Her presenterer vi en protokoll for å bruke en anaerob hele celle mikrobiell biosensor for å vurdere hvordan ulike miljømessige variabler påvirker biotilgjengeligheten av Hg og Cd for bakterier i anoksisk miljøer.
Kvikksølv (Hg) biotilgjengelighet for mikrober er et viktig skritt til giftige Hg biomagnification i næringskjeder. Kadmium (Cd) transformasjoner og biotilgjengelighet for bakterier styre hvor som vil akkumuleres i stift matavlinger. Biotilgjengeligheten av disse metallene er avhengig av deres artsdannelse i løsningen, men mer spesielt under anoksisk forhold der Hg er denaturert til giftige monomethylmercury (MeHg) og Cd vedvarer i rhizosphere. Hele celle mikrobiell biosensors gir et kvantifiserbare signal når et metall inn stoffer og er derfor nyttig verktøy å vurdere metall biotilgjengelighet. Dessverre har mest biosensing innsats så langt vært begrenset til oksisk miljøer på grunn av den begrensede evnen til eksisterende reporter proteiner til funksjonen i fravær av oksygen. I denne studien presenterer vi vår innsats for å utvikle og optimalisere en hel celle biosensor analysen kan fungere anaerob som kan oppdage metaller under anoksisk tilstand i kvasi sanntid og innen timer. Beskriver vi hvordan biosensor kan hjelpe vurdere hvordan kjemiske variabler gjelder miljømessig sykling metaller påvirker deres biotilgjengelighet. Følgende protokollen inneholder metoder for å (1) forberede Hg og Cd-standarder under anoksisk forhold, (2) – biosensor i fravær av oksygen, (3) design og gjennomføre et eksperiment for å finne ut hvordan en rekke variabel påvirker Hg eller Cd biotilgjengelighet og (4) å kvantifisere og tolke biosensor data. Vi viser lineær områdene av biosensors og gi eksempler viser metodens evne til å skille mellom metall bioavailability og toksisitet ved å benytte både metall-induserbart og konstituerende stammer.
Kvikksølv (Hg) er en global forurensende sin biotilgjengelighet til Hg methylating mikrober er første skritt mot sin biomagnification gjennom næringskjeder og mulig nevrotoksiske effekter i menneskelig og dyreliv1. Det er tenkt at mikrobielle Hg metylering er en intracellulær prosess som krever: i) artene av Hg skal bioavailable2,3,4,5,6,7 II) for cellen være fysiologisk i stand til methylating Hg8,9,10. Kadmium (Cd) bioaccumulates i organismer, men gjør ikke biomagnifies i foodwebs og er mye brukt i industrielle og kommersielle prosesser som vanligvis forårsaker akutt eksponeringer i mennesker og miljø11. Selv om mikrober spille flere sentrale roller i skjebnen til Hg i miljøet, fokus de fleste studier Cd geokjemi og økotoksikologi på mikrobiell eukaryoter12. Forbruket av jordbruksprodukter (f.eks ris) er hovedkilden til direkte eksponering mot kadmium; i dette tilfellet biotilgjengeligheten av Cd for mikrober av rhizosphere direkte påvirker mengden planter kan akkumulere13.
HG transport veier er komplekse og muligens involverer en aktiv transport trinn14. Når en transporter er involvert, siste verk foreslo at HgII bruker en ZnII eller MnII transporter7,15,16,17. Mens CdII er antatt transporteres tilfeldigvis i stoffer gjennom divalent metall transport veier (spesielt MnII eller ZnII) mekanismer for CdII transportere innsiden cellene forblir spekulative og ikke Cd-spesifikke transport veien har vært identifisert13,18. Uansett hva transportørene, tre mekanistisk faktorer til slutt bestemmer evne til metaller inn en celle: i) av metall artsdannelse i løsning2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) biophysiochemical egenskaper av cellemembranen17,24,25,26,27,28,29 ,30,31og iii) muligheten for metall til en transport område7,32. CD og Hg er usannsynlig å finnes som ledig ioner under mikrobiell fysiologisk relevante forhold på grunn av deres høy affinitet for oppløst organisk saken (DOM), chelaterande forurensninger (f.eks EDTA) eller redusert svovel moieties33, 34,35 (CdII kan finnes som en gratis ion eller skjemaet ion-parene i fravær av disse ligander). Det er en mangel på effektiv metoder å avgjøre hvordan disse metall artene er bioavailable under forhold som er relevante for deres skjebne i miljøet. For eksempel Hg er denaturert under anaerobe forholdene14, og både kadmium og Hg er myke metaller (eller klasse B kasjoner), som krever at deres artsdannelse undersøkes under forhold som opprettholde integriteten til redusert svovel grupper.
Mikrobiell biosensors er bakterielle celler som avgir et kvantifiserbare signal svar intracellulær konsentrasjonen av metall, i dette tilfellet Hg eller Cd. Som sådan, er de ideelt verktøy for å forstå hvordan metaller inn en celle36, forutsatt at eksponering forhold er nøye kontrollert. HG biosensors inneholder vanligvis genet fusjoner mellom regulatoriske krets av mer-operon (inkludert gener koding for transkripsjon regulator MerRas samt operatør og promoter regioner i operon) og rapportering gener (f.eks Lux, gfp, lac gener). Når kvikksølv i cytoplasma, vil det binde til MerR, noe som resulterer i transkripsjon av rapportering gener og påfølgende signal produksjon19,37. Bestemt Cd biosensors utformes vanligvis i cadC, cadAC, zntA eller zntR kodet transkripsjon regulatorer38, men det er verdt å merke seg at MerR har en lavere, men kvantifiserbare affinitet til Cd5. På grunn av aerobic begrensning av de fleste vanlig selvlysende eller fluorescerende reporter proteiner, inntil nylig mikrobiell biosensors forble ikke tilby innsikt i biotransformation av metaller under anoksisk forhold. Dette gjør anaerob påvisning av metaller biotilgjengelighet svært vanskelig over en rekke forhold gjelder for deres miljøskjebne, spesielt i nærvær av redoks følsom ligander (f.eks sulfide og thiols)4, 5 , 39.
For å avhjelpe de metodologiske hinderet å live bildebehandling i fravær av oksygen, Drepper et al. (2007) har utviklet en flavin-baserte fluorescerende protein (FbFp), basert på lys oksygen spenning domene SB2 protein fra P. putida. Denne protein familien er kjøpedyktig fluoresce i fravær av oksygen40. Bygge på arbeidet til Drepper et al., utviklet vår lab en anaerob biosensor muliggjør studiet av Hg biotilgjengelighet under oksisk og anoksisk og over et bredt spekter av saltholdighet 17. I dagens papir beskriver vi hvordan å forberede og bruke biosensor for å teste miljøvariabler innflytelse på Hg eller Cd biotilgjengelighet. Selv om vi utviklet biosensor HgII, valgte vi å utføre eksperimenter med CdII å trekke leserens oppmerksomhet til det faktum at biosensors også kan svare til flere stressfaktorer som co opptrer i miljømessig matriser; i dette tilfellet CdII ble undersøkt fordi det er kjent for å binde til transcriptional regulator MerR5. Her viser vi representant kalibrering og funksjonelle lineær områder med hensyn til enten metall. Vi også gi et eksempel når den biosensor resultater er avgjørende (MgII og MnII på Hg biotilgjengelighet) og mangelfulle (ZnII på Hg biotilgjengelighet).
Mikrobiell biosensors er nyttige verktøy til å identifisere mekanismer som bruker metall mikrober. Her beskriver vi en metoden det anaerob kan kvantifisere HgII og CdII biotilgjengelighet Gram-negative verten celle (E. coli) og gi en målbare resultat i noen timer. En av de store styrkene til denne protokollen er at den tillater omfattende kontroll av metall artsdannelse i eksponering medium ved å unngå sterke bindende ligander eller komponenter som kan føre til metall nedbør. Metall artsdannelse er modellert og testet i denne eksponering mediet bruker PHREEQC17, men andre metall artsdannelse programvare kan distribueres. Hvis ingen ekstra ligander, Hg artsdannelse forventes å være til stede som 97% Hg(OH)2 og 3% Hg (NH3)22 +, mens Cd artsdannelse skal presentere som 59% Cd-β-Glycerophosphate, 25% Cd2 +og 16% CdSO4. Bruker en enkel termodynamisk modellering programvare, kan brukeren design eksponering media og teste biotilgjengeligheten av metall rundt. I tillegg biosensor vert cellen (E. coli NEB5α) er levedyktig over et bredt spekter av pH (5 8.5) og NaCl konsentrasjon (0-0,55 M)17.
HG metylering er en anaerob prosess, og protokollen i denne studien har ikke et behov for oksygen, slik at mer presis beskrivelse av anaerob stoffskiftet på metall biotilgjengelighet. Dette er viktig fordi oksygeninnhold endrer genet uttrykket profiler48,49 , og dermed potensial transportere baner; Derfor presenterer denne metoden en fordel over gjeldende exising aerobic alternativer. Den biosensing konstruere presenteres her kan potensielt brukes med andre anaerob verter som er mer relevante for kvikksølv metylering (f.eks Geobacter, Desulfovibrio), men kanskje mindre tett enn E. coli. En gjeldende begrensning av tilnærming presenteres her er at våre grensen for påvisning ikke har ennå nådd pM nivåer, i motsetning til eksisterende aerobic systemer4,19,37. Det er imidlertid viktig å merke seg at for å oppnå disse lav oppdagelsen grensene flere tiltak må tas44: jeg) ligand tillegg er nødvendig for å sikre at Hg forblir i løsningen og ikke adsorberes på mikrobiell cellen veggen (Hg vil bli irreversible bundet til celle overflaten thiols hindrer sin biotilgjengelighet25,27; se terskelen svaret for Hg i figur 3A), ii) endringer celle tetthet eller iii) endre den genetiske konstruere å inkludere transport proteiner av mer-operon ( merT og merP), økende Hg fluks inni cellen50,51. Disse endringene vil være gunstig oppdage lave konsentrasjoner av Hg, men ikke nødvendigvis ideelt når vurdere miljøvennlige relevante situasjoner. Mens tidligere kadmium biosensors finnes hovedsakelig som en “proof of prinsippet”, er de utformet i komplekse medier som ikke tillater etterforskeren å vurdere rollen artsdannelse på biotilgjengelighet41,42, 43 , 44.
Biosensor er en utrolig nyttig verktøyet å bestemme mekanismer som metall arter er bioavailable. Fordi verten organisme ikke er en Hg-methylator, kan det bare brukes til å utvikle en modell for hvordan Hg kan angi Gram-negative bakterier og ikke en definitiv begrunnelse for hvordan Hg-methylators skaffe Hg. Det finnes andre metoder for å bestemme Hg biotilgjengelighet, som metylering, som et resultat av opptak eller bruk av en masse balanse tilnærming10,15,20,45,46. Som blir sagt, tilbyr metoden presenteres her fordelen av kvasi sanntid biotilgjengelighet data i levedyktig celler. Vi anbefaler ikke at denne metoden brukes å kvantifisere totale Hg eller Cd nivåer i en miljømessig matrise. Til tross for den foreslåtte bruken av biosensors å bestemme metall konsentrasjonene i miljøet36, er mange lettere tilgjengelig standard metoder tilgjengelige som ICP-MS, FAAS (for Cd analyse) eller kald damp atomic absorpsjon spektroskopi (for Hg analyse). Biosensor kan imidlertid brukes til å fastslå om en gitt miljømessige matrise har potensial til å forbedre eller hemme biotilgjengelighet; Dette oppnås ved å utføre standard filer.
PH i media eksponering kan endres til hvor som helst innen 5 og 8.5, forutsatt MOPPER gratis syre (buffer) utveksles med alternative gratis syre en buffer med den aktuelle pKa (se listen over aktuelle buffere (Ferreira et al. (2015) 47) og justert med KOH til riktig pH når media eksponering. I tillegg metoden er ikke begrenset til Hg og Cd, men kan bli utvidet til andre metaller med andre transkripsjon regulatorer.
Eksponering analysen kan endres for å utforske påvirkning av andre elektron acceptors som O2 og fumarate på Hg eller Cd biotilgjengelighet. Mindre endringer til metoden å utnytte både O2 og fumarate som elektron acceptors er tilgjengelig på forespørsel.
Oppsummert ønsker vi å understreke følgende punkter: jeg) er det viktig at konsentrasjonen av Cd eller Hg aksjer er kjent i trinn 2, som dette vil bli brukt til å kalibrere biosensor. II) eksponering dag, veksten av celler må stoppes på et OD600 på 0,6 (± 0.1) og at omsorg tas når resuspending cellekulturer, som biosensor er kalibrert til denne cellen tetthet. III) endelig er det viktig at eksponering mediet er laget omhyggelig ved eksponering. For å sikre suksess for protokollen, flere kulturer bør dyrkes samtidig (å omgå muligheten for vekst svikt) og vekstmediet skal gjenvinnes ukentlig (for å omgå metastability av media og mulig smitte). Det bør også bemerkes at biologiske replikat (flere cellekulturer) express variasjon når det gjelder signal produksjon. Selv om fluorescerende svarene kan variere fra kultur til kultur, bør fluorescerende trender som svar på en gitt variabel forbli den samme gjennom mange biologiske gjentak.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke kommentarer fra to anonyme korrekturlesere som godt medlemmer av laboratoriet Poulain innsiktsfulle diskusjon på utviklingen av det anaerob biosensor. En tidlig forsker pris fra provinsen Ontario og Discovery stipend og en akselerator supplement fra naturvitenskap og Engineering Forskningsrådet Canada til A.J.P. finansiert denne studien.
7 ml standard vial, rounded interior | Delta Scientific | 200-007-20 | 34 recommended |
Vial tray, 21 mm openings | Delta Scientific | 730-2001 | 4 for (4 x 8 grid) |
24 mm Closure | Delta Scientific | 600-024-01 | 32 recommended |
LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50 | Corning | Corning 3931 | |
Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate | Corning | Corning 3651 | |
Anaerobic Chamber (glovebox) | The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 ± 2 % and 3 % H2 ± 2 %) | ||
Palladium catalyst | Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended. | ||
Microplate reader | |||
450 (±10) nM filter for the microplate reader | |||
500 (±10) nM filter for the microplate reader | |||
Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers | |||
Spectrophotometer | Modified for anaerobic culture tubes | ||
MA-3000 (mercury analyzer) | |||
pH probe | Any pH probe will work | ||
50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes. | |||
0.22 µm polyethersulfone syringe filter + syringe | |||
Sterile/clean glass bottles | For growth media and standards | ||
Sterile/clean plastic or PTFE bottles | For alkali solutions (NaOH/KOH) | ||
Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2 | |||
Sterile Milli-Q water | Autoclaved or filter sterilized is fine. | ||
Lysogeny Broth | |||
Analytical grade H2SO4 |