Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحديد الكفاءة الإنجابية التي تؤكد بداية البلوغ، والقيام تحليل خصوبة في الفئران والجرذان

Published: October 13, 2018 doi: 10.3791/58352
Automatic Translation
1
1Department of Animal Science, Michigan State University

Summary

العديد من العلاجات والطفرات الجينية تؤثر على توقيت النضج الجنسي والخصوبة. ويصف هذا البروتوكول طريقة غير الغازية لتقييم بداية البلوغ في الفئران والجرذان قبل إعداد دراسة خصوبة في الحيوانات الناضجة جنسياً.

Abstract

تقييم الكفاءة الإنجابية أمر بالغ الأهمية لفهم تأثير المعاملة أو التلاعب بالجينات على محور الإنجابية، كما وصف المحور طائي جوندال الغدة النخامية. المحور الإنجابية هو integrator رئيسية المدخلات البيئية والداخلية تكييف الخصوبة إلى الظروف المواتية للاستنساخ. قبل الشروع في دراسة خصوبة في الفئران والجرذان، يتم تقييم النضج الجنسي لاستبعاد إمكانية أن تعمل الإنجابية ملاحظتها هي سبب تأخر أو تغيب بداية البلوغ. ويصف هذا البروتوكول نهجاً غير الغازية لتقييم بداية البلوغ في الذكور من خلال تحديد فصل بريبوتيال، وفي الإناث عن طريق فتح المهبل والسفاد الأول. بعد التأكد من إتمام البلوغ وبلوغ مرحلة النضج الجنسي، يمكن الشروع في دراسة خصوبة. يصف الإجراء شروط التربية المثلى للفئران والجرذان وكيفية إعداد دراسة خصوبة، وما المعايير لتقييم وتحديد ما إذا كان العلاج أو حذف الجينات تؤثر على الخصوبة.

Introduction

المرحلة الانتقالية من خلال سن البلوغ مطلوب لبلوغ مرحلة النضج الجنسي والكفاءة التناسلية. الانتقال البلوغ والحفاظ على معدل الخصوبة في سن البلوغ ينظم المحور الإنجابية، كما وصف المحور طائي جوندال الغدة النخامية (الشكل 1). وينظم توقيت بداية البلوغ والحفاظ على خصوبة محكم العوامل الداخلية، فضلا عن البيئة زيادة فرص البقاء على قيد الحياة للأبناء والآباء والأمهات1،2. يوفر هذا البروتوكول نهجاً غير الغازية لتحديد بداية البلوغ في الفئران والجرذان للتأكد من النضج الجنسي قبل إعداد دراسة خصوبة لتقييم الكفاءة التناسلية.

دراسة خصوبة في الحيوانات الناضجة جنسياً ويمكن أن تبدأ بعد أن مرت الحيوانات إلى سن البلوغ. قبل بداية البلوغ، محور الإنجابية هادئة، والدافع الرئيسي للنضج الجنسي، تروج – الإفراج عن هرمون (GnRH)، يطلق على الغدة النخامية بكميات غير كافية الشروع في سن البلوغ (الشكل 1). بداية البلوغ هو عملية معقدة والتي ينتج عنها زيادة جنره الإفراج في نيافة الوسيط. جنره يشجع الهرمون (LH) والمسام تحفيز إفراز هرمون (FSH) من الغدة النخامية، هما هرمونات ضرورية نضج جوندال ووظيفتها الإنجابية (الشكل 1)3،،من45 .

الإهانات إلى المحور الإنجابية يؤدي إلى انخفاض الخصوبة ويمكن أيضا التقدم أو التأخر في بداية البلوغ. وتشمل الشروط المعروفة للتأثير في توقيت بداية البلوغ والكفاءة الإنجابية التعرض للمواد الكيميائية6،7،1،وزن الجسم ارتفع أو انخفض8تغييرات في الصماء 2،طول اليوم9 والطفرات الوراثية10،11،،من1213،،من1415.

بداية مرحلة النضج الجنسي هو خطوة حاسمة يتعين استكماله قبل إعداد مقايسة خصوبة. مزايا تحديد بداية البلوغ من خلال فصل بريبوتيال وفتح المهبل والسفاد الأول، هي الخصائص غير الغازية لهذه الإجراءات، كما أنها لا تتطلب جمع الدم أو التضحية بالحيوان16، 17.

بعد أن يتم تحديد بداية البلوغ، بشكل صحيح إعداد دراسة خصوبة سوف توفر معلومات هامة حول السلامة المحور الإنجابية، وعادة ما يكون له ميزة ثانية لتوليد الحيوانات التجريبية لإجراء مزيد من الدراسات (التنقيح) 18-إعداد دراسة الخصوبة الموصوفة في هذا البروتوكول يمكن الكشف عن العجز في الصغيرة والكبيرة على حد سواء في الكفاءة التناسلية في الذكور والإناث. مفتاح معلمات تقييم تشمل 1) الوقت للقمامة الأولى، 2) عدد ليتر ولدت في حجم 3) القمامة وإطار زمني معين. وأخيراً، ترد توصيات لنوع متابعة الدراسات التي يمكن إجراؤها لتحديد سبب ضعف الخصوبة.

وصف البروتوكول يشير إلى الفئران وبيانات تمثيلية تعكس العمل المنجز في الفئران المعدلة وراثيا. ومع ذلك، كافة البروتوكولات شملت تصلح أيضا في الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الموافقة على "رعاية الحيوان المؤسسية" و "اللجنة استخدام من جامعة ولاية ميشيغان" كافة الأساليب الموصوفة هنا وتجري وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. تحديد بداية البلوغ

  1. اتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية للملابس، كحد أدنى، ومن الضروري ارتداء معطف مختبر نظيفة وقفازات نظيفة. دائماً التعامل مع الفئران ارتداء قفازات نظيفة.
  2. إعداد مساحة العمل عن طريق وضع وسادة على الطاولة.
    1. مكان أعلى قفص ماوس نظيفة مع الشبكة التي تواجه صعودا على لوحة المفاتيح.
    2. قم بإعداد مقياس في مساحة العمل. ضع كوب نظيف 500 – 1000 مل على الحجم والكتلة الفارغة.
    3. ضع ورقة بجوار منطقة العمل لوزن الجسم سجل وفصل بريبوتيال، وافتتاح المهبل أو السفاد الأول.
  3. تحديد الفئران للدراسة. إجراء عمليات تفتيش يومية لبداية البلوغ حتى يتم الوصول إلى سن البلوغ. إجراء التفتيش وفي الوقت نفسه اليوم طوال فترة الدراسة. بداية البلوغ يمكن أن يحدث في أقرب وقت بعد الولادة يوم 11-12-19، ولكن في الأجهزة الأكثر تجريبية، رصد بداية البلوغ يبدأ ~ 22 يوما.
  4. ضع القفص الماوس في مساحة العمل (الخطوة 1، 2). فتح القفص ووضع غطاء وزجاجة مياه وحامل الطعام على المائدة.
  5. تحديد فصل بريبوتيال في الفئران الذكور.
    1. أثناء الضغط الماوس من ذيله، وضعه في أعلى القفص الماوس نظيفة من الخطوة 1.2.1. بينما التمسك بلطف الذيل، اسمحوا الماوس استكشاف شبكة أعلى القفص ~ 5 s.
    2. اجذب الذيل إلى الخلف؛ عادة ما يؤدي هذا الحيوان تتحرك إلى الأمام بينما التمسك بالشبكة مع اليدين. أغلق نهج اليد الأخرى على الجلد بالرقبة والاذنين.
    3. فهم الجلد فضفاض بين الكتفين والرقبة مع الإبهام والسبابة. من المهم الحصول على عقد جيد للجلد، كما أنه سيمنع الماوس من تحول رئيسها لدغة.
    4. الاستيلاء على الجلد على ظهره بالاصابع المتبقية وأنه عقد بالضغط على يده. عقد إيمانا راسخا دون إعاقة التنفس والدم التدفق، أو ضررا العظام، العضلات أو الجلد. تشغيل اليد على كشف بطن الماوس، مع دعم الجزء الخلفي الماوس داخل كف اليد.
    5. مع اليد الحرة، بلطف دفع عودة الجلد حول القضيب دون إجبار. في فصل بريبوتيال، شرائح الجلد preputial الخلف فضح حشفة القضيب (الشكل 2A، السهم عرض الفاصل بريبوتيال). سجل وجود أو عدم وجود فصل بريبوتيال.
    6. وزن الماوس برفق وضعه في الكأس 500-1000 مل من الخطوة 1.2.2 وتسجيل الوزن.
    7. إعادة إدخال الماوس في القفص الإسكان بعقد سم الكأس 0-2 على الكلمة القفص وتلميح ببطء فوق الكأس السماح للماوس للخروج من تلقاء نفسها. تنظيف اخلطها بالماء والمنظفات المعتدلة والجافة قبل العودة إلى الجدول وترينج المقياس.
  6. تحديد فتح المهبل في الفئران الإناث.
    1. مكان كرة القطن، كوب وزجاجة من المياه المعقمة في مكان العمل (الخطوة 1، 2). صب الماء في الكأس. يرطب الكرة القطن بالماء المعقم ووضعه بجوار أعلى القفص من الخطوة 1.2.1.
    2. ضع القفص الماوس في مساحة العمل (الخطوة 1، 2)، ونقل الماوس من قفصة الرئيسية إلى أعلى القفص (الخطوة 1.2.1) خلال عقد في قاعدة الذيل. بلطف سحب الذيل لتشجيع حركة الماوس إلى الأمام.
    3. رفع الذيل مع دعم الوركين مع الأصابع الحرة. السماح هيندليمبس للحفاظ على الاتصال مع الجزء العلوي من القفص. إذا كان الماوس يتحرك كثيرا، أنه عقد في اليد كما هو موضح في الخطوات 1.5.1-1.5.4.
    4. تنظيف الفرج مع الكرة القطن هوميديفيد المياه من الخطوة 1.6.1 برفق. استخدام كرة القطن هوميديفيد نظيفة لكل الماوس. لتحديد فتح المهبل وفحص الفرج وتحديد ما إذا كان المهبل مفتوحة تماما (الشكل 2A، افتتاح المهبلي الإناث).
    5. السجل إذا حدث افتتاح المهبل. وزن الماوس وإعادته إلى القفص الصفحة الرئيسية كما هو موضح في الخطوات 1.5.6-1.5.7.
  7. السفاد أول مؤشر للاباضة الأولى.
    1. ضع كوب مع الماء المعقم وشريحة زجاجية مسمى ماصة 200 ميليلتر مع تلميح نظيفة في مجال العمل (الخطوة 1، 2).
    2. عقد الأنثى كما هو موضح في الخطوة 1.6.2-1.6.3. ضع طرف ماصة تحتوي على ~ 50 ميليلتر من الماء المعقم في افتتاح المهبل.
    3. بلطف تدفق الخلايا من جدار المهبل من خلال إدخال واستيعاب ~ 50 ميليلتر من الماء 2-4 مرات. تشويه المحتوى من طرف الماصة إلى شريحة الميكروسكوب زجاجية مسماة.
    4. مراقبة بعناية مورفولوجيا الخلوية في مجهر برايتفيلد استخدام 10 X أو 20 X الهدف أو السماح أيردري تشويه ح ~ 1 وثم كونتيرستين بمحلول أزرق الميثيلين 0.1% (حله في ddH2س) (الشكل 2). إلى كونتيرستين، وتراجع الشريحة المجففة إلى الحل الميثيلين الأزرق 0.1% ل ~ 30 ثانية. واسمحوا الهواء الشرائح الجافة ح 1.
    5. مراقبة الشرائح من الخطوة 1.7.4 في مجهر حقل مشرقة في 10 X أو 20 س. إنشاء مرحلة دورة الشبقية (الشكل 2)20 عن طريق مراقبة مورفولوجيا الخلايا التي تسمح بالتمييز بين أربع مراحل متميزة لدورة الشبقية (الشكل 2).
      ملاحظة: تتميز ميتيستروس بخليط من الخلايا الظهارية الحرشفية كورنيفيد والكريات البيضاء، ديستروس بالكريات البيضاء، بروستروس بخليط من الكريات البيضاء والخلايا الظهارية الأنوية السفاد بالخلايا الظهارية كورنيفيد (الشكل 2) 20.
    6. تسجيل وزن الجسم والعودة الماوس إلى قفصة الصفحة الرئيسية كما هو موضح في الخطوات 1.5.6-1.5.7. يتم إنهاء مسحات المهبل في اليوم عندما تم الماوس به السفاد الأول (الشكل 2).

2-مرغوب فيه تربية شروط الغرفة

  1. التأكد من أن الغرفة تربية درجة حرارة ~ 20-24 درجة مئوية، مع 55 ± 10% رطوبة، ومتجانسة الغرف الضوء كثافة ~ 300-400 لوكس حوالي 1 متر فوق الطابق21. يسمح هذا كثافة الضوء شدة الضوء قفص منتصف المرغوب فيه من لوكس 25-80. لاختبار كثافة الضوء، استخدام ضوء متر.
  2. استخدام نظام الآلي للتحكم في الإضاءة في الغرفة تربية لضمان التوقيت المناسب للإضاءة في جميع أنحاء هذه التجربة. طول النهار الظروف المثلى لتقييم معدل الخصوبة في مجموعة القوارض من يوم ح 12 (12 ح النور والظلام ح 12، LD12:12)، لشروط "الصيف--مثل" مع ح 14 في الظلام (LD14:10) خفيفة و 10 ح21.
  3. إعداد أقفاص تربية.
    1. إعداد قفص ماوس نظيفة مع غطاء، والماء، والغذاء والفراش، وتداخل كل تربية زوج.
    2. ملء بطاقات القفص مع جميع المعلومات المطلوبة، بما في ذلك الجنس، وتاريخ الميلاد، وضغط الماوس، وتاريخ عند التزاوج يتم إعداد.

3-خصوبة الدراسة

  1. تحديد الحيوانات التي ستستخدم لدراسة الخصوبة. التأكد من وجود الحيوانات ناضجة جنسياً (الخطوة 1). مجموعة عمر المستخدمة عادة لإعداد دراسة خصوبة في الفئران هو الأسابيع 10-16 من العمر، سن التي أنجزت فيها النضج الجنسي في الظروف الأكثر تجريبية.
  2. على طاولة نظيفة، ضع القفص تربية إعدادها في "الخطوة 2، 3".
  3. الصيد وأمسك الماوس.
    1. ببطء إدخال يد القفاز في القفص الماوس. اترك اليد في القفص لفترة قصيرة من الزمن (~ 5-30 ثانية)، السماح للفئران تتكيف مع رائحة القفازات واليد. تجنب الحركات المحمومة ومتشنج.
    2. أقل من ناحية المقعر قريبة من الجزء السفلي من القفص وتناولها ببطء للفئران. سيتم تشغيل بعيداً. عند تشغيلها على اليد، فخ ذيل ماوس واحدة بين الإبهام والسبابة.
    3. أرفع الماوس من ذيله ل s 2-3. إذا كان الماوس يحتاج إلى عقد أطول، التمسك الذيل وضع الماوس في اليد الكاسي الحفاظ على الاستمرار في الذيل.
  4. نقل 1 الذكور والإناث 1 بعد ذلك في قفص تربية بالضغط عليها من ذيله (الخطوة 3، 3). التأكد من وجود الإناث في نفس المرحلة استروس عند إعداد المقايسة الخصوبة. تحديد مرحلة استروس من الإناث عن طريق إجراء لطاخة مهبلية كما هو موضح في "الخطوة 1، 7".
  5. إغلاق القفص، وضمان أن الفئران بالمواد الغذائية والمياه وتداخل. إرفاق قفص حامل البطاقة مع بطاقة قفص القفص.
  6. ضع القفص تربية على الرف الإسكان. إجازة تربية القفص دون عائق قدر الإمكان لكامل مدة الدراسة الخصوبة. إجراء دراسة الخصوبة لمدة 30 يوما. لكل زوج من تربية والاحتفاظ بسجلات تفصيلية ونلاحظ 1) تاريخ التزاوج هو إعداد، 2) تاريخ ليتر يولدون و 3) عدد الجراء ولد، بما في ذلك الجراء الميت والحي. إجراء تدقيقات القمامة يوميا طوال فترة الدراسة.
  7. إطالة الخصوبة هو وضع دراسة لمدة 30-60 يوما إضافيا إذا لم يوجد أو لها تأثير ضعيف على الخصوبة في "الخطوة 3، 6".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النتائج المعروضة من اثنين من نماذج مختلفة وراثيا الماوس حيث تم حذف النسخ عامل البطني الأمامي هوميوبوكس 1 (Vax1) في الجسم كله في اليل واحد، يشار هنا إلى heterozygote الفئران (HET)13، أو Vax1 تم حذف شرطيا داخل جنره الخلايا العصبية22، يطلق عليها هنا كو الشرطي (ككو). قبل إعداد دراسة الخصوبة، من المهم أن تؤكد بداية البلوغ في جميع الفئران.

أولاً، أنشئ يوم والوزن في افتتاح المهبل وفصل بريبوتيال. في الفئران HET، فتح المهبل وفصل preputial وقع في نفس العمر والوزن كما هو الحال في الفئران التحكم (الشكل 3 ألف و واو، على التوالي). على النقيض من ذلك، فتح المهبل وفصل preputial كانت إلى حد كبير تأخر في ككو الإناث والذكور والمرتبطة بزيادة وزن الجسم (الشكل 3 ز، على التوالي). بداية البلوغ إلى حد ما المرتبطة بوزن الجسم، وهذا صحيح بصفة خاصة في الإناث23. لتحديد إذا كان التأخير في افتتاح المهبل وفصل preputial ارتبط بتأخر في اكتساب الوزن، وزن الجسم في متوسط العمر وفتح المهبل وفصل بريبوتيال في عناصر التحكم (4.5 أسابيع من العمر) تمت مقارنة بوزن الجسم في ككو في الذكور والإناث في أسابيع 4.5 من العمر. في سن الأسبوعين 4.5، ضوابط الإناث وككو كان وزن الجسم مماثلة (الشكل 3)، بينما كانت ككو الذكور أثقل قليلاً من عناصر التحكم (ح الشكل 3). وهذا يشير إلى أن التأخير في افتتاح المهبل وفصل بريبوتيال في ككو لم يقترن بأي تأخير في زيادة الوزن.

افتتاح المهبلي علامة مبكرة النضج الجنسي والسفاد أول مؤشر على حدوث الإباضة الأولى، علامة على الانتهاء من سن البلوغ17. لتحديد إذا كانت الإناث HET وككو بلغ السفاد الأول في نفس العمر والوزن كعناصر تحكم، أجريت مسحات المهبل يوميا من يوم افتتاح المهبلي حتى السفاد الأول (3E الشكل و 3D). في الفئران HET، السفاد الأول والوزن في السفاد الأول كانت قابلة للمقارنة بين عناصر التحكم وحيتس (3D الشكل). وفي المقابل، ككو لم يتقدم خلال دورة الشبقية ولم يكن السفاد الأول في سن ال 80 يوما (رقم 3E). وهذا التأخير لم يكن بسبب انخفاض الوزن (رقم 3E).

واستخدمت الفئران HET مع بداية البلوغ مؤكدة لإعداد دراسة الخصوبة. تحليل الخصوبة أنشئت في ضوء ح 12 وظروف مظلمة ح 12 (LD12:12) في الفئران المعدلة وراثيا على خلفية وراثية C57BL/6J. كانت على الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 10-16 أسبوعا في بداية التجربة. وجرت دراسة أربع مجموعات من الفئران: التحكم في ماتينجس (وتكسوت)، والتحكم في الذكور مع الإناث HET (وتكسهيت)، HET الذكور مع الإناث WT (هيتكسوت)، و HET الذكور مع الإناث HET (هيتكسهيت). أولاً، تم تحديد عدد ليتر ولدت في 3 أشهر. مراقبة ماتينجس (وتكسوت) ولدت في متوسط 2.8 ليتر في 3 أشهر، التي كانت مماثلة للذكور HET المقترنة مع عنصر تحكم الإناث (هيتكسوت التزاوج، الشكل 4A). HET الإناث، سواء يقترن WT ذكور (مراقبة)، أو من HET ذكور، ولدت ليتر أقل كثيرا في دراسة الخصوبة لمدة 3 أشهر، تكشف عن أن تكون الإناث HET سوبفيرتيلي13. لتوضيح أهمية التأكد من بداية البلوغ قبل إعداد مقايسة خصوبة، تم تقييم الكفاءة التناسلية في الفئران ككو، حيث أخرت الذكور فصل بريبوتيال (الشكل 3) والإناث لم يكن الأول السفاد قبل 80 يوما عمر (3E الشكل). تم إعداد دراسة الخصوبة > 1 أسبوع بعد الذكور قد فصل بريبوتيال، وفي الإناث في > 80 يوما عمر. أثناء دراسة الخصوبة 70 يوما، ماتينجس عنصر التحكم التي تم إنشاؤها في متوسط 2.2 ليتر، بينما تم إنشاؤها لا ليتر من أما إقران ككو الإناث مع الذكور WT، أو الذكور ككو المقترنة مع عنصر تحكم (WT) أنثى (الشكل 4 باء)، تبين أن هذه الفئران هي العقم5،22.

أفضل وصف النمط الظاهري خصوبة الإناث HET، سجلنا عدد الأيام التي استغرق لتوليد القمامة الأولى. ولدت ماتينجس وتكسوت على القمامة الأولى في متوسط لمدة 22 يوما (الشكل 4)، التي كانت مماثلة للذكور HET يقترن الإناث WT. HET الإناث مع الذكور WT استغرق في متوسط 58 يوما لإنتاج تلك القمامة الأولى، الذي كان مماثلة إلى هيتكسهيت ماتينجس (الشكل 4). ومع ذلك، كان التأخير في توليد القمامة أول من الإناث HET ايربان جداً، وتأخر أكثر في ماتينجس هيتكسهيت، مما يشير إلى penetrance شبه للنمط الظاهري، ومساهمة من الذكور HET إلى الحيضية لوحظت في هيتكسهيت ماتينجس13 .

تقييم حجم القمامة يمكن أن تعطي معلومات هامة حول إنتاج الإباضة/غرس والحيوانات المنوية. وكان تحديد حجم متوسط ليتر 3 أولاً. من المثير للاهتمام، كل التزاوج تركيبات (وتكسهيت، هيتكسوت، هيتكسهيت) أنتجت ليتر أصغر بكثير بالمقارنة مع عناصر التحكم (وتكسوت، الرقم 4)، تبين أن كل من الذكور والإناث من الفئران HET سوبفيرتيلي.

Figure 1
رقم 1: المحور طائي جوندال الغدة النخامية يتحكم النضج الجنسي والإنجاب- على قمة المحور الإنجابية هي الخلايا العصبية كيسبيبتين طائي (الدوائر الصفراء) وتروج – الإفراج عن هرمون (GnRH) الخلايا العصبية (دوائر خضراء). في فترة الأحداث (prepubertal)، الإصدار كيسبيبتين الخلايا العصبية كيسبيبتين قليلاً على جنره الخلايا العصبية. وبعد بداية البلوغ، هو زيادة كيسبيبتين الإفراج عن الخلايا العصبية جنره (بعد البلوغ). زيادة جنره الإفراج في أواخر فترة الأحداث يزيد بشكل كبير الهرمون (LH) والمسام حفز الإفراج عن هرمون (FSH) من الغدة النخامية، مما يؤدي إلى نضج جوندال ووظيفة الإنجاب في سن البلوغ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تحديد بداية البلوغ في الفئران. علامة خارجية لبداية البلوغ في الفئران فصل بريبوتيال (A) في الذكور، والمهبل في الإناث. مقياس بار = 1 سم. (ب) مثل الصور من غسل المهبل المستخدمة لتحديد السفاد الأول. شرائح تم كونتيرستينيد لمدة 30 ثانية مع 0.1% الميثيلين الأزرق، أيردريد ولاحظ في 20 X التكبير. السهام السوداء تشير إلى الخلايا الظهارية الأنوية وتشير الأسهم الصفراء مع الخطوط العريضة السوداء إلى الكريات البيضاء وتشير الأسهم البيضاء كورنيفيد الخلايا الظهارية. حدث السفاد الأول في اليوم العاشر بعد افتتاح المهبل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: ممثلة من البيانات التي يمكن أن تتولد من دراسة بداية البلوغ. (أ، ب) فتح المهبل والوزن في افتتاح المهبل في نماذج الماوس المحورة وراثيا. (ج) الوزن في أسابيع 4.5 في الإناث من التحكم وككو. (د، ه) العمر والوزن في السفاد الأول. (و، ز) العمر والوزن في فصل بريبوتيال. (ح) الوزن في أسابيع 4.5 في الذكور السيطرة وككو. وتمثل البيانات يعني ± sem. N = 5-10 كل التحليل الإحصائي، ومجموعة اختبار t للطالب. ف< 0.01؛ ف< 0.001. تم تعديل هذه الأرقام من13،المنشور السابق22. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تحليل الممثل من دراسة خصوبة من الفئران المعدلة وراثيا- وأجرى تقييم الخصوبة من الفئران HET Vax1 (أ) و (ب) ككو العذراء 10-16 أسبوع الفئران وسجل عدد ليتر في الأطر الزمنية المشار إليها. وتمثل البيانات ± وسائل التحليل الإحصائي sem. وكان يؤديها ANOVA اتجاه واحد متبوعاً باختبار المقارنة متعددة في دونيت. * ف< 0.05؛ ف< 0.001. (ج) عدد الأيام للقمامة الأولى (n = 5-12)، و (د) القمامة متوسط الحجم لليتر الثلاثة الأولى (n = 10-13) مصممة. وتمثل البيانات يعني ± التحليل الإحصائي sem. قامت باختبار t للطالب مقارنة بوزن × الوزن *p< 0.05؛ ف< 0.01. تم تعديل هذه الأرقام من13،المنشور السابق22. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: إعداد مقايسة خصوبة. (أ) مثال لتربية مخطط والعدد المقترح من الحيوانات اللازمة لتحليل خصوبة. العدد الكلي للحيوانات المطلوبة لدراسة الشروط 2 مثل عنصر تحكم مقابل الدايت كو أو السيطرة مقابل حمية الدهون عالية حيث يتم تقييم الخصوبة في الذكور والإناث على حد سواء: 2 الفئران للتزاوج (1 ذكر x أنثى 1) × 8 الحيوانات كل مجموعة x 2 الشروط x 2 بين الجنسين s (لتقييم خصوبة الذكور والإناث على حد سواء) = إجمالي 64 الحيوانات كل دراسة. إذا كان يتم دراسة خصوبة الذكور والإناث في نفس الوقت، يمكن عادة تخدم مجموعة واحدة من مراقبة × ماتينجس عنصر التحكم مقارنة التأثير في الإنجاب الذكور والإناث على حد سواء. (ب) عند إعداد مقايسة خصوبة، يلزم الفئران المستخدمة قد وصلت إلى مرحلة النضج الجنسي. سلالات مختلفة من الفئران الخصائص الإنجابية المختلفة وتصل إلى مرحلة النضج الجنسي في مختلف الإعمار24. للحصول على مزيد من المعلومات حول الفئران، انظر المنشور السابق25. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الرفاه العام للفئران أمر بالغ الأهمية ل تحليل خصوبة ناجحة21. عند القيام تحليل خصوبة، من المهم أن لا جسديا التحقق في الفئران كل يوم كهذا يمكن أن يسبب الإجهاد. كذلك تجنب التغييرات المتكررة القفص، أن هذه أيضا مرهقة. من الناحية المثالية سوف يتم التغييرات القفص لا يزيد عن 1-2 مرات في الأسبوع. التعرض للضوء أثناء مرحلة الظلام يؤثر سلبا على تربية في القوارض ليلية. لا يتم تشغيل الأضواء في الغرفة تربية خلال ساعات الظلام. إذا كان الدخول إلى الغرفة المطلوبة خلال ساعات الظلام، استخدام الإضاءة الخافتة الضوء الأحمر. الضغوطات آخر هو وجود روائح المفرط أو الاهتزازات أو الضوضاء في فيفاريوم لكل أو أجزاء من هذه الدراسة. للمساعدة في تخفيف حدة التوتر وتحسين رفاهية الماوس وتربية، إعطاء الفئران تداخل الأنواع المادية أو غيرها من تخصيب اليورانيوم. بناء العش هو سلوك هام في الفئران، وسيزيد من نجاح تربية. كما تسمح الاعشاش الفئران مكاناً لإخفاء واللعب. تكاثر الحيوانات صحية ويحصلون على تغذية جيدة جيدا، ولذلك من المهم توفير إعلانية libitum الوصول إلى المياه والأغذية عالية الجودة. إذا كان أزواج تربية ابدأ أن تظهر أعراض المرض، مثل التهاب الجلد (متكررة في C57BL/6J)، مالوككلوسيون الأسنان أو غيرها، استبعاد هذه الفئران من الدراسة. وبالإضافة إلى ذلك، إذا تجري الدراسة في الفئران العوز، أنها مفتاح أن الغرفة الماوس يتم الاحتفاظ النظيفة للحفاظ على الخصوبة.

لإعداد دراسة خصوبة على النحو الملائم، من المهم أن تقرر إذا كان سيتم إجراء الدراسة في الفئران العذراء أو مربي ثبت كذلك بعناية تحديد الفئران المستخدمة لعنصر التحكم ماتينجس. يجب تشغيل عنصر التحكم ماتينجس بالتوازي مع المربين التجريبية. وهذا أمر حتمي كعوامل الإجهاد غير معروف أو غير متوقعة، والتغيرات في البيئة يمكن أن يسبب تغييرات في تربية معدل. ماتينجس تحكم تفضيلي تتألف من الأصحاب القمامة للفئران التجريبية (الشكل 5A). هذا مهم خاصة عندما يتم دراسة الخصوبة في الفئران مع الخلفية الجينية مختلطة بسبب اختلافات كبيرة في تربية الخصائص بين سلالات الماوس (الشكل 5 (ب)).

تحديد النمط الظاهري الحيضية يمكن أن يكون تحديا بسبب طول فترة طويلة من الدراسة، والحاجة إلى تحليل معلمات إضافية للكشف عن قضيتها. الفأر HET في بيانات تمثيلية مثال جيد النمط الظاهري الحيضية متواضعة (الشكل 4)، وتحليل الموسعة المطلوبة لتحديد الحيضية الذكور. كما هو موضح في نتائج الممثل (الشكل 3 و 4)، بداية طبيعية لسن البلوغ (الشكل 3 ألفو دال و) يمكن أن تكون مقترنة الحيضية من الذكور والإناث (الشكل 4 أ، ج، د ). في هذه الحالة، الفئران كانت فقط دون الخصبة، وهكذا تم تمديد مدة الدراسة لمدة 120 يوما. وهذا مهم، كدراسة خصوبة أقصر (مثلاً.، 60 يوما) أن لم تكن قادرة على الكشف عن النمط الظاهري في. الحيضية الذكور كان متواضعا، وكشفت أولاً عندما كان يقترن HET الذكور الإناث HET، التي كانت أيضا سوبفيرتيلي (الشكل 4 أ). وفي الواقع، أكد الحيضية الذكور HET عند تقييم متوسط حجم ليتر أنجب (الشكل 4). متابعة الدراسات أكدت الحيضية الذكور، وكشفت عن نوعية الحيوانات المنوية فقيرة في الذكور HET، مع إجراء تخفيض ~ 80% في الحيوانات المنوية متحركة13.

عند القيام الخصوبة وبداية البلوغ الدراسة في الفئران مع تأخير كبير في بداية البلوغ (> 5 أيام)، فمن المهم النظر في العوامل المختلفة التي تنظم بداية البلوغ26. على الرغم من أن افتتاح المهبلي والسفاد الأول في أغلب الأحيان يحدث التزامن في الفئران، السفاد الأول في الفئران عادة ما يحدث بعد افتتاح المهبلي25،27~ 10 أيام. لذلك، من المستحسن لضمان وضع فتح المهبل والسفاد الأول عند العمل في الجرذان والفئران18،28. بداية البلوغ مرتبط بحالة التمثيل الغذائي ووزن الجسم في الإناث و بدرجة طفيفة في الذكور1،،من79،29، وعلى هذا النحو، سيكون على العلاج أو الطفرات الوراثية تباطؤ نمو الحيوان في بعض الحالات نتيجة في بداية البلوغ المتأخر. لتحديد ما إذا كان التأخير/النهوض في بداية البلوغ قد تكون مرتبطة بالنمو السريع/بطيئة، من المهم أن وزن الفئران يوميا أثناء التقييم لبداية البلوغ. كما يتضح في الشكل 3B ج، فضلا عن زاي ، و حاء، التأخر في بداية البلوغ لم يترافق مع انخفاض الوزن، ولكن تأخر حقيقي في بداية البلوغ، كما أكدت جوندال علم الأنسجة وتعميم هرمون 22من المستويات. أحد القيود الرئيسية لاستخدام الفصل بريبوتيال وفتح المهبل كعلامات لبداية البلوغ أن كلاهما غالباً ما سيحدث في نهاية المطاف على مر الزمن بسبب آليات أخرى من زيادة النشاط المحور الإنجابية18، 30 , 31 (الشكل 1). مثال على ذلك هو تأخر افتتاح المهبل في الإناث ككو (الشكل 3B). لم تصبح الإناث ككو الخصبة بسبب غياب الإباضة22 (رقم 3E). وفي الواقع، كذلك أثبتت الدراسات تقييم مستويات الهرمونات والأنسجة جوندال الفئران ككو أن هذه الفئران ابدأ إكمال سن البلوغ، وكانوا يعانون من العقم22 (الشكل 4 باء). وهذا يدل الحد من استخدام علامات خارجية لتحديد بداية البلوغ. إكمال سن البلوغ ووصلت إلى مرحلة النضج الجنسي يتطلب زيادة الإصدار جنره وتفعيل المحور الإنجابية (الشكل 1)، وتأكيد النضج الجنسي الكامل جوندال مورفولوجيا وتعميم مستويات الهرمونات تحتاج إلى تقييم 22 , 31-في الذكور، وقياس التستوستيرون، وتقييم حجم حويصلة ومورفولوجيا الخصية والحجم بالإضافة إلى جودة الحيوانات المنوية سوف يؤكد سن البلوغ وقد حققت16،،من2232. في الإناث، وقياس مستويات البروجسترون والاستروجين في تركيبة مع وزن الرحم والمبيض ومورفولوجيا سيؤكد إكمال سن البلوغ17،،من1922،33.

يمكن أن يؤثر حجم القمامة طول فترة الحمل وسن بداية البلوغ. معظم الماوس سلالات لها فترة الحمل من 18-22 يوما. ومع ذلك، إذا كان يتوقع الأم القمامة كبيرة، فترة الحمل يميل إلى أن يكون انخفاض34،35. من ناحية أخرى، إذا كانت الأم هي التمريض القمامة سابقة، يمكن أن ينتج تمديدا ل فترة الحمل5. الجراء في ليتر الكبيرة تميل أيضا إلى أخرت بداية البلوغ. يحدث هذا بسبب نموها قليلاً ويجري تأخير مقداره1،9،،من3435. إذا كان يتم إجراء دراسة خصوبة وإحدى المجموعات الماوس (التحكم أو التجريبية) تنتج ليتر كبيرة جداً، من المستحسن لمجانسة القمامة الأحجام، كما وصف إعدام، السماح لليتر درس أحجام قابلة للمقارنة.

لا يمكن استنساخ المقررة في فيفو سبب متعددة الهيئات المعنية في الاستنساخ (الشكل 1) وتنظيم الإنجاب المحور3آليات ردود فعل واسعة. يمكن تقييم بعض جوانب الكفاءة الإنجابية سريعاً من خلال مقايسة توصيل مهبلي، حيث يلاحظ قدرة الذكور جبل الأنثى وترك المكونات مادية في المهبل13،36. على الرغم من أن هذا نهج مفيدة لتقييم السلوك الجنسي للذكور، وهذا النوع من الدراسة لا تسمح بالكشف عن مشاكل ثانوية في الإنجاب، ولا تقييم الحفاظ على الخصوبة لفترة طويلة من الوقت أو حجم القمامة الناتج وسلوك الوالدين. البروتوكول هو موضح هنا يقدم مزايا عديدة أكثر مقايسة توصيل، الرئيسية حاليا القدرة على تحديد الآثار الصغيرة والكبيرة على حد سواء على الكفاءة التناسلية في الذكور والإناث (الشكل 4).

الخصوبة يتناقص مع التقدم في السن، وعلاوة على ذلك الدورة الشبقية أنثى يصبح أطول وغير النظامية أثناء الشيخوخة5،28. ولذلك يوصي ببدء دراسة خصوبة في الشباب وناضجة جنسياً الحيوانات. مجموعة عمر المستخدمة عادة لإعداد دراسة خصوبة هو الأسابيع 10-16 من العمر. ومع ذلك، من المهم أن تكون على دراية بالخصائص الإنجابية المحددة من سلالة الماوس المستخدمة في الدراسة، ونظرا لوجود اختلافات كبيرة في الإنجاب ومرحلة النضج الجنسي بين الماوس المختلفة أو سلالات الفئران (الشكل 5 (ب)). يمكن العثور على معلومات إضافية حول الخصائص الإنجابية في https://phenome.jax.org/جاكس الماوس فنوم قاعدة البيانات. أداء لفترة أطول (> الشهر 4) دراسة الخصوبة لديها ميزة كونها قادرة على الكشف عن انخفاض الإنجاب المبكر، حيث الفئران قد تولد عادة في الأشهر الأولى من 1-2 من تحليل الخصوبة، ولكن ثم قد حدث انخفاض مبكر في الاستنساخ ابتداء من قبل 6 أشهر عمر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.

Acknowledgments

أشكر المؤلف المساهمة في الأعمال الأولية التي هي الأساس لهذا المنشور. بفضل أيتور أغيري، جنفييف هاء ريان وايريكا ل. للحصول على تعليمات إعداد المخطوطة. وبفضل جيسيكا لي سورا والذقن أوستن للمساعدة التقنية مع المخطوطة. وأيد H.M.H. يونيس كينيدي شرايفر الوطني معهد صحة الطفل والتنمية البشرية من "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة رقم R00HD084759.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile Cotton Balls Fisher 22456885
Surface protector Fisher 1420637
Light meter VWR 21800-014
Methylene blue  Sigma-Aldrich M9140
Microscope Slides Genesee Scientific 29-101
Optimouse rack with cages AnimalCare systems C89100
Water Bottle Basket  AnimalCare systems C61011
Filtered Cage Tops AnimalCare systems C78210
Optimice Standard Feeder AnimalCare systems C40100SG
Cage Card Holder AnimalCare systems C43251
Cage Cards AnimalCare systems M52010
Bottle Assambley AnimalCare systems C79122P
Bed R'Nest Nesting The Andersons BRN4WSR
1/8" Corn Cob bedding  The Andersons 8B
Standard mouse chow Teklad 7904 (7004)
Scale VWR 10205-004
Polypropylene Beaker Fisher 14-955-111F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schneider, J. E. Energy balance and reproduction. Physiology and Behavior. 81 (2), 289-317 (2004).
  2. Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function. Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2012).
  3. Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, (2016).
  4. Kauffman, A. S. Sexual differentiation and the Kiss1 system: Hormonal and developmental considerations. Peptides. , (2009).
  5. Bronson, F. H., Dagg, C. P., Snell, G. D. Reproduction. , Dover Publications, Inc. New York. (1966).
  6. Chehab, F. F., Mounzih, K., Lu, R., Lim, M. E. Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin. Science. , (1997).
  7. Yoshimura, S., Yamaguchi, H., Konno, K., Ohsawa, N., Noguchi, S., Chisaka, A. Observation of Preputial Separation is a Useful Tool for Evaluating Endocrine Active Chemicals. J Toxicologic Pathology. 18, 141-157 (2005).
  8. Ahima, R. S., Dushay, J., Flier, S. N., Prabakaran, D., Flier, J. S. Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice. Journal of Clinical Investigation. 99 (3), 391-395 (1997).
  9. Bohlen, T. M., et al. A short-day photoperiod delays the timing of puberty in female mice via changes in the kisspeptin system. Frontiers in Endocrinology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
  10. Shahab, M., Mastronardi, C., Seminara, S. B., Crowley, W. F., Ojeda, S. R., Plant, T. M. Increased hypothalamic GPR54 signaling: A potential mechanism for initiation of puberty in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2005).
  11. Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, 5-9 (2016).
  12. Navarro, V. M., et al. Role of Neurokinin B in the Control of Female Puberty and Its Modulation by Metabolic Status. Journal of Neuroscience. 32 (7), 2388-2397 (2012).
  13. Hoffmann, H. M., Tamrazian, A., Xie, H., Pérez-Millán, M. I., Kauffman, A. S., Mellon, P. L. Heterozygous deletion of ventral anterior homeobox (Vax1) causes subfertility in mice. Endocrinology. 155 (10), 4043-4053 (2014).
  14. Kauffman, A. S., et al. The Kisspeptin Receptor GPR54 Is Required for Sexual Differentiation of the Brain and Behavior. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8826-8835 (2007).
  15. Teles, M. G., et al. Brief report: A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty. New England Journal of Medicine. , (2008).
  16. Korenbrot, C. C., Huhtaniemi, I. T., Weiner, R. I. Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biology of reproduction. , (1977).
  17. Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: The puberty ovarian maturation score (Pub-Score). Scientific Reports. 7 (March), 1-11 (2017).
  18. Caligioni, C. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , 1-11 (2010).
  19. Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor -signaling in kisspeptin neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22693-22698 (2010).
  20. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. (67), 4-9 (2012).
  21. Hedrich, H. The Laboratory Mouse. , Academic Press. (2012).
  22. Hoffmann, H. M., Trang, C., Gong, P., Kimura, I., Pandolfi, E. C., Mellon, P. L. Deletion of Vax1 from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Abolishes GnRH Expression and Leads to Hypogonadism and Infertility. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3506-3518 (2016).
  23. Sloboda, D. M., Howie, G. J., Pleasants, A., Gluckman, P. D., Vickers, M. H. Pre- and postnatal nutritional histories influence reproductive maturation and ovarian function in the rat. PLoS ONE. , (2009).
  24. Manual, R. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. Management. , (2007).
  25. Kennedy, G. C., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. The Journal of Physiology. , (1963).
  26. Sisk, C. L., Foster, D. L. The neural basis of puberty and adolescence. Nature Neuroscience. 7 (10), 1040-1047 (2004).
  27. Nelson, J. F., Karelus, K., Felicio, L. S., Johnson, T. E. Genetic influences on the timing of puberty in mice. Biology of reproduction. , (1990).
  28. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. , (1982).
  29. Falconer, D. S. Weight and age at puberty in female and male mice of strains selected for large and small body size. Genetical Research. , (1984).
  30. Rodriguez, I., Araki, K., Khatib, K., Martinou, J. C., Vassalli, P. Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of Bcl2. Developmental Biology. , (1997).
  31. Lomniczi, A., Wright, H., Ojeda, S. R. Epigenetic regulation of female puberty. Frontiers in Neuroendocrinology. 36, 90-107 (2015).
  32. Selmanoff, M. K., Goldman, B. D., Ginsburg, B. E. Developmental changes in serum luteinizing hormone, follicle stimulating hormone and androgen levels in males of two inbred mouse strains. Endocrinology. 100 (1), 122-127 (1977).
  33. Larder, R., Clark, D. D., Miller, N. L. G., Mellon, P. L. Hypothalamic Dysregulation and Infertility in Mice Lacking the Homeodomain Protein Six6. Journal of Neuroscience. 31 (2), 426-438 (2011).
  34. Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number. Comparative Biochemistry and Physiology -- Part A: Physiology. 84 (1), 127-133 (1986).
  35. Chahoud, I., Paumgartten, F. J. R. Influence of litter size on the postnatal growth of rat pups: is there a rationale for litter-size standardization in toxicity studies. Environmental research. 109 (8), 1021-1027 (2009).
  36. Pandolfi, E. C., Hoffmann, H. M., Schoeller, E. L., Gorman, M. R., Mellon, P. L. Haploinsufficiency of SIX3 Abolishes Male Reproductive Behavior Through Disrupted Olfactory Development, and Impairs Female Fertility Through Disrupted GnRH Neuron Migration. Molecular Neurobiology. , (2018).

Tags

البيولوجيا، 140 قضية، بداية البلوغ، تحليل الخصوبة، الكفاءة التناسلية، فصل preputial، افتتاح المهبلي، السفاد الأول، الماوس، القوارض، الفئران، الذكور، الإناث، وزن الجسم
تحديد الكفاءة الإنجابية التي تؤكد بداية البلوغ، والقيام تحليل خصوبة في الفئران والجرذان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hoffmann, H. M. Determination of… More

Hoffmann, H. M. Determination of Reproductive Competence by Confirming Pubertal Onset and Performing a Fertility Assay in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (140), e58352, doi:10.3791/58352 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter