Summary

Analisi del ciclo cellulare nella linea germinale di c. elegans con la timidina analogico EdU

Published: October 22, 2018
doi:

Summary

È descritto un metodo basato su formazione immagine che può essere utilizzato per identificare la fase S e analizzare le dinamiche del ciclo cellulare in c. elegans ermafrodita germinale utilizzando la timidina EdU analogico. Questo metodo non richiede nessun transgeni ed è compatibile con la macchiatura immunofluorescente.

Abstract

Analisi del ciclo cellulare negli eucarioti utilizza frequentemente la morfologia del cromosoma, espressione e/o localizzazione di prodotti genici necessari per le varie fasi del ciclo cellulare, o l’incorporazione di analoghi nucleosidici. Durante la fase S, polimerasi del DNA incorporare gli analoghi della timidina come EdU o BrdU nel DNA cromosomico, marcatura delle cellule per l’analisi. Per c. elegans, il nucleoside analogico EdU durante regolare cultura è alimentata con i vermi ed è compatibile con tecniche di immunofluorescenza. La linea germinale di c. elegans è un sistema potente modello per gli studi di segnalazione vie, cellule staminali, meiosi e ciclo cellulare perché è trasparente, geneticamente facile e Profase Meiotica e differenziazione cellulare/gametogenesi si verificano in un lineare Assemblea-come la moda. Queste caratteristiche rendono EdU un ottimo strumento per studiare aspetti dinamici delle cellule mitoticamente ciclismo e sviluppo di germline. Questo protocollo viene descritto come correttamente preparare EdU batteri, nutrirli wild-type c. elegans ermafroditi, sezionare la gonade ermafrodita, macchia per EdU incorporazione nel DNA, macchia con gli anticorpi per rilevare vari ciclo cellulare e gli indicatori dello sviluppo, la gonade di immagine e analizzare i risultati. Il protocollo descrive le variazioni nel metodo e nell’analisi per la misurazione della fase S indice, M-fase indice, G2 durata, durata del ciclo cellulare, tasso di entrata meiotica e tasso di progressione della Profase Meiotica. Questo metodo può essere adattato per studiare il ciclo cellulare o la storia di cella in altri tessuti, fasi, ambiti di provenienza genetici e condizioni fisiologiche.

Introduction

Nello sviluppo animale, centinaia, migliaia, milioni, miliardi o anche migliaia di miliardi di divisioni cellulari è necessari per formare l’organismo adulto. Il ciclo cellulare, il set di eventi cellulari composto di G1 (gap), S (sintesi), G2 (gap), e M (mitosi) definire la serie di eventi che vengono eseguiti ogni divisione cellulare. Il ciclo cellulare è dinamico e meglio apprezzato in tempo reale, che può essere tecnicamente difficile. Le tecniche presentate in questo protocollo permettono di effettuare le misurazioni delle fasi e la tempistica del ciclo cellulare da immagini fisse.

Etichettatura con analoghi nucleosidici come 5-Etinil-2′-deoxyuridine (EdU) o 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) è il gold standard per identificare la fase S negli studi della dinamica del ciclo cellulare nell’adulto Caenorhabditis elegans (c. elegans) germline ermafroditi1,2,3,4,5. EdU sia BrdU utilizzabile in quasi qualsiasi background genetico, come che non si basano su qualsiasi costrutto genetico. Visualizzazione di BrdU richiede duro trattamento chimico per esporre l’antigene per l’anticorpo anti-BrdU colorazione, che spesso è incompatibile con la valutazione di altri markers cellulari visualizzati dalla co-macchiatura con altri anticorpi. Al contrario, visualizzazione EdU si verifica dalla chimica clicca in condizioni blande e quindi è compatibile con l’anticorpo co-macchiatura6,7.

La specificità dell’etichetta è chiara, dal momento che i nuclei solo incorporano gli analoghi (5-Etinil-2′-deoxyuridine) della timidina in DNA durante la fase S. Visualizzazione avviene nel tessuto fisso. L’etichetta di EdU è invisibile da solo fino a un colorante contenenti azide o fluorophore reagisce covalentemente con alchini in EdU di rame-catalizzata clic chimica8. EdU etichettatura può fornire informazioni immediate su cui i nuclei sono in fase S, utilizzando un breve impulso di etichettatura. EdU possono anche fornire informazioni dinamiche, utilizzando pulse-chase o etichettatura continuo; ad esempio, in un esperimento di pulse-chase, l’etichetta è diluita a ogni divisione cellulare o propagate come nondividing cellule progresso attraverso lo sviluppo.

C. elegans ermafrodita germinale è un sistema potente modello per gli studi del ciclo cellulare, cellule staminali, meiosi e vie di segnalazione. La linea germinale adulta è una linea di assemblaggio polarizzata con cellule staminali presenti all’estremità distale, seguita da voce e progressione attraverso Profase Meiotica, coordinato con le fasi della gametogenesi più prossimalmente (Figura 1). L’estremità prossimale, ovociti maturo, sono ovulati e fertilizzato e cominciano l’embriogenesi nel utero9,10,11. La regione lungo ~ 20 cella-diametro accanto alla cella di punta distale, che include il gambo di germline mitotically ciclismo, cellule progenitrici e le cellule di S-fase meiotiche ma non le cellule in Profase Meiotica, viene chiamata il progenitore zona2,4 , 9 , 12. le membrane delle cellule forniscono incompleta separazione tra i nuclei la linea germinale distale, ma la zona cellule progenitrici subiscono mitotica cellulare ciclismo in gran parte in modo indipendente. La durata mediana ciclo cellulare mitotica delle cellule di zona progenitrici di germline in giovane adulti ermafroditi è ~6.5 h; Fase G1 è breve o assente, e quiescenza non è osservato1,2,13. Differenziazione delle cellule staminali germinali si verifica attraverso la differenziazione essenzialmente diretta e quindi manca di transito-amplificando divisioni4. Durante la differenziazione nel pachitene, circa 4 su 5 nuclei non si formano gli ovociti ma invece andare incontro ad apoptosi, in qualità di infermiera cellule donando loro contenuto citoplasmatico di sviluppo dell’ovocita12,14 , 15.

Oltre alle etichette cellule in fase S con analoghi nucleosidici, si possono identificare le cellule in mitosi e meiosi usando la macchiatura dell’anticorpo. Nuclei in mitosi sono immunoreactive all’anti-fosfo-istone H3 (Ser10) anticorpo (chiamato pH3)7,16. Nuclei in meiosi sono immunoreactive all’anticorpo anti-lui-3 (una proteina di asse meiotic del cromosoma)17. I nuclei nella zona del progenitore possono essere identificati dall’assenza di HIM-3, la presenza di adrenocorticale REC-818o la presenza di WAPL-119. WAPL-1 intensità è massima nella gonade somatica, alta nella zona del progenitore e basso durante i primi meiotica prophases19. Diverse misurazioni del ciclo cellulare sono possibili con poche variazioni nel protocollo: I) identificare i nuclei in fase S e misurare l’indice di S-fase; II) identificare i nuclei in fase M e misurare l’indice di fase M; III) determinano se i nuclei erano nella S-fase mitotica o meiotica; IV) misurare la durata di G2; V) misura la duartion delle fasi G1 + G2 + M; VI) misura il tasso di entrata meiotica; VII) stimare il tasso di progressione meiotica.

Si possono fare misurazioni multiple del ciclo cellulare da solo alcuni tipi di esperimenti di laboratorio bagnato. Il protocollo sottostante descrive un 30 min impulso etichettatura alimentandosi di c. elegans adulti ermafroditi con EdU etichettato batteri e cellule co-etichettatura di M-fase macchiando con progenitore e degli anticorpi anti-pH3 zona cellule macchiando con anticorpo anti-WAPL-1. Soltanto i cambiamenti nella durata della EdU feed (punto 2.5), tipo di anticorpi impiegati (punto 5), e sono necessarie per le misure ulteriori analisi (punto 8.3).

Protocol

1. preparazione di EdU-identificati batteri Crescere una coltura starter di MG1693. Escherichia coli MG1693 (e. coli) trasporta una mutazione in thyA. Striscia fuori MG1693 di Escherichia coli da uno stock di glicerolo congelato su un agar di brodo (LB) di 120 mm Lisogenesi di Petri. Coltura a 37 ° C durante la notte. Inoculare da due singoli e. coli MG1693 colonie in due duplicare 4 mL provette di coltura liquida lb a 37 ° C per ~ 16 …

Representative Results

Poiché per incorporare EdU sono necessaria la sintesi del DNA, si può concludere che EdU-identificati i nuclei hanno subito la fase S durante l’intervallo di tempo EdU-etichettatura. Si può interpretare i nuclei quell’etichetta in un’alimentazione di 30 min con EdU batteri identificati come appartenenti a nuclei in fase S al momento della dissezione. I nuclei che etichettare in un più EdU continuo esperimento di alimentazione possono avere etichettato presto nella finestra temporale e…

Discussion

Preparazione di EdU-identificati batteri (passaggio 1) è critica per questo protocollo e il primo punto della risoluzione dei problemi. Etichetta di selvaggio-tipo giovane adulto ermafroditi molto affidabile in un 4h EdU-impulso, rendendo questo un controllo utile per ogni nuovo lotto di EdU-identificati batteri. Inoltre, intatti EdU-etichetta per i batteri che entrano l’intestino (in più vecchi animali o alcuni mutanti difettosi faringe/smerigliatrice) verranno etichettare con clic chimica e appaiono come brillante pu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati al centro stock di e. coli per MG1693; WormBase; il centro di genetica di Caenorhabditis che è finanziato dai nazionali istituti di salute di ricerca infrastrutture programmi di Office (P40OD010440) per i ceppi; Zach Pincus per consulenza statistica; Aiping Feng per reagenti; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar e John Brenner per formazione, consulenza, supporto e discussioni utili; e i laboratori Kornfeld e Schedl per feedback su questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 a KK, R01 GM100756 TS] e una borsa di dottorato National Science Foundation [DGE-1143954 e DGE-1745038 a ZK]. Il National Institutes of Health, né la National Science Foundation ha avuto alcun ruolo nella progettazione di studio, raccolta, analisi e interpretazione dei dati, né per iscritto il manoscritto.

Materials

E. coli MG1693 Coli Genetic Stock Center 6411 grows fine in standard unsupplemented LB
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Thermo Fisher Scientific C10337
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine Sigma 900584-50MG or use EdU provided in kit
Glucose Sigma D9434-500G D-(+)-Dextrose
Thiamine (Vitamin B1) Sigma T4625-5G Reagent Grade
Thymidine Sigma T1895-1G BioReagent
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M1880-1KG MgSO4, Reagent Grade
Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous Fisher BP332-500G Na2HPO4
Potassium Phosphate, monobasic Sigma P5379-500G KH2PO4
Ammonium Chloride Sigma A4514-500G NH4Cl, Reagent Plus
Bacteriological Agar US Biological C13071058
Calcium Chloride dihydrate Sigma C3881-500G CaCl
LB Broth (Miller) Sigma L3522-1KG Used at 25g/L
Levamisole Sigma L9756-5G 0.241g/10ml
Phosphate buffered saline Calbiochem Omnipur 6506 homemade PBS works just as well
Tween-20 Sigma P1379-500ML
16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules Electron Microscopy Sciences 15710 10ml ampules
100% methanol Thermo Fisher Scientific A454-1L Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies
Goat Serum Gibco 16210-072 Lot 1671330
rabbit-anti-WAPL-1 Novus biologicals 49300002 Lot G3048-179A02, used at 1:2000
mouse-anti-pH3 clone 3H10 Millipore 05-806 Lot#2680533, used at 1:500
goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012 Lot 1256147, used at 1:400
goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Lot 1511347, used at 1:400
Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Vector Laboratories H-1200 mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation
nail polish Wet n Wild DTC450B any clear nail polish should work
S-medium various see wormbook.org for protocol
M9 buffer various see wormbook.org for protocol
M9 agar various same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar
Nematode Growth Medium various see wormbook.org for protocol
dissecting watch glass Carolina Biological 42300
Parafilm laboratory film Pechiney Plastic Packaging PM-996 4 inch wide laboratory film
petri dishes 60 mm diameter
Long glass Pasteur pipettes
1ml centrifuge tubes MidSci Avant 2926
Tips
Serological pipettes
500 mL Erlenmyer flask
Aluminum foil
25G 5/8” needles BD PrecisionGlide  305122
5ml glass centrifuge tube Pyrex 
Borosilicate glass tubes 1ml
glass slides
no 1 coverslips 22 x 40 mm no 1.5 may work, also
37 °C Shaker incubator
Tabletop Centrifuge
Clinical Centrifuge IEC 428 with 6 swinging bucket rotor
Mini Centrifuge
20 °C incubator
4 °C refrigerator
-20 °C freezer
Observer Z1 microscope Zeiss
Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens Zeiss
Ultraview Vox spinning disc confocal system PerkinElmer  Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy 

References

  1. Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -. H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), 2223-2234 (2011).
  2. Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
  3. Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
  4. Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).
  5. Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
  6. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  7. vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
  8. ThermoFisher. . Click-iT EdU Imaging Kits. , (2011).
  9. Pazdernik, N., Schedl, T. . Germ Cell Development in C. elegans. , 1-16 (2013).
  10. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  11. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  12. Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
  13. Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
  14. Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).
  15. Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), 1011-1022 (1999).
  16. Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
  17. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), 2258-2270 (1999).
  18. Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).
  19. Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
  20. Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
  23. Vos, K. . De Cell Counter Plugin. , (2015).
  24. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Rasband, W. . ImageJ. , (2016).
  26. Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), 671-680 (2010).
  27. Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).
  28. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
  29. Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -. C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
  30. Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).
  31. . . Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , 1-7 (2010).
  32. Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).

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Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU. J. Vis. Exp. (140), e58339, doi:10.3791/58339 (2018).

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