Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine anaerobe mikrobielle Biosensor ganze Zelle verwenden, um wie verschiedene Umgebungsvariablen zu bewerten beeinflussen die Bioverfügbarkeit von Hg und Cd auf Bakterien im anoxischen Umgebungen.
Quecksilber (Hg) Bioverfügbarkeit Mikroben ist ein wichtiger Schritt zu toxischen Hg Biomagnifikation in Nahrungsketten. Cadmium (Cd) Transformationen und Bioverfügbarkeit auf Bakterien steuern die Menge, die in Grundnahrungsmittel sammeln wird. Die Bioverfügbarkeit dieser Metalle ist abhängig von ihrer Speziation in Lösung, sondern vor allem unter anoxischen Bedingungen wo Hg ist, toxische Monomethylmercury (MeHg) methyliert und Cd besteht in der Rhizosphäre. Ganze Zelle mikrobielle Biosensoren geben eine quantifizierbare Signal, wenn eine Metall die Zellflüssigkeit betritt und folglich nützliche Werkzeuge sind, Metall Bioverfügbarkeit zu beurteilen. Leider haben die meisten Biosensoren Bemühungen bisher oxischen Umgebungen durch die begrenzte Fähigkeit der vorhandenen Reporter Proteine Funktion in Abwesenheit von Sauerstoff abhängig gemacht worden. In dieser Studie stellen wir unsere Bemühungen zu entwickeln und zu optimieren eine ganze Zelle Biosensor-Assay funktionstüchtige anaerob, die Metalle unter anoxischen Bedingungen in quasi-Echtzeit und innerhalb von Stunden erkennen kann. Wir beschreiben, wie der Biosensor helfen kann wie chemische Variablen relevant zu den ökologischen Radsport Metalle beeinflussen ihre Bioverfügbarkeit zu beurteilen. Das folgende Protokoll enthält Methoden zur Vorbereitung (1) Hg und Cd-Standards unter anoxischen Bedingungen, (2) Vorbereitung der Biosensor in Abwesenheit von Sauerstoff, (3) Gestaltung und führen ein Experiment, um festzustellen, wie eine Reihe von Variablen beeinflusst Hg oder Cd Bioverfügbarkeit und (4) zu quantifizieren und zu interpretieren Biosensor-Daten. Wir zeigen die lineare reicht von der Biosensoren und geben Beispiele zeigen die Methode Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen Metall Bioverfügbarkeit und Toxizität durch die Verwendung von Metall-induzierbaren und konstitutive Stämme.
Quecksilber (Hg) ist ein globaler Schadstoff und seiner Bioverfügbarkeit, Hg methylating Mikroben ist der erste Schritt in Richtung der Biomagnifikation durch Nahrungsnetze und neurotoxischen Nebenwirkungen beim Menschen und Tiere1. Es wird derzeit vermutet, dass mikrobielle Hg-Methylierung ist eine intrazelluläre Prozess, erfordert: (i) die Arten der Hg zu bioverfügbaren2,3,4,5,6,7 und Ii) für die Zelle physiologisch Hg8,9,10methylating werden. Cadmium (Cd) Bioaccumulates in Organismen, aber tut nicht Biomagnifies im Nahrungsnetz und ist weit verbreitet in industriellen und gewerblichen Prozessen, die verursachen häufig akute Expositionen in den Menschen und der Umwelt11. Obwohl Mikroben in das Schicksal der Hg in der Umgebung mehrere wichtige Rollen spielen, konzentrieren sich die meisten Studien über Cd Geochemie und Ökotoxikologie auf mikrobielle Eukaryoten12. Verbrauch von landwirtschaftlichen Kulturen (z.B. Reis) ist die wichtigste Quelle für direkte Einwirkung von Cadmium; in diesem Fall die Bioverfügbarkeit von Cd Mikroben der Rhizosphäre beeinflusst direkt die Menge Pflanzen13ansammeln können.
Hg-Transportwege sind komplex und umfassen möglicherweise einen aktiven Transport Schritt14. Wenn ein Transporter beteiligt ist, den letzten Arbeit vorgeschlagen, dass HgII eine Zn nutztII oder MnII Transporter7,15,16,17. Während CdII vermutet wird, um versehentlich transportiert werden Mechanismen der CdII transport in das Zytosol durch zweiwertigen Metall Transportwege (besonders MnII oder ZnII), im Inneren der Zellen bleiben spekulativ und nicht Cd-spezifische Transport Weg wurde identifizierten13,18. Unabhängig von der Art der Transporter beteiligt, drei mechanistische Faktoren bestimmen letztlich die Fähigkeit der Metalle in eine Zelle eingeben: (i) das Metall Speziation in Lösung2,6,15, 16 , 17 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23, Ii) die Biophysiochemical Eigenschaften der Zellmembran17,24,25,26,27,28,29 ,30,31, und Iii) die Möglichkeit, dass das Metall auf einen Transport Seite7,32zugreifen. CD und Hg dürften existiert als freie Ionen mikrobielle physiologisch relevanten Bedingungen aufgrund ihrer hohen Affinität für gelöste organische Angelegenheit (DOM), chelatisierenden Verunreinigungen (z. B. EDTA) oder Schwefel Moieties33reduziert, 34,35 (CdII kann als eine freie Ionen oder Form-Ionenpaare in Ermangelung dieser Liganden vorhanden). Gibt es ein Mangel an effizienten Methoden bei der Bestimmung, wie diese Metall Arten bioverfügbar unter Bedingungen, die für ihr Schicksal in die Umwelt relevant sind. Zum Beispiel Hg ist unter anaeroben Bedingungen14methyliert und Cadmium und Hg sind weiche Metalle (oder Klasse B kationen), verlangt, dass ihre Artbildung unter Bedingungen untersucht werden, die die Integrität der reduzierten Schwefel Gruppen verwalten.
Mikrobielle Biosensoren sind bakterielle Zellen, die eine quantifizierbare Signal als Reaktion auf die intrazellulären Konzentrationen eines Metalls, in diesem Fall Hg oder Cd abgeben. Als solche sind sie ideale Instrumente zu verstehen, wie Metalle eine Zelle36, betreten, sofern die Bedingungen für sorgfältig kontrolliert werden. Hg-Biosensoren enthalten in der Regel gen Fusionen zwischen den regulatorischen Schaltung der Mer-Operon (einschließlich Gene Kodierung für die Transkription Regler MerRas sowie die Betreiber und Veranstalter Regionen die Operon) und reporting Gene (z.B. Lux, GLP, Lac Gene). Wenn Quecksilber in das Zytoplasma vorhanden ist, wird es an GESEG, was in der Transkription der berichtenden Gene und nachfolgende Signal Produktion19,37binden. Spezielle Cd Biosensoren dienen in der Regel mit CadC CadAC, ZntA oder ZntR codiert Transkription Regulierungsbehörden38, aber es ist erwähnenswert, dass GESEG eine niedrigere, aber messbare Affinität zu Cd5. Durch aerobe Beschränkung der meisten gängigen lumineszierenden oder fluoreszierende Reporter Proteine, bis vor kurzem mikrobielle Biosensoren nicht in der Lage blieb, bieten Einblicke in die Biotransformation von Metallen unter anoxischen Bedingungen. Dies erschwert anaeroben Nachweis von Metallen Bioverfügbarkeit über eine Reihe von Bedingungen für ihr Umweltverhalten, speziell im Beisein von Redox sensible Liganden (z. B. Sulfid und Thiole)4, 5 , 39.
Zur Linderung die methodische Hürde der Leben Bildgebung in der Abwesenheit von Sauerstoff, Drepper Et al. (2007) haben ein Flavin-basierte fluoreszierendes Protein (FbFp) entwickelt, basierend auf Licht Sauerstoff Spannung Domäne SB2 Protein von p. Putida. Dieser Proteinfamilie ist in der Lage, in der Abwesenheit von Sauerstoff40fluoreszieren. Aufbauend auf der Arbeit von Drepper Et Al., entwickelt unser Labor eine anaerobe Biosensor, so dass für das Studium der Hg Bioverfügbarkeit unter oxischen und anoxischen Bedingungen und über einen weiten Bereich von Salzgehalt 17. Im aktuellen Papier beschreiben wir wie Sie vorbereiten und verwenden der Biosensor, um ökologische Variablen Einfluss auf Hg oder Cd Bioverfügbarkeit zu testen. Obwohl wir der Biosensor für HgIIentwickelt, entschieden wir uns für Experimente mit CdII als ein Mittel, um die Aufmerksamkeit des Lesers auf die Tatsache lenken, dass Biosensoren auch auf mehrere Stressoren reagieren können, die in ökologischen zusammen auftreten dürften durchführen Matrizen; in diesem Fall war CdII untersucht, weil es zum Binden an der transcriptional Regulator GESEG5bekannt ist. Hier zeigen wir repräsentative Kalibrierung und funktionale lineare Bereiche in Bezug auf entweder Metall. Wir geben auch ein Beispiel, wenn der Biosensor Ergebnisse schlüssig (MgII und MnII auf Hg Bioverfügbarkeit) sind und nicht schlüssig (ZnII auf Hg Bioverfügbarkeit).
Mikrobielle Biosensoren sind nützliche Werkzeuge, die Mechanismen zu identifizieren, mit denen Metalle mit Mikroben interagieren. Hier beschreiben wir eine Methode, die anaerob Hg quantifizieren kannII und CdII Bioverfügbarkeit, ein gramnegatives Wirtszelle (E. Coli) und geben ein quantifizierbares Ergebnis innerhalb von wenigen Stunden. Eine der großen Stärken dieses Protokolls ist, dass es umfangreiche Kontrolle über Metall Speziation Mittel-und Belichtung durch die Vermeidung von starken Bindung Liganden oder Komponenten, die zu metallischen Niederschlägen führen können. Metall Speziation wurde modelliert und getestet in dieser Exposition Medium mit PHREEQC17, aber andere Metall Speziation Software eingesetzt werden darf. Im Falle keine zusätzlichen Liganden, Hg Speziation wird voraussichtlich als 97 % Hg(OH)2 und 3 % Hg (NH3)22 +, anwesend sein während Cd Speziation werden als 59 % Cd-β-Glycerophosphat, 25 % Cd2 +und 16 % CdSO4präsentieren. Der Benutzer kann mit einem einfachen Thermodynamische Modellierung Software, design Exposition Medien und testen für die Bioverfügbarkeit des Metalls von Interesse. Darüber hinaus ist die Biosensor Wirtszelle (E. Coli NEB5α) über einen weiten Bereich von pH (5-8,5) und NaCl-Konzentration lebensfähig (0-0,55 M)17.
Hg-Methylierung ist ein anaerober Prozess, und das Protokoll in dieser Studie beschriebenen keinen Voraussetzung für Sauerstoff, für eine genauere Beschreibung der anaeroben Stoffwechsel auf Metall Bioverfügbarkeit ermöglicht. Dies ist wichtig, weil das Vorhandensein von Sauerstoff gen Ausdruck Profile48,49 ändert und somit Potenzial Wege transportieren; Daher stellt diese Methode einen Vorteil gegenüber derzeit vorhandene aeroben Alternativen. Die hier vorgestellten Biosensoren-Konstrukt kann mit anderen anaeroben Hosts, die für Quecksilber-Methylierung (z. B. Geobacter, Desulfovibrio), aber vielleicht mehr relevant sein könnten genutzt werden weniger steuerbar als E. Coli. Eine Strombegrenzung des hier vorgestellten Ansatzes ist, dass unser Limit der Erkennung pM-Werte im Gegensatz zu bestehenden aerobe Systeme4,19,37noch nicht erreicht hat. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese niedrige Nachweisgrenzen erreichen mehrere Schritte44ergriffen werden müssen: ich) Liganden ist erforderlich, um sicherzustellen, dass Hg in Lösung bleibt und nicht auf die mikrobielle Zellwand (Hg werden irreversibel gebunden zu adsorbieren zur Zelle Oberfläche Thiole verhindert seine Bioverfügbarkeit25,27; Siehe die Schwelle Antwort für Hg in Abbildung 3A), Ii) Änderungen der Zelldichte oder Iii) ändern der genetischen Konstrukt um Transportproteine Mererweitert-Operon (nämlich MerT und MerP), zunehmende Hg Flux im Inneren der Zelle50,51. Diese Änderungen wäre bei der Aufdeckung von geringen Konzentrationen von Hg vorteilhaft, aber nicht unbedingt ideal ökologisch relevanten Sachverhalte zu beurteilen. Während frühere Kadmium Biosensoren in erster Linie als ein “Proof of Principle” existieren, wurden sie in komplexen Medien entwickelt, denen nicht die Ermittler zu beurteilen, die Rolle der Artbildung auf Bioverfügbarkeit41,42, 43 , 44.
Der Biosensor ist ein unglaublich nützliches Werkzeug bei der Bestimmung der Mechanismen, die in denen Metall Arten bioverfügbar sind. Da der Wirtsorganismus nicht Hg-Methylator ist, kann es nur verwendet werden, ein Modell für wie Hg geben Sie können gramnegative Bakterien und keine endgültige Begründung für wie Hg-Methylators Hg erwerben zu entwickeln. Gibt es andere Methoden zur Bestimmung von Hg Bioverfügbarkeit, z. B. Methylierung, als ein Ergebnis der Aufnahme oder der Einsatz einer Massenbilanz Ansatz10,15,20,45,46. Abgesehen davon bietet die hier vorgestellte Methode den Vorteil der quasi Bioverfügbarkeit Echtzeitdaten in lebensfähige Zellen. Wir empfehlen nicht, dass diese Methode verwendet werden, um insgesamt Hg oder Cd Level in einer Umwelt-Matrix zu quantifizieren. Trotz der vorgeschlagenen Verwendung von Biosensoren Metallkonzentrationen im Umfeld36zu bestimmen gibt es viele mehr zur Verfügung stehen standard-Methoden wie z. B. ICP-MS, FAAS (für Cd-Analyse) oder Kaltdampf-Atom-Absorptions-Spektroskopie (für Hg -Analyse). Jedoch kann der Biosensor verwendet, um festzustellen, ob eine gegebene Umwelt Matrix das Potenzial hat, zu verbessern oder behindern Bioverfügbarkeit; Dies wird erreicht, indem Sie standard Ergänzungen durchführen.
Der pH-Wert des Mediums Exposition kann geändert werden überall innerhalb des Bereichs von 5 und 8,5, vorausgesetzt der MOPS freie Säure (Puffer) mit einer Alternative freie Säure eines Puffers mit der entsprechenden PKA-Wert ausgetauscht werden (siehe Liste der entsprechenden Puffer (Ferreira Et Al. (2015) 47) und mit KOH zu den entsprechenden pH-Wert eingestellt, wenn die Exposition Medien machen. Darüber hinaus die Methode beschränkt sich nicht auf Hg und Cd, aber für andere Metalle mit anderen Regulierungsbehörden Transkription ausgeweitet werden könnte.
Die Exposition-Assay kann geändert werden, um den Einfluss der anderen Elektronen-Akzeptoren wie O2 und Fumarat auf Hg oder Cd Bioverfügbarkeit zu erkunden. Geringfügige Änderungen an der Methode, O2 und Fumarat als Elektronen-Akzeptoren zu nutzen sind auf Anfrage erhältlich.
Zusammenfassend wir folgende Punkte hervorheben möchten: ich) es ist zwingend notwendig, dass die Konzentrationen von Cd oder Hg Bestände in Schritt 2 bekannt sind, wie diese verwendet werden, um der Biosensor zu kalibrieren. II) am Tag Exposition muss das Wachstum von Zellen bei einer OD600 von 0,6 (± 0,1) gestoppt werden und die Sorgfalt beim resuspending der Zellkulturen als der Biosensor zu dieser Zelle Dichte kalibriert ist. III) zu guter Letzt ist es wichtig, dass Exposition Medium akribisch auf die Exposition Tag erfolgt. Um den Erfolg des Protokolls zu gewährleisten, sollten mehrere Kulturen angebaut werden, gleichzeitig (um die Möglichkeit einer Wachstumsstörung zu umgehen) und das Wachstumsmedium sollte wöchentlich erneuert werden (um die Metastabilität der Medien und der möglichen Kontamination zu umgehen). Anzumerken ist, dass biologische Wiederholungen (mehrere Zellkulturen) Variabilität äußern, wenn es darum geht, die Produktion zu signalisieren. Obwohl die fluoreszierenden Antworten von Kultur zu Kultur unterschiedlich sein können, sollte die fluoreszierenden Trends in Beantwortung einer bestimmten Variablen in zahlreichen biologischen Wiederholungen unverändert.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten Kommentare von zwei anonymen Gutachtern als auch Mitglieder der Poulain Labor für aufschlussreiche Diskussion über die Entwicklung der anaeroben Biosensor zu danken. Eine frühe Forscher Auszeichnung aus der Provinz Ontario und ein Discovery Grant und eine Ergänzung der Beschleuniger aus den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada A.J.P finanziert dieser Studie.
7 ml standard vial, rounded interior | Delta Scientific | 200-007-20 | 34 recommended |
Vial tray, 21 mm openings | Delta Scientific | 730-2001 | 4 for (4 x 8 grid) |
24 mm Closure | Delta Scientific | 600-024-01 | 32 recommended |
LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50 | Corning | Corning 3931 | |
Corning 96- well clear-bottom nonbinding surface microplate | Corning | Corning 3651 | |
Anaerobic Chamber (glovebox) | The air in the anaerobic chamber should be (97 % N2 ± 2 % and 3 % H2 ± 2 %) | ||
Palladium catalyst | Converts O2 to H2O in the anaerobic chamber. Not required but recommended. | ||
Microplate reader | |||
450 (±10) nM filter for the microplate reader | |||
500 (±10) nM filter for the microplate reader | |||
Anaerobic culture vial (balch tubes) + rubber stoppers | |||
Spectrophotometer | Modified for anaerobic culture tubes | ||
MA-3000 (mercury analyzer) | |||
pH probe | Any pH probe will work | ||
50 mL conical sterile polypropylene centrifuge tubes. | |||
0.22 µm polyethersulfone syringe filter + syringe | |||
Sterile/clean glass bottles | For growth media and standards | ||
Sterile/clean plastic or PTFE bottles | For alkali solutions (NaOH/KOH) | ||
Reagents powders: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, ampicillin sodium salt, Difco M9 Minimal Salts, Glucose, MgSO4, Thiamine HCl, NaNO3, l-leucine, l-isoleucine valine, EDTA sodium salt, FeSO4, Sodium Beta-Gylcerophosphate, Mops free acid, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2 | |||
Sterile Milli-Q water | Autoclaved or filter sterilized is fine. | ||
Lysogeny Broth | |||
Analytical grade H2SO4 |