Summary

Análisis de ciclo celular en la línea germinal de C. elegans con la EdU de análogo de la timidina

Published: October 22, 2018
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Summary

Se describe un método basado en la proyección de imagen que puede utilizarse para identificar la fase S y analizar la dinámica del ciclo celular en el germline hermafrodita C. elegans mediante la timidina EdU analógico. Este método no requiere transgenes y es compatible con la tinción inmunofluorescente.

Abstract

Análisis de ciclo celular en eucariotas con frecuencia utiliza la morfología del cromosoma, expresión y localización de productos génicos necesarios para diferentes fases del ciclo celular, o la incorporación de análogos de nucleósidos. Durante fase de S, polimerasas de la DNA incorporan a análogos de timidina como EdU o BrdU DNA cromosómica, las células para el análisis de la marca. Para C. elegans, el nucleósido análogo EdU se alimenta a los gusanos durante cultura regular y es compatible con técnicas de inmunofluorescencia. Germinales de C. elegans es un sistema potente para los estudios de señalización de vías, las células madre, meiosis y ciclo celular porque es transparente, genéticamente facile y profase meiótica y la diferenciación celular/gametogénesis ocurre en un forma de montaje-como lineal. Estas características hacen de EdU una gran herramienta para el estudio de aspectos dinámicos de células mitotically ciclismo y desarrollo de la línea germinal. Este protocolo describe cómo preparar EdU bacterias con éxito, darles de comer a tipo salvaje hermafroditas de C. elegans , diseccionar la gónada hermafrodita, de la mancha para la incorporación de EdU en el ADN, tinción con los anticuerpos al detectar varios ciclo celular y marcadores del desarrollo, la gónada de la imagen y analizar los resultados. El protocolo describe las variaciones en el método y el análisis para la medición de fase S índice, fase M índice, G2 duración, duración del ciclo celular, tasa de entrada meiótica y tasa de progresión de la profase meiótica. Este método se puede adaptar para estudiar el ciclo celular o la historia de células en otros tejidos, etapas, fondos genéticos y condiciones fisiológicas.

Introduction

En el desarrollo animal, cientos, miles, millones, miles de millones o incluso billones de divisiones celulares se requieren para formar el organismo adulto. El ciclo celular, el conjunto de eventos celulares por G1 (gap), S (síntesis), G2 (gap), y M (mitosis) definir la serie de eventos que son ejecutaron cada división celular. El ciclo celular es dinámica y mejor apreciado en tiempo real, que puede ser técnicamente difícil. Las técnicas presentadas en este protocolo permiten hacer las mediciones de las fases y tiempos del ciclo celular de imágenes fijas.

Etiquetado con análogos de nucleósidos como 5-ethynyl-2′-desoxiuridina (EdU) o 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) es el estándar de oro para identificar la fase S en los estudios de la dinámica del ciclo celular en el adulto de Caenorhabditis elegans (C. elegans) hermafroditas del germline1,2,3,4,5. EdU y BrdU pueden utilizarse en casi cualquier fondo genético, como no dependen de ningún concepto genética. Visualización de BrdU requiere tratamiento químico áspero para exponer el antígeno para el anticuerpo anti-BrdU de tinción, que a menudo es incompatible con la evaluación de otros marcadores celulares visualizadas mediante tinción con anticuerpos adicionales conjuntamente. Por el contrario, visualizar EdU se produce por la química del tecleo condiciones suaves y por lo tanto es compatible con el anticuerpo Co manchas6,7.

La especificidad de la etiqueta es clara, puesto que los núcleos sólo incorporan los análogos de timidina (5-ethynyl-2′-desoxiuridina) ADN durante la fase S. Visualización lleva a cabo en tejido fijo. La etiqueta de EdU es invisible por sí mismo hasta un colorante que contiene azida o fluoróforo covalente reacciona con el alquino en EdU de química cobre-catalizada del tecleo8. Etiquetado EdU puede proporcionar información inmediata en la que los núcleos son en fase S, mediante un breve impulso de etiquetado. EdU también puede proporcionar información dinámica, mediante pulso-persiga o etiquetas de continuo; por ejemplo, en un experimento de Pulso-persiga, la etiqueta se diluye en cada división celular o reproducidos como nondividing progreso de células a través del desarrollo.

El germline hermafrodita C. elegans es un sistema potente para los estudios de señalización de vías, las células madre, meiosis y ciclo celular. El germline adulto es una línea de ensamblaje polarizada con células madre en el extremo distal, seguido por la entrada y la progresión a través de la profase meiótica, coordinado con las etapas de la gametogénesis más proximal (figura 1). En el extremo proximal, ovocitos maduran, son ovularon y fertilizan y comienzan la embriogénesis en el útero9,10,11. La región larga de ~ 20 células de diámetro cerca de la célula de la punta distal, que incluye el vástago del germline mitotically ciclismo, células progenitoras y células en fase S meióticas pero no las células en profase meiótica, se llama el progenitor zona2,4 , 9 , 12. las membranas celulares proporcionan separación incompleta entre los núcleos en el germline distal, pero las células de la zona de progenitoras se someten a ciclismo en gran parte independientemente de la célula mitótica. La duración mediana ciclo celular mitótico de las células de zona de progenitor del germline en jóvenes adultos hermafroditas es ~6.5 h; Fase G1 es breve o ausente, y quietud no se observa1,2,13. Diferenciación de la célula de vástago del germline se produce a través de la diferenciación esencialmente directa y carece así de tránsito amplificando las divisiones4. Durante la diferenciación en la fase de paquiteno, aproximadamente 4 de cada 5 núcleos no forma ovocitos pero en cambio sufren apoptosis, actuando como enfermera células donando su contenido citoplasmático al ovocito en desarrollo12,14 , 15.

Además de etiquetado células en fase S con análogos de nucleósidos, uno puede identificar las células en mitosis y meiosis utilizando anticuerpos. Núcleo en la mitosis es inmunorreactivas para anti-phospho-histona H3 (Ser10) anticuerpo (llamado pH3)7,16. Los núcleos en la meiosis son immunoreactive a los anticuerpos anti-lo-3 (una proteína del eje del cromosoma meiótico)17. Núcleos en la zona del progenitor pueden identificarse por la ausencia de él-3, la presencia de nucleoplasmática REC-818o la presencia de WAPL-119. WAPL-1 intensidad es más alta en la gónada somática, alta en la zona de la progenitora y baja durante temprano meiótica prophases19. Varias mediciones de ciclo celular son posibles con algunas variaciones en el protocolo: I) identificar los núcleos en fase S y medir el índice de la fase S; II) identificar los núcleos en fase M y medir el índice de fase M; III) determinar si los núcleos estaban en S-fase mitótica o meiótica; IV) medir la duración de G2; V) medir la duración de las fases G2 + M + G1; VI) medir la velocidad de entrada meiótica; VII) estiman la tasa de progresión meiótica.

Uno puede hacer múltiples mediciones de ciclo celular de sólo algunos tipos de experimentos de laboratorio húmedo. El protocolo a continuación describe un etiquetado de pulso de 30 min por la alimentación de C. elegans adultos hermafroditas con EdU etiquetado como bacterias y células en fase M Co etiquetadas mediante tinción con el progenitor y el anticuerpo anti-pH3 las células de la zona mediante tinción con anticuerpos anti-WAPL-1. Sólo cambios en la duración de EdU de la alimentación (paso 2.5), tipo de anticuerpos emplean (paso 5), y análisis (8,3 de paso) son necesarios para las mediciones adicionales.

Protocol

1. preparación de bacterias EdU-labeled Cultivar una cultura de arrancador de MG1693. Escherichia coli MG1693 (e. coli) lleva una mutación en thyA. Racha a e. coli MG1693 de un stock de glicerol congelado en un agar de caldo (LB) de lisogenia 120 mm plato de Petri. Cultivo a 37 ° C durante la noche. Inocular de dos individuales e. coli colonias MG1693 en dos tubos de 4 mL del cultivo líquido lb a 37 ° C para h ~ 16 de duplicar.N…

Representative Results

Puesto que la síntesis de ADN es necesaria para incorporar a EdU, se puede concluir que núcleos marcados con EdU experimentaron la fase S durante la ventana Etiquetado EdU. Uno puede interpretar los núcleos etiqueta en una alimentación de 30 min con EdU etiquetado bacterias como núcleos en fase S en el momento de la disección. Núcleos que etiqueta en un EdU continua ya experimento de alimentación indicados en la última parte de la ventana del tiempo EdU o pueden han etiquetado co…

Discussion

Preparación de bacterias etiquetadas de EdU (paso 1) es fundamental para este protocolo y el primer punto para solucionar problemas. Etiqueta tipo salvaje jóvenes adultos hermafroditas muy confiablemente en un 4 h EdU-pulso, haciendo de este un control útil para cada lote nuevo de bacterias EdU-labeled. Además, bacterias EdU-con la etiqueta intactas que entran en el intestino (en animales más viejos o ciertos mutantes defectuosos de faringe grinder) etiqueta con química del tecleo y aparecen como brillante orificio…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al centro común de e. coli MG1693; Wormbase; el centro de genética de Caenorhabditis financiado por los institutos de salud oficina de investigación infraestructura programas nacionales (P40OD010440) para las cepas; Zach Pincus Consejo estadístico; Aiping Feng de reactivos; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar y John Brenner para capacitación, asesoramiento, apoyo y discusión útil; y los laboratorios Kornfeld y Schedl por comentarios sobre este manuscrito. Este trabajo fue financiado en parte por los institutos nacionales de salud [AG02656106A1 R01 a KK, GM100756 R01 a TS] y una beca predoctoral de la Fundación Nacional de Ciencias [DGE-1143954 y DGE-1745038 a ZK]. Los institutos nacionales de salud ni la National Science Foundation tenía cualquier papel en el diseño del estudio, colección, análisis e interpretación de datos, ni por escrito el manuscrito.

Materials

E. coli MG1693 Coli Genetic Stock Center 6411 grows fine in standard unsupplemented LB
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Thermo Fisher Scientific C10337
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine Sigma 900584-50MG or use EdU provided in kit
Glucose Sigma D9434-500G D-(+)-Dextrose
Thiamine (Vitamin B1) Sigma T4625-5G Reagent Grade
Thymidine Sigma T1895-1G BioReagent
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M1880-1KG MgSO4, Reagent Grade
Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous Fisher BP332-500G Na2HPO4
Potassium Phosphate, monobasic Sigma P5379-500G KH2PO4
Ammonium Chloride Sigma A4514-500G NH4Cl, Reagent Plus
Bacteriological Agar US Biological C13071058
Calcium Chloride dihydrate Sigma C3881-500G CaCl
LB Broth (Miller) Sigma L3522-1KG Used at 25g/L
Levamisole Sigma L9756-5G 0.241g/10ml
Phosphate buffered saline Calbiochem Omnipur 6506 homemade PBS works just as well
Tween-20 Sigma P1379-500ML
16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules Electron Microscopy Sciences 15710 10ml ampules
100% methanol Thermo Fisher Scientific A454-1L Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies
Goat Serum Gibco 16210-072 Lot 1671330
rabbit-anti-WAPL-1 Novus biologicals 49300002 Lot G3048-179A02, used at 1:2000
mouse-anti-pH3 clone 3H10 Millipore 05-806 Lot#2680533, used at 1:500
goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012 Lot 1256147, used at 1:400
goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Lot 1511347, used at 1:400
Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Vector Laboratories H-1200 mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation
nail polish Wet n Wild DTC450B any clear nail polish should work
S-medium various see wormbook.org for protocol
M9 buffer various see wormbook.org for protocol
M9 agar various same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar
Nematode Growth Medium various see wormbook.org for protocol
dissecting watch glass Carolina Biological 42300
Parafilm laboratory film Pechiney Plastic Packaging PM-996 4 inch wide laboratory film
petri dishes 60 mm diameter
Long glass Pasteur pipettes
1ml centrifuge tubes MidSci Avant 2926
Tips
Serological pipettes
500 mL Erlenmyer flask
Aluminum foil
25G 5/8” needles BD PrecisionGlide  305122
5ml glass centrifuge tube Pyrex 
Borosilicate glass tubes 1ml
glass slides
no 1 coverslips 22 x 40 mm no 1.5 may work, also
37 °C Shaker incubator
Tabletop Centrifuge
Clinical Centrifuge IEC 428 with 6 swinging bucket rotor
Mini Centrifuge
20 °C incubator
4 °C refrigerator
-20 °C freezer
Observer Z1 microscope Zeiss
Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens Zeiss
Ultraview Vox spinning disc confocal system PerkinElmer  Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy 

References

  1. Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -. H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), 2223-2234 (2011).
  2. Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
  3. Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
  4. Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).
  5. Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
  6. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  7. vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
  8. ThermoFisher. . Click-iT EdU Imaging Kits. , (2011).
  9. Pazdernik, N., Schedl, T. . Germ Cell Development in C. elegans. , 1-16 (2013).
  10. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  11. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  12. Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
  13. Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
  14. Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).
  15. Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), 1011-1022 (1999).
  16. Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
  17. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), 2258-2270 (1999).
  18. Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).
  19. Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
  20. Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
  23. Vos, K. . De Cell Counter Plugin. , (2015).
  24. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Rasband, W. . ImageJ. , (2016).
  26. Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), 671-680 (2010).
  27. Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).
  28. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
  29. Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -. C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
  30. Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).
  31. . . Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , 1-7 (2010).
  32. Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).

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Cite This Article
Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU. J. Vis. Exp. (140), e58339, doi:10.3791/58339 (2018).

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