Summary

Análise de ciclo celular no Germline de c. elegans com o EdU analógico de timidina

Published: October 22, 2018
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Summary

É descrito um método baseado em imagens que pode ser usado para identificar a fase S e analisar a dinâmica do ciclo celular no germline hermafrodita de c. elegans , usando a timidina EdU analógico. Este método não requer nenhum transgenes e é compatível com coloração imunofluorescente.

Abstract

Análise de ciclo celular em eucariotos frequentemente utiliza a morfologia do cromossomo, expressão e/ou localização de produtos de genes necessários para várias fases do ciclo celular, ou a incorporação de análogos de nucleosídeos. Durante a fase S, polimerases de DNA incorporam os análogos da timidina como EdU ou BrdU no DNA cromossômico, marcando as células para análise. Para c. elegans, o nucleosídeo EdU analógico é alimentado para os vermes durante a cultura regular e é compatível com as técnicas de imunofluorescência. O germline de c. elegans é um sistema poderoso modelo para os estudos de sinalização de vias, células-tronco, ciclo celular e meiose porque é transparente, geneticamente facile e prófase meiótica e diferenciação celular/gametogênese ocorrem em um forma de montagem, como linear. Estas características fazem EdU, uma ótima ferramenta para estudar aspectos dinâmicos de células mitotically ciclismo e desenvolvimento da linha germinal. Este protocolo descreve como com êxito preparar EdU bactérias, alimentá-los para o selvagem-tipo c. elegans hermafroditas, dissecar a gônada hermafrodita, mancha para incorporação de EdU no DNA, mancha com anticorpos para detectar vários ciclo celular e marcadores do desenvolvimento, a gônada de imagem e analisar os resultados. O protocolo descreve as variações no método e análise para a medição de fase S índice M-fase índice, G2 duração, duração do ciclo celular, taxa de entrada meiótica e taxa de progressão da prófase meiótica. Esse método pode ser adaptado para estudar o ciclo celular ou história de celular em outros tecidos, estágios, origens genéticas e condições fisiológicas.

Introduction

No desenvolvimento do animal, centenas, milhares, milhões, bilhões ou mesmo trilhões de divisões celulares são necessários para formar o organismo adulto. O ciclo celular, o conjunto de eventos celulares compostas de G1 (gap), S (síntese), G2 (gap), e M (mitose) definir a série de eventos que são executados a cada divisão celular. O ciclo celular é dinâmico e melhor apreciada em tempo real, que pode ser tecnicamente difícil. As técnicas apresentadas neste protocolo permitem que se faça as medições das fases e o ciclo celular de imagens fixas.

Rotulagem com análogos de nucleosídeos como 5-ethynyl-2′-desoxiuridina (EdU) ou 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) é o padrão-ouro para identificar a fase S nos estudos de dinâmica do ciclo celular no adulto Caenorhabditis elegans (c. elegans) germline hermafrodita1,2,3,4,5. EdU e BrdU tanto podem ser usado em quase qualquer fundo genético, como eles não dependem de qualquer construção genética. Visualizar BrdU requer tratamento químico áspero para expor o antígeno para o anticorpo anti-BrdU coloração, que muitas vezes é incompatível com a avaliação de outros marcadores celulares visualizados por coloração com anticorpos adicionais de co. Em contrapartida, Visualizar o EdU ocorre pela química clique em condições suaves e, portanto, é compatível com o anticorpo que mancha co6,7.

A especificidade do rótulo é clara, desde que os núcleos só incorporam os análogos (5-ethynyl-2′-desoxiuridina) de timidina DNA durante a fase S. Visualização ocorre no tecido fixo. O rótulo de EdU é invisível por si só até um corante contendo azida sódica ou fluoróforo covalentemente reage com o alkyne em EdU por clique cobre-catalisada química8. EdU rotulagem pode fornecer informação imediata, na qual os núcleos estão em fase S, usando um curto pulso de rotulagem. EdU também pode fornecer informações dinâmicas, usando o pulso-chase ou rotulagem contínua; por exemplo, em um experimento de pulso-perseguição, o rótulo é diluído em cada divisão celular ou propagadas como nondividing de células de progresso através de desenvolvimento.

O germline hermafrodita de c. elegans é um sistema poderoso modelo para os estudos de sinalização de vias, células-tronco, ciclo celular e meiose. O adulto germline é uma linha de montagem polarizada com células-tronco encontradas na extremidade distal, seguida por entrada e progressão através da prófase meiótica, coordenado com as fases da gametogênese mais proximal (Figura 1). Na extremidade proximal, oócitos maduros, são ovularam e fertilizados e começam a embriogênese na útero9,10,11. A região de ~ 20 célula-diâmetro longo perto da célula de ponta distal, que inclui o tronco germline mitotically ciclismo, células progenitoras e meiose células em fase S, mas não as células na prófase meiótica, chama-se o progenitor zona2,4 , 9 , 12. as membranas celulares fornecem separação incompleta entre os núcleos no germline distal, mas células progenitoras zona passam por célula mitótica ciclismo em grande parte independente. A duração do ciclo de celular mitótica mediana do germline progenitoras de zona em jovens adultas hermafroditas é ~6.5 h; Fase G1 é curto ou ausente, e quiescência não é observada1,2,13. Diferenciação de células-tronco do germline ocorre através da modulação essencialmente direta e, portanto, carece de trânsito-amplificando divisões4. Durante a diferenciação na fase de paquíteno, aproximadamente 4 em 5 núcleos não formará oócitos, mas em vez disso, passam por apoptose, atuando como enfermeira células doando seu conteúdo citoplasmático para o desenvolvimento oócito12,14 , 15.

Além de rotulagem células em fase S com análogos de nucleosídeos, pode-se identificar as células em mitose e meiose usando anticorpos. Núcleos em mitose são imunorreativas para antifosfo-histona H3 (Ser10) Anticorpo (chamado pH3)7,16. Núcleos na meiose são imunorreativas para anticorpo antiele-3 (uma proteína de eixo de cromossomas)17. Núcleos na zona de progenitor podem ser identificados pela ausência de HIM-3, a presença de auxílio REC-8,18ou a presença de WAPL-119. WAPL-1 intensidade é maior na gônada somática, alta na zona de progenitor e baixa durante cedo meiótica prophases19. Várias medições de ciclo celular são possíveis, com algumas variações no protocolo: eu) identificar os núcleos na fase S e medir o índice de fase S; II) identificar núcleos em M-fase e medir o índice de M-fase; III) determinar se núcleos em S-fase mitótica ou meiótica; IV) medir a duração do G2; V) medir o duartion das fases G1 + G2 + M; VI) medir a taxa de entrada meiótica; VII) estimativa da taxa de progressão meiótica.

Pode-se fazer várias medições de ciclo celular de apenas alguns tipos de experimentos de laboratório-molhado. O protocolo abaixo descreve uma rotulagem de pulso de 30 min por alimentação c. elegans adultas hermafroditas com EdU rotulado de bactérias e células em fase M co rotulagem pela coloração com o progenitor e anticorpo anti-pH3 células zona por coloração com anticorpos anti-WAPL-1. Somente as alterações na duração do EdU alimentar (etapa 2.5), tipo de anticorpos empregados (etapa 5), e análises (passo 8.3) são necessárias para as medições adicionais.

Protocol

1. preparação de bactérias EdU-etiquetado Cultivar uma cultura de acionador de partida de MG1693. Escherichia coli MG1693 (Escherichia coli) carrega uma mutação em thyA. Raia para fora de e. coli MG1693 de um estoque de glicerol congelado em um ágar de caldo (LB) lisogenia 120 mm placa de Petri. Cultura a 37 ° C durante a noite. Inocular de duas individuais Escherichia coli MG1693 colônias em dois tubos de 4 mL de líquido cultur…

Representative Results

Como a síntese de DNA é necessária para incorporar o EdU, pode-se concluir que EdU-rotulado núcleos passou por fase S durante a janela de tempo de criação de etiquetas de EdU. Um pode interpretar os núcleos esse rótulo em uma alimentação de 30 min com EdU rotulado bactérias como núcleos em fase S no momento da dissecação. Núcleos que rotular em uma mais EdU contínua alimentação experimento podem ter rotulado cedo na janela de tempo e desde a fase S esquerdo, ou podem ter…

Discussion

Preparação de bactérias EdU-rotulado (etapa 1) é fundamental para este protocolo e o primeiro ponto para solução de problemas. Rótulo de tipo selvagem jovens adultos hermafroditas muito confiável em um EdU-pulso, inventando um controle útil para cada novo lote de bactérias EdU-rotulado de 4h. Além disso, intactas EdU-rotulado de bactérias que entram no intestino (em animais mais velhos ou certos mutantes defeituosos faringe/moedor) irão rotular com química clique e aparecem como partitura oblonga brilhante …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Estamos gratos ao centro de estoque de Escherichia coli para MG1693; Wormbase; o centro de genética Caenorhabditis que é financiado pelos institutos de saúde escritório de pesquisa infra-estrutura programas nacionais (P40OD010440) para cepas; Zach Pincus para consultoria estatística; Aiping Feng para reagentes; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar e John Brenner para treinamento, aconselhamento, apoio e discussão útil; e os laboratórios Kornfeld e Schedl para feedback sobre este manuscrito. Este trabalho foi financiado em parte pelo National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 à KK, R01 GM100756 TS] e uma bolsa predoctoral National Science Foundation [DGE-1143954 e DGE-1745038 de ZK]. O National Institutes of Health, nem a National Science Foundation tinha qualquer papel no desenho do estudo, coleção, análise e interpretação dos dados, nem por escrito o manuscrito.

Materials

E. coli MG1693 Coli Genetic Stock Center 6411 grows fine in standard unsupplemented LB
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Thermo Fisher Scientific C10337
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine Sigma 900584-50MG or use EdU provided in kit
Glucose Sigma D9434-500G D-(+)-Dextrose
Thiamine (Vitamin B1) Sigma T4625-5G Reagent Grade
Thymidine Sigma T1895-1G BioReagent
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M1880-1KG MgSO4, Reagent Grade
Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous Fisher BP332-500G Na2HPO4
Potassium Phosphate, monobasic Sigma P5379-500G KH2PO4
Ammonium Chloride Sigma A4514-500G NH4Cl, Reagent Plus
Bacteriological Agar US Biological C13071058
Calcium Chloride dihydrate Sigma C3881-500G CaCl
LB Broth (Miller) Sigma L3522-1KG Used at 25g/L
Levamisole Sigma L9756-5G 0.241g/10ml
Phosphate buffered saline Calbiochem Omnipur 6506 homemade PBS works just as well
Tween-20 Sigma P1379-500ML
16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules Electron Microscopy Sciences 15710 10ml ampules
100% methanol Thermo Fisher Scientific A454-1L Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies
Goat Serum Gibco 16210-072 Lot 1671330
rabbit-anti-WAPL-1 Novus biologicals 49300002 Lot G3048-179A02, used at 1:2000
mouse-anti-pH3 clone 3H10 Millipore 05-806 Lot#2680533, used at 1:500
goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012 Lot 1256147, used at 1:400
goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Lot 1511347, used at 1:400
Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Vector Laboratories H-1200 mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation
nail polish Wet n Wild DTC450B any clear nail polish should work
S-medium various see wormbook.org for protocol
M9 buffer various see wormbook.org for protocol
M9 agar various same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar
Nematode Growth Medium various see wormbook.org for protocol
dissecting watch glass Carolina Biological 42300
Parafilm laboratory film Pechiney Plastic Packaging PM-996 4 inch wide laboratory film
petri dishes 60 mm diameter
Long glass Pasteur pipettes
1ml centrifuge tubes MidSci Avant 2926
Tips
Serological pipettes
500 mL Erlenmyer flask
Aluminum foil
25G 5/8” needles BD PrecisionGlide  305122
5ml glass centrifuge tube Pyrex 
Borosilicate glass tubes 1ml
glass slides
no 1 coverslips 22 x 40 mm no 1.5 may work, also
37 °C Shaker incubator
Tabletop Centrifuge
Clinical Centrifuge IEC 428 with 6 swinging bucket rotor
Mini Centrifuge
20 °C incubator
4 °C refrigerator
-20 °C freezer
Observer Z1 microscope Zeiss
Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens Zeiss
Ultraview Vox spinning disc confocal system PerkinElmer  Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy 

References

  1. Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -. H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), 2223-2234 (2011).
  2. Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
  3. Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
  4. Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).
  5. Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
  6. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  7. vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
  8. ThermoFisher. . Click-iT EdU Imaging Kits. , (2011).
  9. Pazdernik, N., Schedl, T. . Germ Cell Development in C. elegans. , 1-16 (2013).
  10. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  11. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  12. Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
  13. Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
  14. Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).
  15. Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), 1011-1022 (1999).
  16. Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
  17. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), 2258-2270 (1999).
  18. Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).
  19. Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
  20. Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
  23. Vos, K. . De Cell Counter Plugin. , (2015).
  24. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Rasband, W. . ImageJ. , (2016).
  26. Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), 671-680 (2010).
  27. Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).
  28. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
  29. Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -. C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
  30. Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).
  31. . . Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , 1-7 (2010).
  32. Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).

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Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU. J. Vis. Exp. (140), e58339, doi:10.3791/58339 (2018).

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