Summary

Isolamento di F1-ATPasi dal Protista parassita Trypanosoma brucei

Published: January 22, 2019
doi:

Summary

Questo protocollo descrive la purificazione di F1-ATPase dal palco dell’insetto colta di Trypanosoma brucei. La procedura produce un complesso altamente puro, omogeneo e attivo adatto per studi strutturali ed enzimatici.

Abstract

F1-atpasi è una membrana-estrinseca ossidrilasico catalitica del F-tipo ATP sintasi, un enzima che utilizza la forza motrice protonica attraverso le membrane biologiche per la produzione di adenosina trifosfato (ATP). L’isolamento del intatta F1-ATPasi dalla sorgente nativo è un prerequisito essenziale per caratterizzare la composizione proteica, parametri cinetici e sensibilità agli inibitori dell’enzima. Un altamente puro e omogeneo F1-ATPasi possono essere utilizzato per studi strutturali, che forniscono la comprensione nei meccanismi molecolari di sintesi di ATP e idrolisi. In questo articolo viene descritta una procedura per la purificazione del F1-ATPase dal Trypanosoma brucei, l’agente causativo di trypanosomiases africano. F1-atpasi è isolato dalle vescicole mitocondriale, che sono ottenute da Lisi ipotonica da in vitro coltivate trypanosomes. Le vescicole sono frammentate meccanicamente di sonicazione e la F1-ATPasi viene rilasciato dalla membrana mitocondriale interna mediante l’estrazione di cloroformio. Il complesso enzimatico viene ulteriormente purificato di scambio anionico consecutivi e la cromatografia di esclusione dimensionale. Tecniche di spettrometria di massa sensibile ha mostrato che il complesso purificato è privo di contaminanti virtualmente qualsiasi proteina e, pertanto, rappresenta il materiale adatto per la determinazione della struttura di cristallografia a raggi x o cryo-microscopia elettronica. L’isolato F1-ATPasi esibisce attività idrolitica di ATP, che può essere inibito completamente da sodio azide, un potente inibitore delle F-tipo ATP sintasi. Il complesso purificato rimane stabile e attiva per almeno tre giorni a temperatura ambiente. Precipitazione con solfato di ammonio è usato per immagazzinaggio a lungo termine. Procedure simili sono state usate per la purificazione di F1– atpasi da tessuti di mammiferi e vegetali, lieviti o batteri. Così, il protocollo presentato può servire come guida per la F1-isolamento dell’atpasi da altri organismi.

Introduction

I tipo F ATP sintasi sono membrana-limitano rotanti complessi multiproteici tale traslocazione del protone di coppia attraverso le membrane trasduzione di energia dei batteri, i mitocondri e cloroplasti con la formazione di ATP. Dettagli molecolari del meccanismo di rotazione di sintesi di ATP sono noti principalmente a causa di studi strutturali di purificato batterica e mitocondriale ATP sintasi e loro subcomplexes1. F-tipo trifosfato di adenosina synthase è organizzato in membrana-intrinseche ed estrinseche-membrana moiety. Parte della membrana-estrinseco, nota come F1-atpasi, contiene tre siti catalitici, dove si verifica la fosforilazione dell’adenosina difosfato (ADP) di ATP o la reazione inversa. F1-ATPasi possono essere rilasciato sperimentalmente da parte dell’intrinseca di membrana pur mantenendo la sua capacità di idrolizzare, ma non sintetizzare, ATP. Il settore di membrana-limita, chiamato Fo, media la traslocazione di proteine, che aziona la rotazione della parte centrale dell’enzima. La F1 e Fo settori sono collegati da steli centrali e periferici.

I primi tentativi di purificare la F1-atpasi da lievito e cuore bovino mitocondri data indietro al 1960. Questi protocolli utilizzati estratti di mitocondri, che sono stati interrotti di sonicazione, frazionato da precipitazione del solfato dell’ammonio o protamina, seguita da cromatografia opzionale passo (s) e trattamento termico2,3,4 ,5,6. La purificazione è stato notevolmente migliorata e semplificata mediante l’uso di cloroformio, che prontamente rilascia la F1-ATPasi dalla membrana mitocondriale frammenti7. L’estrazione di cloroformio è stato poi utilizzato per estrarre F1– atpasi da vari animali, vegetali e fonti batteriche (ad es., del fegato del ratto8, mais9, Arum maculatum10e Escherichia coli 11). Ulteriore purificazione del cloroformio-rilasciato F1-ATPasi mediante cromatografia di affinità o di esclusione (SEC) ha reso una proteina altamente pura complessa, che era adatta per la determinazione della struttura ad alta risoluzione di cristallografia a raggi x, come documentato dalle strutture di F1-atpasi da cuore bovino12,13 e14di Saccharomyces cerevisiae. F1-strutture dell’atpasi inoltre sono stati determinati da organismi che sono difficili da coltivare e, quindi, la quantità di materiale biologico iniziale era limitata. In questo caso, la F1-subunità ATPasi sono stati artificialmente espresso e assemblate per formare il complesso dentro e. colie l’enzima intero eterologa è stato purificato mediante cromatografia affinità tramite una subunità taggata. Tale approccio ha portato alla determinazione di F1-strutture di atpasi da due specie di batteri termofile, Geobacillus stearothermophilus15 e thermarum Caldalkalibacillus16, 17. Tuttavia, questa metodologia è piuttosto inadatta per eucariotica F1– ATPasi dato che si basa sull’apparato protheosynthetic procariote, elaborazione post-traduzionale e assiemi complessi.

L’estrazione basata su cloroformio utilizzato in precedenza per isolare F1– atpasi da unicellulari digenetic parassiti Trypanosoma cruzi18 e T. brucei19, importanti patogeni mammiferi causando americano e Trypanosomiases africano, rispettivamente e da malattie monogenica insetto parassita Crithidia fasciculata20. Queste purificazioni ha condotto soltanto a una semplice descrizione del F1– atpasi, poiché nessuna applicazione a valle sono stata usata per caratterizzare la composizione, struttura e proprietà enzimatiche del complesso. Questo articolo viene descritto un metodo ottimizzato per F1-purificazione dell’atpasi dalla fase del ciclo di vita dell’insetto colta di T. brucei. Il metodo è sviluppato basato su protocolli stabiliti per l’isolamento di bovini e lievito F1– ATPasi21,22. La procedura produce altamente puro e omogeneo enzima adatto in vitro enzimatico e inibitorio saggi, proteomica dettagliata caratterizzazione mediante spettrometria di massa23e struttura determinazione24. Il protocollo di purificazione e la conoscenza del F1-ATPasi struttura a livello atomico si apre la possibilità di progettare le schermate per identificare piccole molecole inibitori e facilitare lo sviluppo di nuovi farmaci contro trypanosomiases africano. Inoltre, il protocollo può essere adattato per purificare F1-atpasi da altri organismi.

Protocol

1. tamponi e soluzioni Preparare le soluzioni elencate di seguito. Degassare tutti i buffer per cromatografia liquida. Aggiungere gli inibitori di proteasi, benzamidine e ADP appena prima dell’uso. Preparare il tampone di buffer a: 50 mM Tris con acido cloridrico (Tris-HCl) pH 8.0, saccarosio 0,25 M, 5 mM benzamidine, 5mm aminocaproico acido (ACA) e proteasi inibitori (10 amastatin µM, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatina, 50 µM leupeptina e 50 µM diprotin A). Preparare di tampone b: 50 mM …

Representative Results

Una purificazione tipica (Figura 1) inizia con vescicole mitocondriale (mitoplasts) isolate sul gradiente di Percoll dal lisato hypotonically 1 x 1011 a 2 x 1011 prociclico di cellule di T. brucei 25 coltivate nello standard glucosio-ricco SDM-79 media27. I mitoplasts sono frammentati di sonicazione, filata, e il supernatante contenente matrice viene scartato. Le membrane mitocondr…

Discussion

Il protocollo per F1-purificazione dell’atpasi da T. brucei è stato sviluppato precedentemente pubblicati basata su metodi per l’isolamento di F1-complessi di atpasi da altre specie13,14. Il metodo non richiede alcuna modificazione genetica (ad es., tagging) e produce un complesso completamente attivo con tutte le subunità presenti. Il punto cruciale è il rilascio di cloroformio-facilitato di F1-ATPasi dalla p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato dal Ministero di educazione ERC CZ concedere LL1205, la concessione di Grant Agency di Repubblica Ceca 18-17529S e dal FESR/FSE progetto centro per la ricerca di patogenicità e virulenza dei parassiti (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

Materials

Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) Applichem A0948
Amastatin Hydrochloride Glantham Life Sciences GA1330
Aminocaproic Acid Applichem A2266
BCA Protein Assay Kit ThermoFischer Scientific/Pierce 23225
Benzamidine Hydrochloride Calbiochem 199001
Bestatin Hydrochloride Sigma Aldrich/Merck B8385
Chloroform Any supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free Roche 4693159001 Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Any supplier
Hydrochloric Acid Any supplier For pH adjustment
Ile-Pro-Ile Sigma Aldrich/Merck I9759 Alias Diprotin A
Leupeptin Sigma Aldrich/Merck L2884
Magnesium Sulfate Heptahydrate Any supplier
Pepstatin A Sigma Aldrich/Merck P5318
Protein Electrophoresis System Any supplier
Sodium Chloride Any supplier
Sucrose Any supplier
Tris Any supplier
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer Beckman Coulture 328874
DounceTissues Homogenizer 2 mL Any supplier
Glass Vacuum Filtration Device Sartorius 516-7017 Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mL GE Healthcare Life Sciences 17115401 Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm Sartorius 18406–47——N Degasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 29091596 Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES Sartorius VS0641
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
AKTA Pure 25 GE Healthcare Life Sciences 29018224 Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 Shimadzu Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor Beckman Coulture Or similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 BioLogics 0-127-0001 Or similar ultrasonic homogenizer

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Cite This Article
Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).

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