Vi præsenterer her, en protokol for at bruge en anaerob hele-celle mikrobielle biosensor til at evaluere hvordan forskellige miljøvariabler påvirke biotilgængeligheden af Hg og Cd til bakterier i iltfattige miljøer.
Kviksølv (Hg) biotilgængelighed til mikrober er et vigtigt skridt til giftige Hg Bioakkumuleringen i mad webs. Cadmium (Cd) transformationer og biotilgængelighed til bakterier kontrollere det beløb, der vil ophobe sig i korte fødevareafgrøder. Biotilgængelighed af disse metaller er afhængige af deres typebestemmelse i løsning, men mere især under iltfattige forhold hvor Hg er methylerede til giftige monomethylmercury (MeHg) og Cd fortsætter i rhizosfære. Hele-celle mikrobielle biosensorer give en kvantificerbar signal, når en metal ind i cytosol og derfor er nyttige værktøjer til at vurdere metal biotilgængelighed. Desværre, de fleste biosensing bestræbelser har hidtil været begrænset til oxic miljøer på grund af den begrænsede evne af eksisterende reporter proteiner til at fungere i mangel af ilt. I denne undersøgelse præsenterer vi vores indsats for at udvikle og optimere en helhed-celle biosensor assay funktionsdygtigt anaerobt der kan registrere metaller under iltfattige betingelse i næsten realtid og inden for timer. Vi beskriver, hvordan biosensor kan hjælpe med at vurdere hvordan kemiske variabler er relevante for den miljømæssige cykling af metaller påvirker deres biotilgængelighed. Følgende protokol omfatter metoder til at (1) forberede Hg og Cd-standarder under iltfattige forhold, (2) forberede biosensor i mangel af ilt, (3) design og Udfør et eksperiment for at bestemme, hvordan en række variabel påvirker Hg eller Cd biotilgængelighed, og (4) at kvantificere og fortolke biosensor data. Vi viser de lineære intervaller af biosensorer og give eksempler viser metodens evne til at skelne mellem metal biotilgængelighed og toksicitet ved at udnytte både metal-inducerbar og konstituerende stammer.
Kviksølv (Hg) er et globalt forurenende stof og dets biotilgængelighed til Hg methylating mikrober er det første skridt mod sin Bioakkumuleringen gennem mad webs og dens mulige neurotoksiske virkninger i menneskelige og dyreliv1. Det er i øjeblikket troede at mikrobielle Hg methylering er en intracellulær proces, der kræver: i) arterne af Hg skal være biotilgængelige2,3,4,5,6,7 og ii) for cellen at være fysiologisk i stand til at methylating Hg8,9,10. Cadmium (Cd) bioakkumulerende i organismer, men ikke ikke biomagnifies i foodwebs og er almindeligt anvendt i industrielle og kommercielle processer, der almindeligvis forårsage akut engagementer i mennesker og miljø11. Selv om mikrober spiller flere vigtige roller i Hg skæbne i miljøet, fokusere de fleste undersøgelser på Cd Geokemi og økotoksikologi på mikrobiel eukaryoter12. Forbruget af landbrugsafgrøder (fx ris) er den største kilde til direkte eksponering for cadmium; i dette tilfælde biotilgængelighed af Cd til mikrober af rhizosfære direkte påvirkninger af beløbet planter kan ophobes13.
HG transport veje er komplekse og muligvis indebærer en aktiv transport trin14. Når en transportør er involveret, seneste arbejde foreslog, at HgII bruger en ZnII eller MnII transporter7,15,16,17. Mens CdII er hypotese for at transporteres ved et uheld i cytosol gennem divalent metal transport veje (især MnII eller ZnII) mekanismer af CdII transport indeni cellerne forblive spekulative, og ingen Cd-specifikke transport pathway har været identificeret13,18. Uanset arten af transportvirksomheder involveret, tre mekanistiske faktorer i sidste ende bestemme metaller evne til at indtaste en celle: i) den metal typebestemmelse i løsning2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, ii) biophysiochemical egenskaber af cellemembranen17,24,25,26,27,28,29 ,30,31, og iii) evne til metal til at få adgang til en transport site7,32. CD og Hg er usandsynligt, at eksisterer som frie ioner på mikrobiel fysiologisk relevante betingelser på grund af deres høje affinitet for opløst organisk stof (DOM), chelaterende forurenende stoffer (fx, EDTA), eller reduceret svovl fraspaltning33, 34,35 (CdII kan eksistere som en gratis ion eller form ion-par i mangel af disse ligander). Der er en mangel på effektive metoder til at bestemme, hvordan disse metal arter er biotilgængelige under betingelser, der er relevante for deres skæbne i miljøet. For eksempel, Hg er methylerede under anaerobe betingelser14, og både cadmium og Hg er bløde metaller (eller klasse B kationer), der kræver, at deres artsdannelse undersøges under forhold, der opretholder integriteten af reduceret svovl grupper.
Mikrobielle biosensorer er bakterieceller, der udsender en kvantificerbar signal som svar på de intracellulære koncentrationer af et metal, i dette tilfælde Hg eller Cd. Som sådan, er de ideelle værktøjer til at forstå, hvordan metaller Indtast en celle36, forudsat at eksponeringsforhold er omhyggeligt kontrolleret. HG biosensorer indeholder typisk gen fusioner mellem de regulerende kredsløb af mer-operon (herunder gener kodning for transskription regulator MerRas samt operatør og promotor regioner af operonen), og rapportering gener (f.eks. Lux, normal god landbrugspraksis, lac gener). Når kviksølv findes i cytoplasma, vil den binde sig til MerR, hvilket resulterer i transskription af rapportering gener og efterfølgende signal produktion19,37. Særlige Cd biosensorer er normalt udviklet ved hjælp af cadC, cadAC, zntA eller zntR kodet transskription regulatorer38, men det er værd at bemærke, at MerR har en lavere, men alligevel målbare affinitet til Cd5. På grund af aerobe begrænsning af de fleste anvendte almindeligt selvlysende eller fluorescerende reporter proteiner, indtil for nylig mikrobielle biosensorer forblev ikke tilbyde indsigt i biotransformation af metaller under iltfattige forhold. Dette gør anaerob påvisning af metaller biotilgængelighed meget vanskeligt på en række betingelser er relevante for deres skæbne i miljøet, specielt i overværelse af redox følsomme ligander (fx sulfid og dithioler)4, 5 , 39.
For at afhjælpe den metodologiske forhindring af live imaging i mangel af ilt, Drepper et al. (2007) har udviklet en flavin-baserede fluorescerende proteiner (FbFp), baseret på lys ilt spænding domæne SB2 protein fra P. putida. Dette protein familie er købedygtig fluorescerer i mangel af ilt40. Med udgangspunkt i arbejdet i Drepper et al., designet vores lab en anaerob biosensor giver mulighed for undersøgelse af Hg biotilgængelighed under oxic og iltfattige forhold og over en bred vifte af saltholdighed 17. I den nuværende papir beskriver vi hvordan man kan forberede og bruge biosensor for at teste miljømæssige variabler indflydelse på Hg eller Cd biotilgængelighed. Selv om vi udviklet biosensor for HgII, valgte vi at udføre eksperimenter med CdII som et middel til at henlede læserens opmærksomhed på, at biosensorer kan også reagere på flere stressfaktorer, der kan forventes at samtidig forekomme i miljøet matricer; i dette tilfælde CdII blev undersøgt fordi det er kendt for at binde til det transkriptionel regulator MerR5. Her viser vi repræsentative kalibrering og funktionelle lineær intervaller med hensyn til enten metal. Vi giver også et eksempel når biosensor’s resultater er afgørende (MgII og MnII på Hg biotilgængelighed) og usikkert (ZnII på Hg biotilgængelighed).
Mikrobielle biosensorer er nyttige værktøjer til at identificere mekanismer som metaller interagerer med mikrober. Her, vi beskriver en metode, der kan anaerobt kvantificere HgII og CdII biotilgængelighed til en Gram-negative vært celle (E. coli) og give en kvantificerbar resultat inden for et par timer. En af de store styrker af denne protokol er at det giver omfattende kontrol af metal typebestemmelse på mellemlang og eksponering ved at undgå stærke binding ligander eller komponenter, der kan føre til metal nedbør. Metal artsdannelse har modelleret og afprøvet i denne eksponering medium ved hjælp af PHREEQC17, men andre metal artsdannelse software kan installeres. Ingen ekstra ligander, Hg artsdannelse forventes at være til stede som 97% Hg(OH)2 og 3% Hg (NH3)22 +, mens Cd typebestemmelse vil være til stede ved som 59% Cd-β-Glycerophosphate, 25% Cd2 +og 16% CdSO4. Ved hjælp af en simpel termodynamiske modellering software, kan brugeren designe eksponering medier og teste for biotilgængeligheden af metal af interesse. Biosensor vært celle (E. coli NEB5α) er derudover levedygtige over en bred vifte af pH (5-8,5) og NaCl koncentration (0-0,55 M)17.
HG methylering er en anaerob proces, og den protokol, der er skitseret i denne undersøgelse har ikke et krav for ilt, giver mulighed for mere præcis beskrivelse af anaerobe metabolisme på metal biotilgængelighed. Dette er vigtigt, fordi tilstedeværelsen af ilt ændrer gen expression profiler48,49 og dermed potentialet transport veje; derfor udgør denne metode en fordel frem for øjeblikket eksisterer aerob alternativer. Den biosensing konstruktion præsenteres her kan potentielt bruges med andre anaerobe værter, der kan være mere relevante for kviksølv methylering (f.eks. Geobacter, Desulfovibrio), men måske mindre tractable end E. coli. En nuværende begrænsning af tilgang præsenteres her er, at vores grænse for registrering endnu ikke har nået pM niveauer, i modsætning til eksisterende aerobe systemer4,19,37. Det er dog vigtigt at bemærke, at for at opnå disse lave påvisningsgrænser flere skridt skal tages44: Jeg) ligand tilføjelse er forpligtet til at sikre, at Hg forbliver i løsning og ikke adsorberes på mikrobiel cellevæggen (Hg vil være uoprettelige bundet til cellens overflade dithioler forhindrer dens biotilgængelighed25,27; Se tærskel svar til Hg i figur 3A), ii) ændringer til celle tæthed, eller iii) ændre genkonstruktion til også at omfatte transport proteiner af mer-operon (nemlig merT og merP), stigende Hg flux inde i cellen50,51. Disse ændringer ville være gavnlige i forbindelse med afsløring lave koncentrationer af Hg, men ikke nødvendigvis ideel ved vurderingen miljømæssigt relevante situationer. Tidligere cadmium biosensorer findes primært som en “proof of princippet”, var de designet i komplekse medier, der ikke tillader investigator at vurdere rollen som artsdannelse biotilgængelighed41,42, 43 , 44.
Biosensor er et utroligt nyttigt redskab til bestemmelse af mekanismer som metal arter er biotilgængelige. Fordi værtsorganismen ikke er en Hg-methylator, kan den kun bruges til at udvikle en model for hvordan Hg kan indtaste Gram-negative bakterier og ikke en endelig rationale for hvordan Hg-methylators erhverve Hg. Der findes andre metoder til bestemmelse af Hg biotilgængelighed, såsom methylering, som et resultat af optagelsen eller brug af en massebalance tilgang10,15,20,45,46. Når det er sagt, tilbyder metoden præsenteres her fordel af kvasi realtid biotilgængelighed data i levedygtige celler. Vi anbefaler ikke, at denne metode bruges til at kvantificere samlede Hg eller Cd niveauer i en miljømæssig matrix. Trods den påtænkte anvendelse af biosensorer til at bestemme metal koncentrationer i miljøet36, er mange mere let tilgængelige standard metoder tilgængelige som ICP-MS, Frederiksen (for Cd analyse) eller kolde damp atomic absorption spektroskopi (for Hg analyse). Biosensor kan dog bruges til at afgøre, om en given miljømæssige matrix har potentiale til at fremme eller hæmme biotilgængelighed; Dette opnås ved at udføre standardopløsninger.
PH af eksponering medier kan ændres til hvor som helst inden for intervallet af 5 og 8,5, forudsat MOPS fri syre (buffer) udveksles med en alternativ fri syre af en buffer med den bør pKa (Se venligst listen over relevante buffere (Ferreira et al. (2015) 47) og justeret med KOH passende pH-værdi, når du foretager eksponering mediet. Derudover metoden er ikke begrænset til Hg og Cd, men kan udvides til andre metaller ved hjælp af andre transskription regulatorer.
Eksponering assay kan ændres for at udforske andre elektronacceptorer O2 og fumarat indflydelse på Hg eller Cd biotilgængelighed. Mindre ændringer til metoden til at udnytte både O2 og fumarat som elektronacceptorer er tilgængelige efter anmodning.
I sammendrag, vi gerne vil fremhæve følgende punkter: jeg) det er bydende nødvendigt, at koncentrationerne af Cd eller Hg bestande er kendt i trin 2, da disse skal bruges til at kalibrere biosensor. II) på dagens eksponering væksten af celler skal være stoppet ved en OD600 på 0,6 (± 0,1) og den omhu, når resuspending cellekulturer, som biosensor er kalibreret til denne celle tæthed. III) endelig er det vigtigt, at eksponering medium er gjort grundigt på dagens eksponering. For at sikre succes i protokollen, flere kulturer bør dyrkes samtidigt (for at omgå muligheden for vækst fiasko) og vækstmediet bør være genskabt ugentligt (for at omgå metastability medier og eventuel forurening). Det skal også bemærkes, at biologiske flergangsbestemmelser (flere cellekulturer) express variabilitet, når det kommer til at signalere produktion. Selv om de fluorescerende svar kan variere fra kultur til kultur, bør de fluorescerende tendenser som reaktion på en given variabel forblive den samme i hele mange biologiske replikater.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke bemærkninger fra to anonyme anmeldere som godt medlemmer af Poulain Lab for indsigtsfulde diskussion om udviklingen i den anaerobe biosensor. En tidlig forsker Award fra provinsen Ontario og Discovery tilskud og en accelerator supplement fra naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada til A.J.P. finansieret denne undersøgelse.
7 ml standard vial, rounded interior | Delta Scientific | 200-007-20 | 34 recommended |
Vial tray, 21 mm openings | Delta Scientific | 730-2001 | 4 for (4 x 8 grid) |
24 mm Closure | Delta Scientific | 600-024-01 | 32 recommended |
LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50 | Corning | Corning 3931 | |
Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate | Corning | Corning 3651 | |
Anaerobic Chamber (glovebox) | The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 ± 2 % and 3 % H2 ± 2 %) | ||
Palladium catalyst | Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended. | ||
Microplate reader | |||
450 (±10) nM filter for the microplate reader | |||
500 (±10) nM filter for the microplate reader | |||
Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers | |||
Spectrophotometer | Modified for anaerobic culture tubes | ||
MA-3000 (mercury analyzer) | |||
pH probe | Any pH probe will work | ||
50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes. | |||
0.22 µm polyethersulfone syringe filter + syringe | |||
Sterile/clean glass bottles | For growth media and standards | ||
Sterile/clean plastic or PTFE bottles | For alkali solutions (NaOH/KOH) | ||
Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2 | |||
Sterile Milli-Q water | Autoclaved or filter sterilized is fine. | ||
Lysogeny Broth | |||
Analytical grade H2SO4 |