспечения что 647-Нм лазер (левая панель) и 561 Нм лазер (правая панель) пройти через тот же путь. (G) A частичную часть выбросов пути показано. Вне тела Микроскоп выбросов фильтра колесо, разделитель выбросов и EMCCD камеры устанавливаются в порядке. (H) Эта группа показывает освещения кронштейна. Маг объектив вставляется в руку освещения. Лазерные лучи возбуждения отправляются на освещение руку через оптическое волокно и волоконно-оптических муфты (в правой части рисунка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: линзы маг. (A) Эта группа показывает ортогональной проекции владельца жилья линзы для увеличения лазерные лучи (единицы: мм). Этот проект предназначен для вписывается в руку освещения. (B) Эта группа показывает внутренний чертеж отверстие в держателе, где две линзы получить в. L1 является вогнутой линзы L2 является выпуклой линзы, и расстояние между ними является суммой их фокусных. (C) это фото mag объектива. (D) объектив маг может быть вставлен в освещение руку, чтобы расширить или фокусировки лазерные лучи (слева) или могут быть удалены, чтобы сохранить лазерных лучей, без изменений (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: 3-D объектив. (A) Эта группа показывает ортогональной проекции держателя, имеющий пустой круглое отверстие для режима байпаса и прямоугольное отверстие для проведения Цилиндрические линзы (единицы: мм). Этот проект предназначен для быть подходят для ДВС анализатор ползунок в теле микроскопа. (B) это фото 3-D объектива. (C) Цилиндрические линзы могут заниматься на пути луча выбросов вызвать PSFs с астигматизмом (слева) или может отключаться для режима байпаса, сохраняя PSFs нетронутыми (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: многоканальный выравнивание разделителя выбросов. Схемы оптики и путь света показаны в выбросов разделитель с (A) обход куб, (B) куб калибровки и (C) тройной куб. M = зеркало. В обход куб имеет зеркало внутри (M5) и должен использоваться с фильтром выбросов (EF) в колесе фильтр барьер. Калибровка куб имеет луч сплиттеры (BS), которые позволяют огни, чтобы пройти через все каналы. Тройной куб имеет два дихроичных пучка сплиттер (DBS), а также три фильтра выбросов. (D) это фотографии из трех кубиков. (E) внутренних выбросов разделителя показано без Куба (Верхняя панель) и скольжения в куб (Нижняя панель). М3 за M4 и не захватили в фотографии. Ручки управления для зеркала находятся на вершине выбросов разделителя (верхняя группа). (F) Эта группа показывает выравнивание канал с помощью Куба калибровки под ДВС. (G) Эта группа показывает прекрасный выравнивание зеленого (Верхняя панель) и красный (средняя группа) каналов с использованием 100-Нм многоканальные бисер и тройной куб. Объединенное изображение двух каналов также показано (Нижняя панель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: получение изображения представитель SR. Эти панели показывают представитель DIC изображения (A) ниже, (B) на, или (C) выше центральной плоскости клетки. (D) Эта группа показывает пример ПСФ флуорофоров мигает на. Оранжевый круг окружает «вертикальной» PSF. Зеленый круг окружает «горизонтальной» PSF. Синий круг окружает ромбовидной ПСФ, представляющие флуорофоров на плоскости целенаправленного. (E) Эта панель показывает, что представитель реконструирован SR изображения. Некодирующие РНК регулирования помечается флуоресценции в situ гибридизация с красной краской. Белые границы Марк края ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: код приобретение запрограммированных данных для визуализации SR. В этом модуле программируемые приобретения различные команды и функции управления микроскопом перечислены на левой панели и может быть выбран для создания запланированных приобретения кода. Команды выполняются последовательно сверху вниз. Этот снимок экрана показывает пример, где заранее определенное количество повторных изображений поглощения проводятся до тех пор, пока приобретение ставится и рассчитывается количество мест в трех последовательных фотошоп. Если среднее количество этих пятен выше порога (определяемой как 50% от числа клеток в бактериальных изображений), получение изображения продолжается в том же цикле. Если ниже порога, то получение изображения продолжается в следующем цикле, где используется сильнее сила фиолетового лазера (вырезать в нижней части экрана). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: представитель epi-флуоресценции изображений. (A) Эта панель показывает небольшой регулирования РНК в клетках E. coli . (B) Эта группа показывает мРНК в mammalian клетках U2OS. РНК помечены красной краски и синий краситель через флуоресценции в situ гибридизация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: пример smFRET томографии. (A) образцы были в восторге с 561 Нм лазер. (B) выбросы из зеленых и красных красителей собираются одновременно и показано как Грин (справа) и пятна красные (слева), соответственно. (C) Эта группа показывает представитель флуоресценции интенсивности против времени траекторий зеленый краситель (зеленый) и красного красителя (красный) из одной молекулы. (D) группа показывает ладу эффективность против времени траектории (сплошной синей линией) рассчитывается как яакцептора/ (ядоноров + яакцептор) из одной молекулы образца. Трассировка ладу оснащен скрытой марковской модели (пунктирная красная линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот Микроскоп гибридной системы исключает необходимость покупки нескольких микроскопы. Общая стоимость всех частей, включая таблицы оптики, таблице трудовых установки, программное обеспечение и рабочей станции, это около $230000. Обработанные пользовательских частей, включая mag объектив и 3-D объектив, стоимость около $700 (стоимость зависит от фактических расходов в различных институтах). Типичный коммерчески доступных интегрированных систем для одной молекулы на основе обнаружения SR микроскопии стоить более $300000 ~ 400000 и не легко доступны для измерения smFRET, или epi изображений для разумной поле зрения, без белый свет Источник. Таким образом представленный здесь подход можно добиться визуализации возможности эквивалентна нескольким Микроскопы по значительно сниженной цене.
Эта система модуляции микроскоп может основываться на Микроскоп органов от разных производителей. Объемная линза потенциально может устанавливаться в любом положении в пути выбросов, включая внутри выбросов разделителя в организме Микроскоп, или свободного пространства между фильтра колесо и объективных Стволы пожарные. Однако физическое расположение 3-D объектив будет определять его фокусное расстояние для достижения лучшего эффекта астигматизм для 3-D визуализации SR. Мы рекомендуем начать с фокусным расстоянием 10-м. Маг объектив является по существу расширитель луча установлен в пути возбуждения. Если возбуждение лазеры, воздух в сочетании (т.е., без оптического волокна), она тривиальна для установки объекта expander в любом месте после коллимированного лазерных лучей. Если возбуждение лазеры, волокна в сочетании, то искать дополнительных слотов для установки двух линз (один вогнутые и другая выпуклая). Например многие коммерческие освещение оружия имеют слоты для фильтров нейтральной плотности. Найти две линзы с суммой их фокусных, равной расстоянию между двумя слотами. Затем они могут быть вставлены как маг объектив. Кроме того крепление для ползунок диафрагмы области может быть еще одно место, если таковые имеются. Строительство mag объектива в съемной кассеты имеет дополнительное преимущество, позволяя один сосредоточиться возбуждения лазеры для достижения высокой мощности, которые могут оказаться необходимыми для SR изображений, просто путем ориентации магнитного объектива.
В настоящем докладе мы продемонстрировали гибкий переключение между три различные методы обработки изображений, модулированные микроскопе. Эта настройка может использоваться для более широкого и более продвинутых приложений. Например конфигурация SR может использоваться для отслеживания в живых клеток на фото переключаемый сингл частицы или photoactivatable флуоресцентный протеин тегами биомолекул из интереса18,19. SmFRET конфигурация может использоваться для изучения молекулярных взаимодействий в в естественных условиях систем20. Выбросов на основе разделитель многоканальный обнаружения может сочетаться с SR конфигурации для выполнения двух цветные SR изображений или отслеживания одновременно21одно частиц.
Эту структуру можно расширить для включения более модулированного компонентов. Например можно добавить еще один слой башни и освещения отсека фильтров, так что допэмиссия возбуждения пути могут быть созданы для дополнительных каналов, таких как один с инфракрасный (ИК) лазер для изображений образцов, помечены ИК красители. Помимо изображений добавлен канал, ИК лазеров может использоваться для исправления дрейф этап в SR изображений во время визуализации приобретения или во время анализа. Для коррекции смещения во время визуализации приобретения если от Микроскоп производителя, не доступна система коррекции z дрейф альтернативной системы с ИК лазер может быть либо homebuilt14 или приобретены у сторонних компаний. Для коррекции после приобретения дрейф ИК-лазер может использоваться для отслеживания фидуциальный маркеров. 22
Одноместный молекула на основе обнаружения SR микроскопии требует два комплекта программного обеспечения, один для сбора данных и один для анализа данных. Для сбора данных, даже простой homebuilt программное обеспечение, которое принимает изображения с помощью камеры контролируя лазеры ON/OFF поведения может работать для создания изображений SR, хотя это можно вручную модуляции мощности лазера 405 нм, например, повернув установлен перед лазерной градиентный фильтр нейтральной плотности. Однако этот способ ведения эксперимента зависит от субъективной оценкой экспериментатора плотности мигает на пятна. Таким образом этот способ не является объективной и не могут быть пригодны для количественного определения SR, визуализации данных. Код сбора данных, используемый здесь включает месте обнаружения / алгоритм подсчета голосов во время сбора данных, включение автоматического модуляции мощности лазера 405 нм на основе плотности мигает на пятна (рис. 6). В настоящее время некоторые производители Микроскоп обеспечивают программируемых модулей визуализации, поэтому можно использовать эти, или искать плагинов из открытых источников, как микро-менеджер. Для анализа данных можно использовать коммерчески доступных модулей от Микроскоп производителей или искать плагинов из открытых источников как ImageJ.
В резюме представленные здесь обеспечивает высокую универсальность и легко переключаться между различных изображений конфигураций по сниженной цене и пространства. Эта настройка является относительно легко принять любой научно-исследовательской лаборатории в биологических наук с необходимостью для рутинных и визуализации различных экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
J.F. выражает поддержку от программы ученых Сирл и директор NIH новый новатор премии. Авторы признают полезные предложения от Paul Selvin лаборатории (Иллинойский университет, г. Урбана-Шампейн) для позиционирования 3-D объектива.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
References
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
