Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Høj overførselshastighed måling af Plasma membran genforsegling effektivitet i pattedyrceller

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58351
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3
1Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

Summary

Her beskriver vi en høj overførselshastighed fluorescens-baseret analyse, der måler plasmamembran genforsegling effektivitet gennem fluorometriske og billedbehandling analyser i levende celler. Denne analyse kan anvendes til screening af narkotika eller target gener, der regulerer plasmamembran genlukning i pattedyrsceller.

Abstract

I deres fysiologiske miljø udsættes pattedyrceller ofte for mekaniske og biokemiske understreger, at resultere i plasma membran skader. Svar på disse skader reseal komplekse molekylære machineries hurtigt plasma membran for at genoprette sin barriere funktion og vedligeholde celle overlevelse. Trods 60 års forskning på dette område mangler vi stadig en grundig forståelse af cellen genforsegling maskiner. Med mål at identificere cellulære komponenter at kontrol plasmamembran genforsegling eller lægemidler, der kan forbedre lukning, har vi udviklet et fluorescens-baserede høj overførselshastighed assay, der måler plasmamembran genforsegling effektivitet i pattedyrceller kulturperler i mikroplader. Som en modelsystem for plasma membran skader, celler er udsat for bakteriel poreformede toksin listeriolysin O (LLO), der danner store 30-50 nm diameter proteinholdige porer i kolesterol-holdige membraner. Brug af en temperatur-kontrolleret multi-mode mikrotiterplade læser giver mulighed for hurtige og følsomme spectrofluorometric målinger i kombination med brightfield og Fluorescens mikroskopi billeddannelse af levende celler. Kinetic analyse af fluorescens-intensiteten udsendes af en membran impermeant nukleinsyre-bindende fluorokrom afspejler omfanget af membran sårede og lukning på befolkningsniveau celle, giver mulighed for beregning af cellen genforsegling effektivitet . Fluorescens mikroskopi imaging giver mulighed for tælling af celler, som constitutively udtrykker en fluorescerende chimera af nukleare protein Histon 2B, i hver brønd af mikrotiterplade for at tage højde for potentielle ændringer i deres antal og giver mulighed for eventuel identifikation af forskellige cellepopulationer. Denne høj overførselshastighed assay er et kraftfuldt værktøj forventes at udvide vores forståelse af membran reparation mekanismer via screening for værten gener eller eksogent tilføjet forbindelser at kontrol plasmamembran lukning.

Introduction

Mammale celler kan mekanisk, osmotisk og biokemiske stress, hvilket resulterer i tab af plasma membran integritet. Uden hurtig og effektiv lukning, ville beskadigede celler hurtigt bukke under for programmeret eller nekrotisk død. Siden 1960 ' erne, har bestræbelser på at forstå den plasma membran genforsegling proces været motiveret af de ødelæggende konsekvenser forbundet med dens dysfunktioner. Faktisk, sygdomme som lemmer-bælte muskelsvind, diabetes og Chediak-Higashi syndrom er blevet forbundet med mangelfuld plasmamembran reparation på grund af mutationer i genet kodning dysferlin, produktion af avanceret glykering slutprodukter og defekter i den lysosomale menneskehandel regulator CHS1, henholdsvis1,2,3,4,5,6. Men til dato, vores forståelse af membran genforsegling er stadig begrænset7. Indledende undersøgelser har vist, at membranen genforsegling initieres af tilstrømningen af ekstracellulære Ca2 + gennem beskadigede plasmamembran8,9,10. Siden da har flere ikke-gensidigt eksklusive Ca2 +-afhængige mekanismer er blevet foreslået til at forsegle celler. Patch hypotese foreslår, at i nærheden af såret, intracellulære vesikler fuse med hinanden og de beskadigede plasma membran til at fungere som en patch11,12,13,14. En anden model foreslår at calcium-afhængige exocytose af lysosomer på såret site frigiver lysosomale enzym syre sphingomyelinase, som konverterer sphingomyelin til ceramid i den ydre folder af plasmamembran. Denne pludselige ændring i lipid sammensætning resulterer i ceramid-drevet endocytose af beskadigede region15,16,17. Endelig, den tredje foreslåede ordning indebærer en rolle ved endosomal sortering komplekse kræves for transport (ESCRT) til at fremme dannelsen af vender udad blærer, der bud ud fra plasma membran18. Kun et begrænset sæt af proteiner var identificeret i disse modeller, og maskinerne skal blive yderligere belyst.

Her beskriver vi en høj overførselshastighed analyse, at foranstaltninger plasmamembran genforsegling effektivitet i vedhængende mammale celler udsat for skade medieret af rekombinante listeriolysin O (LLO)19. LLO er en poreformede toksin (PFT) udskilles af fakultativ intracellulære patogenet Listeria monocytogenes20,21,22 og tilhører MACPF/CDC (membran angreb kompleks, perforin, og kolesterol-afhængige cytolysin) superfamilien. MACPF er pattedyr poreformede proteiner involveret i immun forsvar, hvorimod CDCs er bakteriel toksiner primært produceret af Gram-positive patogener, der skader værtsceller til at fremme deres patogene livsstil23. CDCs er syntetiseres som vandopløselige monomerer eller dimerer, der binder til kolesterol i plasma membranen og oligomerize til en prepore kompleks med op til 50 underenheder. Prepore komplekse omarrangerer derefter for at indsætte β-tråde på tværs af lipid tolagede, danner en β-tønde pore, der strækker sig over 30-50 nm i diameter24,25,26,27.  Disse store porer tillade transport af ioner og små cellulære komponenter ind og ud af cellen. nogle undersøgelser har dog foreslået, at porerne i mindre størrelser er også dannet28,29,30. Blandt CDCs viser LLO unikke egenskaber herunder irreversibel pH - og temperatur-afhængige sammenlægning, som er befordrende for høj overførselshastighed analyser31,32. LLO kan føjes til cellekulturmedium på 4 ˚C, en eftergivende til sin binding til celler, men ikke til dannelsen af pore komplekse temperatur. Indledning af pore dannelse kan derefter synkroniseres ved at hæve temperaturen til 37 ˚C, giver mulighed for effektiv udbredelse af toksin molekyler i flyet af membran til form oligomerer og konformationelle remodeling involveret i pore generation. Derfor, efter parameteren i temperatur, den kinetiske af celleskader vil afhænge af mængden af toksin bundet til plasmamembran. Vigtigere, opløselige LLO (ikke bundet til plasmamembran) hurtigt og uigenkaldeligt aggregater når temperaturen når 37 ˚C, som letter behovet for at vaske væk ubundne toksin molekyler og begrænser omfanget af membran skader over tid. Endelig fordi LLO binder sig til kolesterol og danner porer i kolesterol-rige membraner, er denne analyse genstand for en bred vifte af pattedyrsceller. Det er vigtigt at huske på at LLO påvirker vært celle signalering primært via pore dannelse, med et par undtagelser i hvilke pore-uafhængig celle signalering kan forekomme33,34,35,36 ,37,38,39. Derfor kan det ikke være udelukket at LLO signalering aktiviteter kan påvirke processen med membran reparation.

Denne analyse vurderer direkte omfanget af celle såret ved at måle inkorporering af en celle impermeant fluorokrom (fx, propidium Iodid), passivt træder sårede celler og bliver stærkt fluorescerende når det associates med nukleinsyrer . Derfor, fluorokrom kan opretholdes i cellekulturmedium hele eksperimentet, giver mulighed for real-time analyser af celle såret. Fluorescens-intensiteten af nukleinsyre-bindende farvestof vil stige med koncentrationen af toksin og til en given koncentration af giftstof, vil stige over tid, indtil alle porer dannes, og cellerne er fuldt repareret eller mætning er nået. Tilstrømningen af ekstracellulære Ca2 + gennem membranen porer er en conditio sine qua non begivenhed for lukning. Derfor, den resealing effektivitet indirekte kan dokumenteres ved at sammenligne celle såret i dyrkningsmediet indeholdende Ca2 + (reparation eftergivende tilstand) til såret i en Ca2 +-gratis medium (reparation restriktivt forhold). Fordi fluorescens-intensiteten af nukleinsyre-bindende farvestof er direkte proportional med koncentrationen af celle i hver brønd, er det vigtigt at frø celler i de samme koncentration i alle brønde. Det er også vigtigt at optælle celler i hver brønd, før og efter analysen til at sikre, at cellen udstationering ikke forekommer, som flydende, aggregerede celler kan sløre fluorescens aflæsninger, hvilket kan komplicere data fortolkning. Hvis du vil optælle celler, blev celler, der udtrykker nukleare lokaliseret Histon 2B-normal god landbrugspraksis (H2B-NGL) brugt i denne analyse. Temperaturstyret, multi-mode, mikrotiterplade læsere kombinere hurtige, høj overførselshastighed målinger (ved hjælp af en 96 eller 384-godt plade format) af fluorescens intensiteter med mikroskopi billeddannelse af levende celler ved 37 ° C. Sidstnævnte kan bruges til at optælle celle nummer og observere den endelige dannelse af forskellige cellepopulationer.

I sidste ende, denne analyse giver brugerne mulighed for at udvide deres kendskab til kompleksiteten af membran reparation mekanismer ved screening for værten molekyler eller eksogent tilsat stoffer, der kan styre membran reparation. Følgende protokol beskriver de eksperimenterende trin til at måle resealing effektiviteten af celler udsat for LLO og evaluere virkningerne af et bestemt stof eller cellulære behandling på genforsegling effektivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse

  1. Celle Plating
    Bemærk: Menneskelige cervikal epitelceller, HeLa og HeLa udtrykker Histon 2B-normal god landbrugspraksis (H2B-NGL), blev brugt i denne protokol, men dette assay kan tilpasses til andre pattedyrceller19.
    1. Frigør vedhængende celler fra en 75 cm2 celle kultur kolben ved vask celler med 2 mL Trypsin-EDTA 0,25%. Erstatte den anvendte trypsin med 2 mL frisk trypsin-EDTA 0,25%.
    2. Inkuber celler på 37 ˚C i 5 min, indtil cellerne har rundet og løsrevet fra kolben.
    3. Resuspend celler i 8 mL af vækstmediet (DMEM indeholder 10% varme-inaktiverede føtal bovint serum, 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin).
    4. Bestemme den celle koncentration ved hjælp af en hemocytometer og 10 µL af cellesuspension.
    5. Fortyndes cellerne i vækstmediet til en koncentration af 2,5 x 105 celler/mL.
    6. Hæld cellesuspension i en steril pipette basin og blandes grundigt suspensionen ved hjælp af 10 mL serologisk pipette.
    7. Brug en 12-multikanal mikropipette og 200 µL tips, Distribuer HeLa celler (2,5 x 104 celler/100 µL/brønd) i tre eksemplarer (eller fire eksemplarer) i en 96-godt flad, klar, sort polystyren vævskultur-behandlede bundplade.
      Bemærk: En plating arrangement er præsenteret som et eksempel i figur 1.
    8. Kultur celler i 24 timer i en fugtig celle kultur inkubator på 37 ˚C og 5% CO2.
  2. Stamopløsningen forberedelse
    1. Forbered 1 L, en 10 x bestand af buffer M (brugt til at forberede M1 og M2) ved at tilføje 95 g af Hanks afbalanceret saltopløsning, 0.476 g af MgCl2 (5 mM), og 23.83 g af HEPES (100 mM) til 900 mL vand. PH indstilles til 7,4 og hæve lydstyrken til 1 L. Filter sterilisere.
    2. Forbered 50 mL 50 x (1,25 M) bestand af glucose ved at tilføje 11.26 g af D-(+)-Glucose til i alt 50 mL vand. Filter sterilisere løsningen.
    3. Forbered 50 mL af en 100 x (120 mM) bestand af calcium ved at tilføje 0.666 g af CaCl2 til i alt 50 mL vand. Filter sterilisere løsningen.
    4. Forberede 50 mL af en 10 x (50 mM) bestand af ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N', tetraacetic syre (EGTA) ved at tilføje 0.951 g af EGTA til 40 mL vand. Øge pH til 8 med NaOH til at opløse EGTA, så hæve lydstyrken til 50 mL. Filter sterilisere løsningen.
    5. For en enkelt 96-brønd plade, forberede 50 mL Medium 1 (M1, indeholder Ca2 +), 50 mL af Medium 2 (M2, Ca2 +-gratis), og 15 mL Medium 2 suppleres med EGTA, således:
      1. For M1, tilsættes 5 mL 10 x Buffer M, 0,5 mL af 100 x CaCl2og 1 mL af 50 x glukose til 43,5 mL vand.
      2. For M2, tilsættes 5 mL 10 x Buffer M og 1 mL af 50 x glukose 44 mL vand.
      3. For M2/EGTA, der tilsættes 1,5 mL 10 x Buffer M og 1,5 mL af 10 x EGTA til 12 mL vand.
        Bemærk: Alle opløsninger indeholdende propidium Iodid (PI) bør tilberedes direkte forud for tilføjelse til cellerne.
  3. Plade læser/Imaging forskellige indstillinger
    Bemærk: Bruger en multi-mode Pladelæser udstyret med to enheder, opdagelse: en spectrofluorometer og en tænkelig Flowcytometret. Begrænse fluorescens eksponering for at undgå photobleaching i fluorophores.
    1. Pre varme Pladelæser til 37 ° C før udførelse af analysen.
    2. Opsætning af parametre for den kinetiske assay i overensstemmelse hermed inden for tilstanden Indstillinger :
      1. Vælg Monochromator, FL (Fluorescens)og kinetisk til den optiske konfiguration, læse tilstande og læse type, henholdsvis.
      2. Vælg en 9 og 15 nm excitations- og bandpass, under Indstillinger for bølgelængde. For assays ved hjælp af propidium Iodid (PI), angive excitations- og bølgelængder til 535 og 617 nm, henholdsvis.
      3. Vælg 96 brønde for formatet plade og en forudindstillet plade konfiguration svarende til en sort-væg klart bundplade under Plade Type.
      4. Under Læse område, fremhæve de brønde, der vil blive analyseret i hele den kinetiske.
      5. Under ydelse og optik, preset blinker pr. Læs 6 og indskrive boksen nemlig læse fra bunden.
      6. Under Timing, Indsæt 00:30:00 i feltet Samlede operationstid efter en 30 min kinetic analyse, og Indsæt 00:05:00 for Interval.
        Bemærk: For hver gang pege og én bølgelængde, læsning tid af en fuld 96-brønd plade er 30 s.
      7. Bekræfte de angivne indstillinger i Indstillingsoplysninger til højre, og vælg OK. Tryk på Læs at indlede den kinetiske køre.
    3. Indstille parametrene billedbehandling i overensstemmelse hermed inden for tilstanden indstillinger:
      1. Vælg Minimax, Imagingog slutpunkt for den optiske konfiguration, læse tilstande og læse type, henholdsvis.
      2. Under bølgelængder, Vælg gennemfaldende lys, og en af eller begge felterne fluorescens svarende til excitations- og bølgelængder af 456/541 nm (normal god landbrugspraksis) og 625/713 nm (PI).
      3. Bruge de samme muligheder for Plade Type og Læse område , som defineret i trin 1.3.2.3 og 1.3.2.4.
      4. Under Godt område indstilling, skal du vælge antallet af websteder i en brønd til afbildning.
        Bemærk: 12 steder svarer til en fuld-godt billede.
      5. Vælg eksponering gange under Billedindstillinger erhvervelsetil overføres lys, 541 (normal god landbrugspraksis) og 713 (PI). For normal god landbrugspraksis, image hele godt med en eksponeringstid på 20 ms/billede. For transmitteres lys (TL) og PI fluorescens, erhverve et enkelt billede i midten af hver brønd med eksponering gange 8 og 20 MS, henholdsvis.
      6. Bekræfte de angivne indstillinger i oplysninger om Indstillinger til højre og vælg OK. Erhvervelse tid for imaging hele overfladen af hver brønd (12 billeder/brønd) af en 96-brønd plade og en bølgelængde er ~ 15 min. Tryk Læs at indlede billeddannelse.
        Bemærk: Erhvervelse tid af et enkelt billede/godt af en 96-brønd plade kræver ~2.5 min/plade til én bølgelængde. De parametre, der er beskrevet ovenfor svarer til den specifikke udstyr i vores laboratorium. Spectrofluorometric målinger: en xenon flash lampe viser 1,0 nm increment excitation bølgelængder (250-850 nm) med en justerbar 9 eller 15 nm bandpass, en photomultiplier tube detector med en > 6 log dynamikområde og en justerbar 15 eller 25 nm emission BANDPASS. Imaging forskellige: en belysning lyskilde i stand til af hvidt lys, 460 nm og 625 nm excitation bølgelængder med en 20 nm bandpass, emission filtre centreret på 541 nm (108 nm bandpass) og 713 nm (123 nm bandpass), henholdsvis, og en 4 X mål koblet til en 1,25 12-bit charge - sammen enhed-megapixelkameraet.

2. analysen

Bemærk: På tidspunktet for analysen, celler skal være 70-90% sammenflydende. Under vask skridt, bør mellemlang udtages fra og anvendes til sidevæg af godt (ikke direkte over celler). Holde temperaturen af LLO på < 4 ˚C til at forhindre dens sammenlægning indtil trin 3.1.5.

  1. Forberede et lager af 30 µM PI i M1 og et lager af 30 µM PI i M2 pre varmes på 37 ˚C.
  2. Forsigtigt vaske cellerne i plade 1 ved hjælp af en 12-multikanal mikropipette og 200 µL tips, som følger:
    1. For reparation-eftergivende vilkår, fjerne vækstmediet og vaske cellerne to gange med 200 µL/brønd M1 pre varmes på 37 ˚C. Udskift mediet med 100 µL/brønd af varm M1, som indeholder 30 µM PI.
    2. For reparation restriktive betingelser, fjerne vækstmediet og vaske cellerne en gang med 200 µL/brønd varm M2 indeholdende 5 mM EGTA til Chelat Ca2 +, efterfulgt af en vask med 200 µL/brønd M2. Udskift mediet med 100 µL/brønd varm M2 indeholdende 30 µM PI.
    3. Når vækstmediet er blevet vasket og erstattet med medium indeholdende propidium Iodid, flytte direkte til trin 2.1.3.
  3. Image plade 1 under gennemlysning, normal god landbrugspraksis og PI som detaljeret henhold 1.3.3 (pre kinetic). Dette trin tager 15-20 min.
  4. I perioden 15 min i skridt 2.1.3 forberede plade 2 ved hjælp af en 12-multikanal mikropipette og 200 µL tips som følger:
    1. Placer en 96-brønd rund bund polypropylen mikrotiterplade på is. Konfigurere pladen ved hjælp af en eksperimenterende design svarer til plade 1 (figur 1).
    2. For reparation-eftergivende vilkår, tilføje 100 µL/brønd af iskold M1, der indeholder 60 µM PI, efterfulgt af tilsætning af 100 µL/brønd af iskold M1 indeholdende 4 x LLO eller ikke til kontrol.
    3. For reparation-restriktive betingelser, tilføje 100 µL/brønd af iskold M2, der indeholder 60 µM PI, efterfulgt af tilsætning af 100 µL/brønd af iskold M2 indeholdende 4 x LLO eller ikke til kontrol.
  5. Efter imaging plade 1 (trin 2.1.3), straks skal du placere den på is, Adskil pladen fra direkte kontakt med isen med aluminiumsfolie. Tillad plade 1 til at køle ned i 5 min.
  6. Brug en 12-multikanal mikropipette og 200 µL tips, overføres 100 µL fra hver brønd til plade 2 (trin 2.1.4) til de tilsvarende huller i pladen 1. For at korrekt distribuere toksin i medierne om pladen 1, indsætte tips under menisken og forsigtigt skubbe volumen uden at indføre bobler.
    Bemærk: Ikke pipetteres op og ned, da dette kan uforvarende frigør cellerne.
  7. Forlade plade for en yderligere 1 min til at tillade toksin til at binde til cellerne og straks overføre plade 1 til Pladelæser til kinetic analysen ved hjælp af spectrofluorometer tilstanden (trin 1.3.2).
  8. For enden af den kinetiske assay straks billede plade 1 (post kinetic) ved hjælp af trin 1.3.3.

3. analyse: Celle optælling

  1. Bestemme celletal baseret på den nukleare fluorescens bruger mikrotiterplade celle optælling software.
    1. Inden for Indstillinger, Vælg Re-analyse, og vælg Diskret objekt analyse ved hjælp af 541 som bølgelængden for at finde objekter under afsnittet kategori inden for Analyse billedindstillinger .
    2. Inden for indstillingen Find objekter, ved hjælp af den trække på billeder at finde metode, Vælg kerner under fanen Indstillinger, og tryk på Anvend.
    3. Tryk på OK og læse at indlede celle tælle algoritme.
  2. Alternativt, hvis noget sådant værktøj er tilgængelig, brug en billede analyse software såsom ImageJ optælles celler.
    1. ImageJ, Åbn billedfilen som en stak.
    2. Konvertere stakken til 8-bit gråtoner billeder ved at klikke på billedet i menu advokatstanden, hover over Type, og vælg 8-bit.
    3. Trække fra baggrunden: Klik på billede i menuen, svæve over Justerog vælge Lysstyrke/kontrast. Justere minimumværdien for at fjerne baggrundsstøjen og vælge Anvend.
    4. Tærsklen til at skabe binære billeder: Klik på billede i menuen, svæve over Justerog vælge tærskel. Vælg mørk baggrund, justere de minimale og maksimale grænseværdier, og klik på Anvend.
    5. For så vidt angår overlapper atomkerner, kan et vandskel værktøj bruges til segment kerner. Klik på proces i menuen, hover over binære og vælg vandskel.
      Bemærk: Dette vil automatisk adskille tilsluttede kerner.
    6. Analysere de maskerede billeder ved at anvende bruger-specificerede kriterier (størrelse og cirkularitet) at forfine identifikation af kerner og udelukke celle debris.
      1. Klik på analyser i menuen og derefter analysere partikler. Angiv den ønskede størrelse (pixel ^ 2) og cirkularitet (en værdi på 1 er en perfekt cirkel) varierer, er tilstrækkelige til at omfatte individuelle celler/kerner.
      2. Vælg indstillingerne ønskes i boksen Vis dropdown kontrollere Summér, og klik på OK for at få celletal.

4. analyse: Kinetic kurver

  1. Overføre den kinetiske data fra plade reader software til en analysedata software.
  2. For hver eksperimentelle betingelse, den gennemsnitlige fluorescens-intensiteten af replikater på hvert tidspunkt, sammen med den tilsvarende standardafvigelse og standard fejl af middelværdien for hver eksperimentelle betingelse.
  3. For hver eksperimentelle betingelse, spore den tilsvarende kinetic kurve: PI intensitet (y-aksen) versus tid (x-akse).
  4. For at beregne resealing effektiviteten af en given behandling tilstand, beregne arealet under kurven (AUC) af de + LLO i M1 (AUC(M1)) og + LLO i M2 (AUC(M2)). Brug metoden foreslået nedenfor til at vurdere effektivitet (E) lukning:
    Equation
  5. Udføre en sammenligning mellem kontrol og test behandling ved at bestemme effektivitet-forholdet (REff) er angivet nedenfor:
    Equation 2
    REFF = 1, test behandling har ingen effekt på reparation
    REFF < 1, test behandling hæmmer reparation
    REFF > 1, test behandling forbedrer reparation
  6. Beregn arealet under kurven ved hjælp af følgende ligning:
    Equation 3, hvor k er det samlede antal opfølgninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Celle tælle nøjagtighed: HeLa celler anvendes ofte som en model pattedyr cellelinie for at udforske membran reparations-mekanismer. Ved vurderingen af membran reparation på cellen befolkningsniveau, er det vigtigt at pladen celler i de samme koncentration i alle brønde for korrekte data fortolkning. Det er også vigtigt at kontrollere på tidspunktet for analysen, celle tal er tilsvarende på tværs af brønde. HeLa celler, der constitutively express Histon 2B smeltet til normal god landbrugspraksis (H2B-NGL) blev indført i dette assay automatisk optælles celler baseret på påvisning af deres fluorescerende kerner. For at etablere nøjagtigheden i celle optællingen, blev seriel Tofoldsfortyndinger af HeLa H2B-NGL celler forgyldt i tredobbelt i en 96-brønd plade og kulturperler for 4 h. Dette beløb af tid er tilstrækkelige for celle vedhæftet fil og giver begrænset celledeling. Fuld wells blev afbildet under gennemlysning (TL) og normal god landbrugspraksis fluorescens Illuminationer og celletal vurderet baseret på normal god landbrugspraksis fluorescens bruger plade læser analyse software (figur 2A og 2B). Den gennemsnitlige celle tæller ± standardafvigelse var plottes i celle såning koncentrationer, og en linje af bedste pasform er angivet en 1.08:1 forholdet mellem celletal til celle såning, demonstrere rigtigheden af optællingen (figur 2 c). Af imaging alle brøndene før en kinetisk analyse, kan det sikres, at celle numre er konsekvent blandt alle brønde. Også, af imaging brønde efter den kinetiske assay, kan man etablere hvis udsættelse for at toksin forårsaget celle detachement.

Udtryk for normal god landbrugspraksis ikke forstyrrer propidium Iodid (PI) intensitet målinger (IPI): at sikre, at H2B-normal god landbrugspraksis nukleare foreningen ikke forstyrre PI stiftelsesoverenskomst eller PI fluorescens intensitet måling (IPI), IPI blev sammenlignet med HeLa og HeLa H2B-NGL celler, der blev udsat, eller ikke, til 1 nM LLO (figur 3). I mangel af PI var der et tilsvarende lavt niveau af baggrunden fluorescens i HeLa og HeLa H2B-normal god landbrugspraksis, der angiver, at normal god landbrugspraksis ikke bløder igennem PI fluorescens emission filtre. I nærværelse af PI, men mangel af LLO var der en lignende basal PI fluorescens emission i både HeLa og HeLa H2B-NGL, der ikke ændre sig over tid. Dette bekræftede, at udtryk for normal god landbrugspraksis ikke påvirker målingen af PI fluorescens og anført, at PI ikke trænge ikke beskadigede celler over tidsramme for eksperimentet. Tilsætning af LLO resulterede i en stigning i PI fluorescens over tid, der var den samme i både HeLa og HeLa H2B-normal god landbrugspraksis. Denne stigning skyldes celle såret af LLO kombineret med PI sammenslutning med nukleinsyrer. Sammen, opstille disse resultater at udtryk af Histon-2B-normal god landbrugspraksis ikke påvirker PI stiftelsesoverenskomst eller måling af dens fluorescens.

PI fluorescens ikke forstyrrer normal god landbrugspraksis-baserede celle optælling: indbygget, det var vigtigt at kontrollere, at PI nukleare indarbejdelse i sårede celler ikke forstyrrer normal god landbrugspraksis-baserede celle optælling. Repræsentative fluorescens billeder af HeLa og HeLa H2B-NGL udsat for 1 nM LLO i overværelse af PI viste at der var en markant ophobning af PI i sårede celler post kinetik, som forventede (figur 4A). Imaging afslørede også, at PI kunne bløder igennem normal god landbrugspraksis fluorescens påvisning (figur 4A og tabel 1). Denne fluorescens crossover var bedst værdsat på de post kinetisk billeder af HeLa celler, der ikke udtrykke normal god landbrugspraksis, men stadig vises grøn fluorescerende kerner (figur 4A). Denne crossover kan også dokumenteres ved måling af normal god landbrugspraksis fluorescens intensitet (Inormal god landbrugspraksis) i HeLa H2B-NGL celler, som væsentligt øget post kinetic sammenlignet med pre-kinetic (figur 4B). Vigtigere, påvirker PI fluorescens crossover ikke celle tælle fordi segmentering processen involveret i optællingen af kerner er upåvirket af en stigning i normal god landbrugspraksis fluorescens (figur 4 c).

Måling af plasma membran genforsegling effektivitet: I dette afsnit, præsenterer vi den grundlæggende metode anvendes til at måle effektiviteten af membran lukning. For at beviser proces membranen lukning, HeLa H2B-NGL celler blev udsat, eller ej, til 1 nM LLO i (M1) eller ej (M2) af ekstracellulære Ca2 + (figur 5). Som forventet, i mangel af LLO, forblev IPI konstant i M1 og M2. Tilsætning af LLO i Ca2 +-indeholdende medium resulterede i en støt stigning i PI fluorescens intensitet (IPI), der henviser til, at i mangel af ekstracellulære Ca2 +, der var en væsentlig stejlere stigning i PI fluorescens, afspejler den fravær af membran lukning. At vurdere resealing effektivitet, som er defineret som kapaciteten af celler til at reparere i M1 i forhold til M2 (trin 1.5.4.1), blev fastslået areal under M1 og M2 kurver (AUC) og effektiviteten af reparation (E) blev beregnet til 0.287.

Et alternativ til PI: PI har været allestedsnærværende anvendes som markør for plasma membran skader. Der er dog andre nukleinsyre bindende farvestoffer, der er også velegnet til dette assay. For eksempel, en membran impermeant carbocyanine nukleinsyre bindende farvestof (CNABD) udstiller en emission spektrum at nå ind i langt røde og har en høj specificitet for dobbelt strandede DNA. PI bindes til gengæld både DNA og RNA40,41. I modsætning til PI overlapper excitation og emission spektre af CNABD ikke med de af normal god landbrugspraksis giver mulighed for bedre spektrale opløsning mellem de to fluorokromer. CNABD anvendes i denne protokol har desuden en udslettelse koefficient næsten to gange af PI, som betyder, at deres respektive excitation bølgelængder, dette farvestof er bedre i stand til at absorbere energi end PI resulterer i en stærkere fluorescens emission. Kvantitative fluorescens analyse af CNABD og normal god landbrugspraksis billeder viste, at dette farvestof udstiller en stor fluorescens dynamikområde, væsentligt udsender ikke bølgelængder af normal god landbrugspraksis fluorescens, og påvirker ikke celletal (figur 6A-D). Faktisk, HeLa H2B-NGL celler inkuberes i M1 eller M2 medier indeholdende CNABD og beskadiget af 1 nM LLO udstillet en 4 og 5.5 gange stigning i jegCNABD i forhold til de ikke-skadede kontrolelementer, henholdsvis (figur 7A). Til sammenligning, celler udsat for 1 nM LLO i overværelse af PI udstillet en 2,5 og 3 gange stigning i PI fluorescens intensitet i M1 og M2, henholdsvis (figur 5). Indkvartering PI, CNABD udstiller stigende fluorescens intensitet med stigende LLO koncentration i M1 (figur 7A), og den deraf følgende reparation effektivitet blev beregnet som beskrevet i trin 1.5.4.1 (figur 7B). Vi rapporterer at cellen genforsegling effektiviteten falder som LLO koncentration stigninger. Dette fænomen afspejler det faktum, at celler formindske deres evne til at forsegle når overdreven skader er forårsaget.

Kvalitetsvurdering af membran reparation assay: et kritisk aspekt i enhver analyse er dens robusthed eller evne til at opdage og løse forskelle mellem den negative og positive kontrol. Signal variation mellem positive og negative kontroller skal vise tilstrækkelig dynamikområde og reproducerbarhed. I denne membran reparation assay er de positive og negative kontroller celler udsat for LLO i reparation-eftergivende (M1) og reparation-restriktive betingelser, (M2), henholdsvis. To tilgange taget at vurdere robustheden af denne analyse for høj overførselshastighed analyse. Først, Z-faktor, eller screening vindue koefficient, bestemmer, om et givet sæt betingelser giver en stor nok dynamikområde, mens regnskab for signal variabilitet. Z-faktorer inden for intervallerne 0 < Z ≤ 0,5 og 0,5 < Z ≤ 1 svarer til en acceptabel og meget god analyse, henholdsvis42,43. En begrænsning ved at bruge Z-faktor for vurdering er, at testet betingelser typisk udviser mere moderat værdier i forhold til de ekstreme positive og negative kontroller. Derfor, som en anden tilgang, beregnet vi den strengt standardiseret gennemsnitlige forskel (SSMD, β), som kan identificere forskelle mellem forsøgsbetingelser, der ellers ville blive kategoriseret som et negativt resultat, baseret på en kvalificeret Z-faktor44 ,45. SSMD værdier kan kategoriseres i virkning styrke lige fra ingen effekt (β = 0) til ekstremt stærk (β ≥ 5). Ved hjælp af data fra figur 7A og AUC for sammenligning af M1 versus M2 betingelser, eksponering for 0,25 og 0,5 nM LLO produceret Z-faktor værdier af 0.3100813 og 0.137313 og β = 6.0672 og 4.803308, henholdsvis, hvilket viser, at et vindue af LLO koncentrationer egnet for analysen. Da koncentrationen af LLO er øget ud over 1 nM, hullet i den ICNABD kinetic kurver mellem M1 og M2 betingelser lukker, resulterer i drastisk reduceret Z-faktor og SSMD værdier (figur 7B). Sådanne høje koncentrationer af LLO svarer til forhold, hvor reparation potentiale opvejes af skader og dermed negerer brugen af analysen i at identificere faktorer involveret i membranen reparation. Dette illustreres videre af faldet i reparation effektivitet (E) som LLO koncentration stigninger (figur 7B). Alle data (Z-faktor, SSMD og E) blev genereret med 3 biologiske replikater og 3 tekniske replikater pr. eksperimentelle betingelse for assay validering. Sammen, disse data viser, at denne analyse har den forventede robusthed til en høj overførselshastighed assay med LLO koncentrationer lavere end 1 nM for HeLa celler.

Bevis af princippet: når robustheden af analysen blev etableret, vi udførte yderligere eksperimenter som et bevis på princippet om at denne analyse har den følsomhed og opløsning til at identificere en defekt i reparationsprocessen. Vi fandt også, at høj overførselshastighed assays er brugt som en screeningsproces for at identificere "hits" inden for store skærme, der kan indebære mindre end 3 biologiske replikater. Det er således relevant at det eksperimentelle design giver påvisning beføjelse til at identificere "hits" inden for en enkelt assay. Derfor, under en høj overførselshastighed skærm, assay layout kan justeres til at rumme 4 tekniske flergangsbestemmelser for at øge statistiske magt i et enkelt eksperiment. Celler var belagt i fire eksemplarer og blev forbehandlet 1 h før analysen med desipramin, en farmakologisk hæmmer af lysosomale protein syre sphingomyelinase (ASM) som spiller en rolle i plasma membran reparation15,17 ,46. Vigtigere, påvirkede behandling med desipramin ikke celletal i hele analysen, giver mulighed for passende sammenligning mellem desipramin-behandlede og ubehandlede celler (figur 8A). Hæmning af ASM i desipramin-behandlede celler resulterede i en defekt i membranen genforsegling effektivitet ved udsættelse for LLO, som illustreret af faldet i E og REff (fig. 8B og 8 C). Ved hjælp af en blandet effekter model, behandlet en sammenligning af desipramin-til ubehandlede celler udsat for 0,25 og 0,5 nM LLO i M1 viste p-værdier for 0.0010 og 1 x 10-10, henholdsvis. Sammen, viser data, at 0,25 og 0,5 nM LLO er passende koncentrationer til at identificere fejl i reparation i en høj overførselshastighed eksperimentelle indstilling, med mulige statistiske analyser af en enkelt eksperiment når de tekniske replikater er øget til fire . Bemærk, at den statistiske tilgang af modellens blandet virkninger mellem fire eksemplarer ikke vil højde for potentielle variationer på tværs af flere biologiske replikater. Alle væsentlige resultater ved hjælp af en biologisk replikat bør kontrolleres i yderligere eksperimentelle indstillinger.

Figure 1
Figur 1: eksperimenterende design. Flow diagrammet skildrer en repræsentativ plade design er konfigureret til at teste effekten af syv prøvningsbetingelserne i forhold til kontrol ubehandlede celler. Yderligere kontrol skal medtages, hvis det er relevant, som for eksempel stof køretøjer. Celler er forgyldt (plade 1) 24 timer forud for forsøget. På dagen for eksperimentet, celler i plade 1 er vasket med M1 eller M2 medium pre varmes ved 37 ° C, og pladen er afbildet (TL, normal god landbrugspraksis og PI fluorescens) pre kinetic. Under 15 min billedbehandling, reagenser er tilføjet på is at plade 2. Efter imaging, plade 1 anbringes straks i isbad i 5 min, og 100 μL/brønd overføres fra plade 2 til plade 1. Plade 1 er placeret i Pladelæser til at køre den kinetiske assay ved 37 ° C i 30 min, efterfulgt af imaging (TL, normal god landbrugspraksis og PI fluorescens). Data er derefter analyseret for at tælle celler og vurdere reparation effektivitet i alle forsøgsbetingelser. I store datasæt, kan være automatiseret analyse. Også, kan antallet af teknisk replikater forhøjes til 4 i høj overførselshastighed skærme. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: celle tælle nøjagtighed. HeLa celler udtryk for normal god landbrugspraksis-tagged Histon 2B var seedede i tre ved de angivne koncentrationer. (A) celler blev afbildet ved 37 ° C under gennemlysning (TL) og normal god landbrugspraksis fluorescens (12 billeder/brønd) og en celle opdagelse algoritme blev brugt til at afgrænse individuelle kerner (i lilla). Skalalinjen = 1 mm. (B) højere forstørrelse af TL, normal god landbrugspraksis og celle påvisning (lilla) billeder (zoomede 2 X). Skalalinjen = 100 μm. (C) Image analyse software blev brugt til at tælle antallet af celler og celle tæller blev plottes i første celle seeding koncentration. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Propidium Iodid fluorescens målingen er ikke berørt af Histon 2B-normal god landbrugspraksis udtryk. Histon 2B-normal god landbrugspraksis udtrykker og ikke udtryk for HeLa celler blev udsat, eller ej, til 1 nM LLO i (ubrudte linjer) eller ej (stiplet linje) 30 μm PI i Ca2 +-indeholdende medium (M1). Kinetic analysen målt PI fluorescens intensiteter af spectrofluorometry hvert 5 min i 30 minutter ved 37 ° C. Data er den gennemsnitlige PI fluorescens intensitet (IPI) udtrykt i relative fluorescens enheder (RFU) ± SEM (n = 3 uafhængige eksperimenter, hver udført i tre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: celle optælling er upåvirket af PI fluorescens. (A) repræsentative pre og post kinetisk billeder (TL, PI og normal god landbrugspraksis) af celler udsat, eller ikke, at 1 nM LLO i M1. Skalalinjen = 100 μm. B kvantitative Fluorescens mikroskopi analyse (jegnormal god landbrugspraksis± SEM) viste øget normal god landbrugspraksis fluorescens målingen på grund af PI nukleare indlemmelse på celle såret af LLO (post kinetic). (C) NGL-baserede celle optællingen var upåvirket af stigningen i normal god landbrugspraksis intensitet. Celletal pr. brønd blev udtrykt i gennemsnit ± SEM. (i B og C: sorte barer = pre kinetiske data; rød barer = post kinetiske data; n = 3 uafhængige eksperimenter, hver udført i tre; tosidede Student's t-test blev anvendt til at analysere kvantitative fluorescens intensitet og celle tæller fra erhvervede billeder, ** p < 0,01). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: måling af plasma membran genforsegling effektivitet. Histon 2B-normal god landbrugspraksis udtrykker HeLa celler blev udsat, eller ej, til 1 nM LLO i Ca2 +-indeholdende (M1) eller Ca2 +-gratis (M2) medium indeholdende 30 μM PI. Kinetiske data repræsenterer PI fluorescens intensitet (IPI) i relative fluorescens enheder (RFU) ± SEM, målt i 30 minutter ved 37 ° C. n = 3 uafhængige eksperimenter, hver udført i tre. Resealing effektivitet blev målt som anført i protokollen trin 1.5.4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Carbocyanine nukleinsyre bindende farvestof som en alternativ farvestof at vurdere membran genforsegling. HeLa H2B-NGL celler blev udsat, eller ej, til 0,5 nM LLO i 30 minutter ved 37 ° C i 1 μM CNABD i Ca2 +-indeholdende (M1) eller Ca2 +-gratis (M2) medium. (A) billeder af HeLa H2B-NGL celler er anskaffet før og efter kinetic i M1 indeholdende farvestoffet. Skalalinjen = 100 μm. (B og C) integreret CNABD og normal god landbrugspraksis fluorescens støtteintensiteter blev målt ved hjælp af billedbehandling forskellige og udtrykt i relative fluorescens enheder (RFU) ± SEM. (D) NGL fluorescens billeder blev behandlet for at optælle HeLa H2B-normal god landbrugspraksis celler (sort barer = pre kinetiske data, røde barer = post kinetiske data, n = 3 uafhængige eksperimenter, hver udført i tre). Tosidede Student's t-test blev anvendt til at analysere kvantitative fluorescens intensitet og celle tæller fra erhvervede billeder, ** p < 0,01, *** p < 0,001) venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: effekten af LLO koncentration på genforsegling effektivitet, Z-faktor og SSMD. (A) HeLa H2B-NGL celler inkuberes i M1 eller M2 indeholdende 1 μM CNABD blev udsat for stigende koncentrationer af LLO og underkastes den kinetiske assay i 30 minutter ved 37 ° C. Dataene udtrykt som CNABD intensitet (ICNABD) i relative fluorescens enheder (RFU) ± SEM. (B) Z-faktor og strengt standardiseret gennemsnitlige forskel (SSMD) blev beregnet som en kvalitetsvurdering til robustheden af membran reparation assay, ved hjælp af arealet under kurven (AUC) som en metrikværdi for kinetic kurver42,43,44,45. De resealing effektivitet blev beregnet som beskrevet i afsnittene protokol og resultater (n = 3 uafhængige eksperimenter, hver udført i tre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: celle eksponering for desipramin forårsager defekter i genforsegling. HeLa H2B-NGL celler (forgyldt i fire eksemplarer) blev forbehandlet med 30 μM desipramin (eller ej) i 1 time ved 37 ° C og derefter udsat for 0,25 eller 0,5 nM LLO i nærværelse af 1 μM CNABD i Ca2 +-indeholdende (M1) eller Ca2 +-gratis (M2) medium. Celler var afbildet (præ- og post kinetic) og underkastes kinetic analysen ved 37 ° C i 30 min. (A) celler blev optalt; data er udtrykt som gennemsnitlig celle tæller ± SEM. (B) CNABD fluorescens intensitet (ICNABD) er udtrykt i relative fluorescens enheder (RFU) ± SEM. (C) Resealing effektivitet blev beregnet i tilstedeværelse og fravær af desipramin. En blandet effekter model blev brugt på log-transformeret intensitetsværdierne antager en random intercept for hver teknisk replikeres. For at fange både et skift og ændre i form af kinetic kurver, testet hovedeffekten af behandling tilstand og effekten interaktion mellem behandling tilstand og tid i fællesskab for Statistisk signifikans. Tosidede Student's t-test blev anvendt til at analysere celletal fra erhvervede billeder. P-værdi blev beregnet ved hjælp af blandede effekter model. (4 tekniske replikater, et eksperiment). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Imaging forskellige Emission kanal specifikationer
Fluorophore Fluorophore ex / em (nm) Grøn kanal (ex / em ± bandpass, nm) Røde kanal (ex / em ± bandpass, nm)
NORMAL GOD LANDBRUGSPRAKSIS 488/510 460/541 ± 20/108 625/713 ± 20/123
PI 533/617
CNABD 642/661

Tabel 1: Normal god landbrugspraksis, PI og CNABD excitations- og toppe og grøn og rød kanal excitations- og bandpasses for de billeddiagnostiske forskellige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne analyse måler effektiviteten af membran genforsegling på cellen befolkningsniveau med høj overførselshastighed kapacitet. Det kan bruges til at screene for cellulære komponenter eller narkotika biblioteker, der kan påvirke membran reparation. Beskrevet analysen anvendes en 96-brønd plade format, men det kan tilpasses til 384-godt plader for højere overførselshastighed. En fordel ved denne analyse er dens evne til at opnå fluorescens målinger af vedhængende levende celler i realtid uden brug af overdreven celle behandling såsom celle detachement, fiksation eller fluorescens mærkning efter fiksering. Multimode plade læsere, som den, der anvendes i denne protokol, har tilstrækkelig følsomhed for hurtig spectrofluorometric målinger med tidsintervaller så lavt som 30 s til en 96-brønd plade. Erhvervelse af fluorescens billeder indeholder yderligere oplysninger, herunder celle optælling, eventuelle ændringer i celle morfologi og potentielle identifikation af forskellige cellepopulationer. Den nuværende assay fastsætter ikke kinetik plasmamembran lukning på enkelt celle-niveau, men identificerer forsøgsbetingelser (farmakologiske forbindelser eller cellulære komponenter), positivt eller negativt, kan påvirke processen med membran genforsegling på cellen befolkningsniveau.

Flere andre eksperimentelle metoder er blevet udviklet for at vurdere membranen genforsegling mekanismer. For eksempel, mekanisk afbrydelse af microneedle punktering, perle slid og laser ablation har været brugt til at modellere mekanisk membran skader. Måling af såret/reparation har involveret Fluorescens mikroskopi eller flow flowcytometri af kvantificere posten i fluorescerende sonder (FM 1-43, propidium Iodid, fluorescein-konjugeret dextrans) eller sporing fluorescerende proteiner kimærer47 ,48,49,50. Hver af disse tilgange har sine egne fordele; men de er ikke indstillet til høj overførselshastighed screening i levende celler som præsenteres i dette assay.

Den foreliggende analyse var optimeret til at analysere celler såret af poreformede proteiner LLO, hvilke former store porer, der tillader Ca2 + massetilstrømning som provokeret af mekaniske brud af plasma membran resealing effektivitet. Selvom poreformede toksiner repræsenterer en form for plasma membran skader, reparation af store toksin porer og mekaniske sår blev foreslået at dele fælles Ca2 +-afhængige veje17,51. Det er vigtigt at bemærke at LLO interaktion med celle membranen komponenter, såsom kolesterol kan påvirke celle signalering og dermed kan påvirke membran genforsegling mekanismer i forhold til mekaniske sår. Vores viden om membran reparation er stadig begrænset og yderligere undersøgelser er nødvendige for at fastslå om lukning af mekaniske sår afviger fra lukning efter dannelsen af toksin porer. Der er flere fordele ved hjælp af LLO. Første kan indledning af membran skader synkroniseres ved at hæve temperaturen fra 4 til 37 ° C. Andet, opløselig form af LLO (ikke bundet til cellemembranen) uigenkaldeligt aggregater på neutral pH og 37 ° C, således begrænse cytotoksiske virkninger og om ophævelse af behovet for at vaske cellerne. Endelig, graden af skader kan justeres ved at variere koncentrationen af toksinet. En begrænsning af denne analyse er imidlertid temperaturknappen mellem 37 og 4 ° C, som kan påvirke reparation mekanismen som vesikulære transport, endocytose og membran fluiditet, blandt andre processer, som er påvirket af temperaturen52, 53,54. Det er vigtigt at kontrollere, at enhver farmakologiske hæmmer inkluderet i analysen ikke blande sig med dannelsen af LLO porer ved at udføre en hæmolyse assay tilstedeværelse (versus fravær) af stof55. Potentielle batch forskelle i LLO aktivitet er det vigtigt at forberede et lager af LLO, der er stor nok til en hel høj overførselshastighed skærmen55.

Vi indgår brug af celler, der udtrykker den nukleare lokaliseret Histon-2B-NGL kimære som et middel til at optælle celler før og efter membran reparation assay via mikroskopisk billeddannelse efterfulgt af automatiseret billedanalyse. Vigtigere, tilsvarende celle tæller på tværs af betingelser og uforanderlige celle tæller før og efter den kinetiske assay er afgørende som PI eller CNABD fluorescens intensiteter kan nemt blive normaliseret. Faktisk, en forskel i celletal vil medføre forskelle i graden af skader af en given koncentration af LLO, som ikke kan korrigeres via fluorescens normalisering på grund af variationer i genforsegling effektivitet (figur 7). Vi viste, at Histon-2B-NGL udtryk ikke forstyrrer PI eller CNABD stiftelsesoverenskomst eller fluorescens emission. Omvendt, PI eller CNABD vedtægter ikke påvirker normal god landbrugspraksis-baserede celle optælling. Hvis andre kombinationer af fluorophores der skal anvendes, vil det være nødvendigt at vurdere potentielle spektrale overlapning mellem fluorokromer, som blev udført i dette arbejde. Selv om PI har været flittigt brugt til at måle membran skader, viser vi, at CNABD er en fremragende erstatning, der udstiller højere fluorescens kvanteudbytte, hvilket resulterer i en større dynamikområde egnet til kendetegner genforsegling effektivitet.

Z-faktor og SSMD bekræftet, at denne analyse har den nødvendige til at udføre høj overførselshastighed analyser robusthed. Beregningen af resealing effektivitet er en kritisk og pålidelige redskab til at identificere potentielle hits. Derudover kan blandet effekter model bruges som et statistisk værktøj til at evaluere hits inden for en enkelt assay. Den eksperimentelle plan skal indeholde et minimum af tre tekniske replikater, hvis skærmen kan gentages flere gange. Quadruplicates bør anvendes, hvis statistiske værktøjer, såsom den blandede effekter model, der skal medtages i et enkelt eksperiment, hvorvidt det vil blive gentaget. Det tilrådes dog at udføre skærmen flere gange og at validere resultaterne ved at udføre supplerende forsøg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi anerkender Dr. Jesse Kwiek (The Ohio State University) for venligst at lade os bruge hans multi-mode påvisning platform for nogle foreløbige eksperimenter. Forskning rapporteret i denne artikel blev støttet af det nationale Institut for allergi og smitsomme sygdomme af National Institutes of Health under award nummer RO1AI107250 til Stephanie Seveau. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer Molecular Devices 5024062
TO-PRO-3 ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific P3566
HeLa ATCC CCL2
HeLa H2B-GFP Millipore SCC117
Trypsin-EDTA 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate Corning 3603
Hanks' balanced Salts Sigma-Aldrich H4891
EGTA ISC BioExpress 0732-100G
HEPES Fisher Scientific BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax Sigma-Aldrich G5146-1KG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Current Topics in Membranes. 77, 67-96 (2016).
  2. Howard, A. C., McNeil, A. K., McNeil, P. L. Promotion of plasma membrane repair by vitamin E. Nature Communications. 2, 597 (2011).
  3. Howard, A. C., et al. A novel cellular defect in diabetes: membrane repair failure. Diabetes. 60 (11), 3034-3043 (2011).
  4. Lozano, M. L., et al. Towards the targeted management of Chediak-Higashi syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 132 (2014).
  5. Vainzof, M., et al. Dysferlin protein analysis in limb-girdle muscular dystrophies. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (1), 71-80 (2001).
  6. Huynh, C., et al. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (48), 16795-16800 (2004).
  7. Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiological Reviews. 95 (4), 1205-1240 (2015).
  8. Steinhardt, R. A., Bi, G., Alderton, J. M. J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263 (5145), 390-393 (1994).
  9. De Mello, W. C. Membrane sealing in frog skeletal-muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (4), 982-984 (1973).
  10. Fishman, H. M., Tewari, K. P., Stein, P. G. Injury-induced vesiculation and membrane redistribution in squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (3), 421-435 (1990).
  11. Davenport, N. R., Bement, W. M. Cell repair: Revisiting the patch hypothesis. Communicative & Integrative Biology. 9 (6), 1253643 (2016).
  12. McNeil, P. L., et al. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. Journal of Cell Science. 113 (11), 1891-1902 (2000).
  13. Terasaki, M., Miyake, K., McNeil, P. L. Large plasma membrane disruptions are rapidly resealed by Ca2+-dependent vesicle-vesicle fusion events. Journal of Cell Biology. 139 (1), 63-74 (1997).
  14. Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Journal of Cell Biology. 131 (6 Pt. 2), 1747-1758 (1995).
  15. Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. Journal of Cell Biology. 189 (6), 1027-1038 (2010).
  16. Rodriguez, A., et al. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. Journal of Cell Biology. 137 (1), 93-104 (1997).
  17. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
  18. Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136 (2014).
  19. Pathak-Sharma, S., et al. High-Throughput Microplate-Based Assay to Monitor Plasma Membrane Wounding and Repair. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 305 (2017).
  20. Hamon, M. A., et al. Listeriolysin O: the Swiss army knife of Listeria. Trends in Microbiology. 20 (8), 360-368 (2012).
  21. Seveau, S. Multifaceted activity of listeriolysin O, the cholesterol-dependent cytolysin of Listeria monocytogenes. Subcellular Biochemistry. 80, 161-195 (2014).
  22. Osborne, S. E., Brumell, J. H. Listeriolysin O: from bazooka to Swiss army knife. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 372 (1726), (2017).
  23. Lukoyanova, N., Hoogenboom, B. W., Saibil, H. R. The membrane attack complex, perforin and cholesterol-dependent cytolysin superfamily of pore-forming proteins. Journal of Cell Science. 129 (11), 2125-2133 (2016).
  24. Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infection and Immunity. 73 (10), 6199-6209 (2005).
  25. Koster, S., et al. Crystal structure of listeriolysin O reveals molecular details of oligomerization and pore formation. Nature Communications. 5, 3690 (2014).
  26. Duncan, J. L., Schlegel, R. Effect of streptolysin O on erythrocyte membranes, liposomes, and lipid dispersions. A protein-cholesterol interaction. Journal of Cell Biology. 67 (1), 160-174 (1975).
  27. Morgan, P. J., et al. Subunit organisation and symmetry of pore-forming, oligomeric pneumolysin. FEBS Letters. 371 (1), 77-80 (1995).
  28. Leung, C., et al. Stepwise visualization of membrane pore formation by suilysin, a bacterial cholesterol-dependent cytolysin. eLife. 3, (2014).
  29. Marchioretto, M., et al. What planar lipid membranes tell us about the pore-forming activity of cholesterol-dependent cytolysins. Biophysical Chemistry. 182, 64-70 (2013).
  30. Palmer, M., et al. Assembly mechanism of the oligomeric streptolysin O pore: the early membrane lesion is lined by a free edge of the lipid membrane and is extended gradually during oligomerization. European Molecular Biology Organization Journal. 17 (6), 1598-1605 (1998).
  31. Bavdek, A., et al. pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. Federation of European Biochemical Society Journal. 279 (1), 126-141 (2012).
  32. Schuerch, D. W., Wilson-Kubalek, E. M., Tweten, R. K. Molecular basis of listeriolysin O pH dependence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12537-12542 (2005).
  33. Cassidy, S. K., O'Riordan, M. X. More than a pore: the cellular response to cholesterol-dependent cytolysins. Toxins (Basel). 5 (4), 618-636 (2013).
  34. Lam, J., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes L. monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. , (2017).
  35. Gekara, N. O., Weiss, S. Lipid rafts clustering and signalling by listeriolysin O. Biochemical Society Transactions. 32 (Pt 5), 712-714 (2004).
  36. Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. European Molecular Biology Organization Reports. 11 (5), 400-405 (2010).
  37. Baba, H., et al. Induction of gamma interferon and nitric oxide by truncated pneumolysin that lacks pore-forming activity. Infection and Immunity. 70 (1), 107-113 (2002).
  38. Carrero, J. A., Vivanco-Cid, H., Unanue, E. R. Listeriolysin o is strongly immunogenic independently of its cytotoxic activity. Public Library of Science One. 7 (3), e32310 (2012).
  39. Coconnier, M. H., et al. Listeriolysin O-induced stimulation of mucin exocytosis in polarized intestinal mucin-secreting cells: evidence for toxin recognition of membrane-associated lipids and subsequent toxin internalization through caveolae. Cell Microbiology. 2 (6), 487-504 (2000).
  40. Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 45 (1), 49-53 (1997).
  41. Bink, K., et al. TO-PRO-3 is an optimal fluorescent dye for nuclear counterstaining in dual-colour FISH on paraffin sections. Histochemistry and Cell Biology. 115 (4), 293-299 (2001).
  42. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  43. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nature Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  44. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  45. Zhang, X. D. A new method with flexible and balanced control of false negatives and false positives for hit selection in RNA interference high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 12 (5), 645-655 (2007).
  46. Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
  47. Davenport, N. R., et al. Membrane dynamics during cellular wound repair. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2272-2285 (2016).
  48. Defour, A., Sreetama, S. C., Jaiswal, J. K. Imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair. Journal of Visualized Experiments. (85), (2014).
  49. Lee, J. J. A., et al. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  50. Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. Journal of Visualized Experiments. (52), (2011).
  51. Corrotte, M., et al. Toxin pores endocytosed during plasma membrane repair traffic into the lumen of MVBs for degradation. Traffic. 13 (3), 483-494 (2012).
  52. Kuismanen, E., Saraste, J. Low temperature-induced transport blocks as tools to manipulate membrane traffic. Methods in Cell Biology. 32, 257-274 (1989).
  53. Togo, T., et al. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. Journal of Cell Science. 112, 719-731 (1999).
  54. Johnson, S. A., et al. Temperature-dependent phase behavior and protein partitioning in giant plasma membrane vesicles. Biochimica et Biophysica Acta. 1798 (7), 1427-1435 (2010).
  55. Lam, J. G. T., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes Listeria monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 270-284 (2018).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 143 Plasma membran lukning membran reparation muskelsvind propidium Iodid carbocyanine nukleinsyre bindende farvestof poreformede toksin listeriolysin O
Høj overførselshastighed måling af Plasma membran genforsegling effektivitet i pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S.… More

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S. High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (143), e58351, doi:10.3791/58351 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter