Summary
Mange behandlinger og genetiske mutationer påvirker timingen af seksuel modenhed og frugtbarhed. Denne protokol beskriver en non-invasiv metode til at vurdere puberteten debut i mus og rotter forud for oprettelsen af en Fertilitetsundersøgelse hos kønsmodne dyr.
Abstract
Vurdering af reproduktive kompetence er afgørende for at forstå virkningen af en behandling eller genetisk manipulation på den reproduktive akse, også kaldet hypothalamus-hypofyse-gonadale akse. Den reproduktive akse er en nøgle integrator af miljø og indre input tilpasning frugtbarhed til gunstige betingelser for reproduktion. Før indlede en Fertilitetsundersøgelse hos mus og rotter, seksuel modenhed er evalueret for at udelukke muligheden for, at den observerede reproduktive fænotyper skyldes forsinket eller fraværende puberteten debut. Denne protokol beskriver en non-invasiv metode til at vurdere puberteten debut hos mænd gennem bestemmelse af preputial adskillelse, og hos kvinder gennem vaginal åbning og første estrus. Efter bekræftelse af gennemførelsen af puberteten og opnåelsen af seksuel modenhed, kan en Fertilitetsundersøgelse indledes. Proceduren beskriver de optimale avl betingelser for mus og rotter, hvordan man opsætter en Fertilitetsundersøgelse og hvad parametre til at vurdere og afgøre, om behandling eller gen sletning har en indvirkning på fertilitet.
Introduction
Overgangen gennem puberteten er nødvendige for at nå seksuel modenhed og reproduktive kompetence. Puberteten overgangen og vedligeholdelse af frugtbarhed i voksenalderen er reguleret af den reproduktive akse, også kaldet hypothalamus-hypofyse-gonadale akse (figur 1). Timingen af puberteten indsættende og vedligeholdelse af frugtbarhed er stramt reguleret af interne såvel som miljømæssige faktorer til at øge chancerne for overlevelse af afkom og forældre1,2. Denne protokol giver en non-invasiv metode til at bestemme puberteten debut i mus og rotter at bekræfte seksuel modenhed før opsætning af en Fertilitetsundersøgelse at vurdere reproduktive kompetence.
En Fertilitetsundersøgelse udføres i kønsmodne dyr og kan iværksættes efter dyrene har gået gennem puberteten. Før puberteten debut, den reproduktive akse er inaktiv, og den vigtigste drivkraft for seksuel modning, gonadotropin - releasing hormon (GnRH), er udgivet på hypofysen i tilstrækkelige mængder til at indlede puberteten (figur 1). Puberteten debut er en kompleks proces, der resulterer i øget GnRH frigivelse ved medianen eminence. GnRH fremmer luteiniserende hormon (LH) og follikelstimulerende hormon (FSH) sekretion fra hypofysen, to hormoner afgørende for gonadale modning og reproduktive funktion (figur 1)3,4,5 .
Fornærmelser mod den reproduktive akse resultere i nedsat frugtbarhed og kan også forskud eller forsinkelse puberteten debut. Kendt for at påvirke timingen af puberteten debut og reproduktive kompetence omfatter eksponering for hormonforstyrrende kemikalier6,7, øget/nedsat organ vægt1,8, ændringer i dag længde2,9 og genetiske mutationer10,11,12,13,14,15.
Udbrud af seksuel modenhed er et afgørende skridt, der skal være afsluttet inden oprettelse af en fertilitet assay. Fordele ved bestemmelse af puberteten indsættende gennem preputial adskillelse, vaginal åbning og første estrus, er de ikke-invasiv Karakteristik af disse procedurer, som de ikke kræver blod samling eller ofringen af den animalsk16, 17.
Efter puberteten indsættende bestemmes, korrekt opsætning af en Fertilitetsundersøgelse vil give vigtige oplysninger om integriteten af den reproduktive akse, og normalt har den anden fordel at generere forsøgsdyr for yderligere undersøgelser (refinement) 18. fertilitet undersøgelse konfigurationen som beskrevet i denne protokol kan afsløre både mindre og større underskud i reproduktiv kompetence i hanner og hunner. Vigtige parametre evalueres omfatter 1) tid til den første kuld, 2) antal kuld genereret i en given tidsramme og 3) kuld størrelse. Endelig er anbefalinger for den opfølgende undersøgelser, som kan udføres til at identificere årsagen til fertilitet værdiforringelse inkluderet.
Den beskrevne protokol refererer til mus og de repræsentative data afspejler arbejdet i Transgene mus. Alle de inkluderede protokoller er dog lige så gyldige i rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der beskrives her har godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Michigan State University og gennemført i overensstemmelse med retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr.
1. Bestem puberteten debut
- Følg institutionelle retningslinjer for tøj, som minimum, er det nødvendigt at bære en ren laboratoriekittel og rene handsker. Altid håndtere mus rene handsker.
- Forberede arbejdsområdet ved at placere en pad på bordet.
- Placer en ren mus bur top med nettet vender opad på puden.
- Oprette en skala i arbejdsområdet. Placer en ren 500 – 1000 mL bægerglas på skalaen og Tara.
- Placer et ark ved siden af arbejdsområdet til at optage kropsvægt og preputial adskillelse, vaginal åbning eller første estrus.
- Identificere mus for undersøgelsen. Udføre daglige inspektioner for puberteten symptomdebut, indtil puberteten er nået. Udføre inspektion på det samme tidspunkt på dagen i hele undersøgelsen. Puberteten udbrud kan opstå så tidligt som postnatal dag 11-1219, men i mest eksperimenterende opsætninger, puberteten indsættende overvågning starter ved ~ 22 dage.
- Placer musen bur i arbejdsområdet (trin 1.2). Åbne buret og placere låg, vandflaske og indehaveren af mad på bordet.
- Bestemmelse af preputial adskillelse i mandlige mus.
- Mens du holder musen i halen, læg det ovenpå ren mus bur fra trin 1.2.1. Mens du forsigtigt holder fast halen, lad musen udforske nettet af cage toppen for ~ 5 s.
- Træk forsigtigt halen tilbage; Dette medfører normalt i dyret bevæger sig fremad mens du holder nettet med sine forben. Tilgang anden side at huden tæt ved hals og ører.
- Forstå den løs hud mellem skuldre og nakke med tommel- og pegefinger. Det er vigtigt at få godt fat i huden, da det vil forhindre musen fra at dreje hovedet rundt til at bide.
- Få fat i huden på ryggen med de resterende fingre og hold det ved at trykke mod hånden. Hold fast uden at hindre vejrtrækning, blood flow eller skadelige knogler, muskler og hud. Drej hånden for at udsætte maven af musen, mens støtte ryg musen i håndfladen på hånden.
- Med den frie hånd forsigtigt skubbe tilbage huden omkring penis uden at tvinge. På preputial adskillelse glider preputial huden bagud udsætter glans penis (figur 2A, pil viser preputial adskillelse). Registrere tilstedeværelsen eller fraværet af preputial adskillelse.
- Vejer musen ved at placere det forsigtigt i 500-1000 mL bægerglas fra trin 1.2.2 og optage vægten.
- Genindføre musen i boliger buret ved at holde bægerglas 0-2 cm over bur gulv og langsomt vælte bægerglasset giver musen at afslutte på egen hånd. Rens bægerglasset med vand og mildt rengøringsmiddel og tørre det ud før returnere det til omfanget og Tara skalaen.
- Bestemmelse af vaginal åbning i hunmus.
- Placer et stykke vat, bægerglas og en flaske af sterilt vand i arbejdsområdet (trin 1.2). Hæld vandet i bægerglasset. Fugte vat med sterilt vand og Placer den ved siden af buret toppen fra trin 1.2.1.
- Placer musen bur i arbejdsområdet (trin 1.2) og overføre musen fra sit hjem buret til cage top (trin 1.2.1) ved at holde det i bunden af halen. Forsigtigt trække tilbage halen for at tilskynde til en fremadrettet bevægelse af musen.
- Løfte halen samtidig støtte hofter med de frie fingre. Tillade hindlimbs at holde kontakt med toppen af buret. Hvis musen bevæger sig for meget, skal du holde den i hånden som beskrevet i trin 1.5.1-1.5.4.
- Forsigtigt rense vulva med vand fugtig vat fra trin 1.6.1. Brug en ren fugtig vat til hvert mus. Til at bestemme skedeåbningen, undersøge vulva og afgøre, om skeden er helt åben (figur 2A, kvindelige skedeåbning).
- Post Hvis skedeåbningen er opstået. Vejer musen og tilbage til home buret som beskrevet i trin 1.5.6-1.5.7.
- Første estrus en indikator for første ægløsning.
- Placere et bægerglas med sterilt vand, et mærket glas dias og en 200 µL pipette med en ren tip i arbejdsområdet (trin 1.2).
- Hold kvindelige som beskrevet i trin 1.6.2-1.6.3. Placer spidsen af pipetten indeholdende ~ 50 µL sterilt vand på vaginal åbning.
- Forsigtigt skylle celler fra vaginal væg ved at indføre og reabsorbing ~ 50 µL vand 2 - 4 gange. Smøre indholdet fra pipette tip på et mærket glas objektglas.
- Omhyggeligt observere den cellulære morfologi på brightfield mikroskop ved hjælp af en 10 X eller 20 X mål eller lad smøre airdry for ~ 1 h og derefter kontrastfarve med en 0,1% af methylenblåt (opløst i ddH2O) (figur 2B). For at kontrastfarve, dyppe den tørrede dias i 0,1% methylenblåt for ~ 30 s. Lad dias lufttørre for 1 h.
- Observere dias fra trin 1.7.4 på lysfelt mikroskop på 10 X eller 20 X. Etablere fase af estrous cyklus (figur 2B)20 ved at observere den celle morfologi, som gør det muligt at skelne mellem de fire særskilte faser af estrous cyklus (figur 2B).
Bemærk: Metestrus er karakteriseret ved en blanding af cornified planocellulære epitelceller og leukocytter, diestrus af leukocytter, proestrus af en blanding af leukocytter og nukleeret epitelceller og estrus af cornified epitel celler (figur 2B) 20. - Optage kropsvægten og returnere musen til sit hjem bur, som beskrevet i trin 1.5.6-1.5.7. Vaginal udstrygningspræparater er afsluttet på dagen når musen har sin første estrus (figur 2B).
2. ønskeligt avl lokaleforhold
- Sikre, at avl værelse har en temperatur på ~ 20-24 ° C, med 55 ± 10% fugtighed, og homogen værelses lys med en intensitet på ~ 300-400 lux ca 1 m over gulv21. Denne lysintensitet giver midten bur ønskeligt lysintensiteten i 25-80 lux. For at teste lysintensitet, bruge en lysmåler.
- Brug et automatiseret system til at styre belysningen i avl plads til at sikre passende timing af belysning i hele eksperimentet. Optimale dag-længde forhold at vurdere frugtbarhed i gnavere vifte fra døgnet 12 h (12t lys og 12 h mørke, LD12:12), at "sommer-lignende" betingelser med 14 h af lys og 10 h mørket (LD14:10)21.
- Forberede avl bure.
- Forberede en ren mus bur med låg, vand, mad, seng og nesting pr. ynglende par.
- Udfyld bur kort med alle de nødvendige oplysninger, herunder køn, fødselsdato, mus stamme og datoen for Hvornår parring er sat op.
3. Fertilitetsundersøgelse
- Identifikation af dyr skal anvendes til Fertilitetsundersøgelse. Sikre, at dyrene er kønsmodne (trin 1). En typisk anvendte aldersgruppe til at oprette en Fertilitetsundersøgelse hos mus er 10-16 uger gammel, en alder, hvor seksuelle modning er afsluttet i mest eksperimentelle betingelser.
- Et rent bord, kan placere avl buret forberedt i trin 2.3.
- Fange og holde musen.
- Langsomt indføre en behandskede hånd ind i musen buret. Forlade den side i bur i en kort periode (~ 5-30 s), giver mulighed for mus til at tilpasse sig lugten af handske og hånd. Undgå hektiske og rykvise bevægelser.
- Sænke cupped hånden tæt på bunden af buret og langsomt nærme det til mus. De vil køre væk. Når de løber over hånden, fælde halen af en mus mellem tommel- og pegefinger.
- Løfte musen i halen for 2-3 s. Hvis musen skal holdes længere, holde fast i halen og placere musen i cupped hånden opretholde hold på halen.
- Overføre 1 mand og derefter 1 kvindelige ind i avl buret ved at holde dem i halen (trin 3.3). Sikre, at hunnerne er i den samme duft fase, når du konfigurerer frugtbarhed assay. Bestemme den duft fase af hunnerne ved at udføre en vaginal smear som beskrevet i trin 1.7.
- Lukke buret, og sikre, at musene har mad, vand og nesting materiale. Vedhæfte bur-kortholderen med buret kortet til buret.
- Sted avl bur på boliger rack. Efterlad avl buret så uforstyrret som muligt for hele varigheden af Fertilitetsundersøgelse. Gennemføre Fertilitetsundersøgelse i 30 dage. For hvert tabelpar, avl, føre detaljerede fortegnelser og Bemærk 1) datoen parring er sat op, 2) datoen kuld er født og 3) antallet af hvalpe født, herunder døde og levende unger. Udføre kuld kontrol dagligt under hele undersøgelsen.
- Forlænge frugtbarhed undersøgelse for yderligere 30-60 dage hvis ingen eller en svag virkning på fertilitet er etableret i trin 3.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De præsenterede resultater er fra to forskellige transgene musemodeller hvor de transskription faktor ventrale anteriore HOXD 1 (Vax1) er blevet slettet i hele kroppen på én allel, betegnes som heterozygote mus (HET)13eller Vax1 har været betinget slettes inden GnRH neuroner22, her betegnes betinget KO (cKO). Før du konfigurerer Fertilitetsundersøgelse, er det vigtigt at bekræfte puberteten debut i alle mus.
Første blev dag og vægt på vaginal åbning og preputial separation etableret. I HET mus, vaginal åbning og preputial adskillelse fandt sted på samme alder og vægt som kontrol mus (figur 3A og F, henholdsvis). Derimod skedeåbningen og preputial adskillelse var betydeligt forsinket i cKO hunner og hanner og forbundet med øget kropsvægt (figur 3B og G, henholdsvis). Puberteten debut er til en vis grad forbundet med kropsvægt, og dette gælder især i hunner23. For at bestemme, hvis forsinkelsen i skedeåbningen og preputial adskillelse var forbundet med en forsinkelse i vægtøgning, kropsvægt i den gennemsnitlige alder af vaginal åbning og preputial adskillelse i kontrolelementer (4,5 uger gammel) var i forhold til kropsvægt i cKO hos mænd og kvinder på 4,5 ugens i alder. I alder 4,5 uger havde kvindelige kontrol og cKO sammenlignelige kropsvægt (figur 3 c), mens cKO mænd var lidt tungere end kontrol (figur 3 H). Dette indikerer, at forsinkelsen i skedeåbningen og preputial adskillelse i cKO ikke er knyttet til en forsinkelse i vægtøgning.
Vaginal åbning er en tidlig markør for seksuel modning og første estrus en indikator for, at den første ægløsning har fundet sted, en markør for afslutningen af puberteten17. For at bestemme, hvis HET og cKO hunner nåede første estrus på samme alder og vægt som kontrol, blev vaginal udstrygningspræparater udført dagligt fra dag af vaginal åbning indtil første estrus (figur 3E og 3D). I HET mus var første estrus og vægt på første estrus sammenlignelig mellem kontrol og HETs (figur 3D). Derimod cKO fremskridt ikke gennem estrous cyklus og havde ikke første estrus i en alder af 80 dage (figur 3). Denne forsinkelse skyldtes ikke reduceret kropsvægt (figur 3).
HET mus med bekræftet puberteten debut blev brugt til at oprette Fertilitetsundersøgelse. Fertilitet analysen blev sat i 12-timers lys og 12 h mørke betingelser (LD12:12) i Transgene mus på en C57BL/6J genetiske baggrund. Musene blev alderen 10-16 uger i begyndelsen af eksperimentet. Fire grupper af mus blev undersøgt: styre parringer (WTxWT), styre hanner med HET hunner (WTxHET), HET hanner med WT hunner (HETxWT) og HET hanner med HET hunner (HETxHET). Først, antallet af kuld genereret i 3 måneder blev fastsat. Kontrol parringer (WTxWT) genereret gennemsnitligt 2,8 kuld i 3 måneder, hvilket var sammenlignelig med HET hanner parret med kontrol hunner (HETxWT parring, figur 4A). HET hunner, genereret om parret med en WT mandlige (kontrol), eller en mand, HET betydeligt færre kuld i Fertilitetsundersøgelse 3 måned afslører, at HET hunner er subfertile13. For at illustrere betydningen af bekræfter puberteten debut før opsætning af en fertilitet assay, blev reproduktive kompetence evalueret i cKO mus, hvor hannerne havde forsinket preputial separation (figur 3 g) og hunnerne ikke havde deres første estrus af 80-dage gamle (figur 3). Fertilitetsundersøgelse blev oprettet > 1 uge efter mænd havde preputial adskillelse, og hos kvinder på > 80 dage gamle. Under 70-dages Fertilitetsundersøgelse kontrol parringer genereret et gennemsnit på 2,2 kuld, mens ingen kuld blev genereret fra enten for cKO kvindelige parret med en WT mand, eller for cKO mandlige parret med en kontrol (WT) kvinde (figur 4B), viser, at disse mus er ufrugtbar5,22.
For at bedre karakterisere frugtbarhed Fænotypen af HET hunner, indspillede vi antallet dage, det tog for at generere det første kuld. WTxWT parringer genereret deres første kuld i et gennemsnit på 22 dage (figur 4 c), der var sammenlignelig med HET hanner parret med WT hunner. HET hunner parret med WT hanner tog et gennemsnit på 58 dage til at producere deres første kuld, som var lig HETxHET parringer (figur 4 c). Forsinkelsen i at skabe det første kuld af HET hunnerne var imidlertid meget heterogene, og forsinket mere i HETxHET parringer, tyder på en delvis penetrans af fænotype, og et bidrag af HET mandlige til subfertilitet observeret i HETxHET parringer13 .
Evaluering af kuldstørrelse kan give vigtige oplysninger om ægløsning/implantation og sædproduktionen. Den gennemsnitlige størrelse af de første 3 kuld blev fastsat. Interessant, alle parring kombinationer (WTxHET, HETxWT, HETxHET) produceres betydeligt mindre kuld i forhold til kontrol (WTxWT, fig. 4D), der viser, at både mandlige og kvindelige HET mus er subfertile.
Figur 1: den hypothalamus-hypofyse-gonadale akse styrer seksuel modning og reproduktion. På højdepunktet af den reproduktive akse er hypothalamus kisspeptin neuroner (gule cirkler) og gonadotropin - releasing hormon (GnRH) neuroner (grønne cirkler). I juvenil perioden (præpubertale) frigive kisspeptin neuroner lidt kisspeptin på GnRH neuroner. Efter puberteten debut, er kisspeptin udgivelse på GnRH neuroner augmented (post puberteten). Øget GnRH udgivelse i den sene juvenile periode øger dramatisk luteiniserende hormon (LH) og follikelstimulerende hormon (FSH) frigives fra hypofysen, fører til gonadale modning og reproduktive funktion i voksenalderen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: bestemmelse af puberteten debut i mus. En ekstern markør af puberteten debut i mus er (A) preputial adskillelse hos mænd, og vaginal åbning i hunnerne. Skalalinjen = 1 cm. (B) eksempel billeder fra vaginal lavage bruges til at bestemme første estrus. Dias var counterstained for 30 s med 0,1% methylenblåt, airdried og observeret ved 20 X forstørrelse. Sorte pile angiver nukleeret epitelceller, gule pile med sort kontur angiver leukocytter og hvide pile angiver cornified epitelceller. Første estrus opstod på dag 10 efter vaginal åbning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative data, som kan genereres fra en puberteten indsættende undersøgelse. (A, B) Skedeåbningen og vægt på vaginal åbning i transgene musemodeller. (C) vægt på 4,5 uger i kontrol og cKO hunner. (D, E) Alder og vægt på første estrus. (F, G) Alder og vægt ved preputial adskillelse. (H) vægt på 4,5 uger i kontrol og cKO hanner. Data repræsenterer middel ± SEM. N = 5-10 pr. gruppe, statistisk analyse Student's t-test. p< 0,01; p< 0,001. Disse tal er blevet ændret fra den tidligere publikation13,22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative analyse fra en Fertilitetsundersøgelse af Transgene mus. Fertilitet vurdering af (A) Vax1 HET mus og (B) cKO blev udført i jomfru 10 til 16 uger gamle mus og antallet af kuld registreres i de angivne tidsfrister. Data repræsenterer middel ± SEM. statistisk analyse blev udført af en-vejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts flere sammenligning test. * p< 0,05; p< 0,001. (C) antallet dage til første kuld (n = 5-12), og (D) gennemsnitlig kuldstørrelse for de tre første kuld (n = 10-13) blev fastsat. Data repræsenterer middel ± SEM. statistisk analyse blev udført af Student's t-test forhold WT x WT. *p< 0,05; p< 0,01. Disse tal er blevet ændret fra den tidligere publikation13,22. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: oprette en fertilitet assay. (A) eksempel på avl af ordningen og foreslåede antal dyr kræves for en fertilitet assay. Det samlede antal dyr, der kræves til en undersøgelse med 2 betingelser, såsom en kontrol versus KO eller kontrol kost versus høj fedt diæt hvor frugtbarhed er vurderet i både hanner og hunner er: 2 mus pr. parring (1 mand x 1 kvinde) x 8 dyr pr. gruppe x 2 betingelser x 2 køn s (til at evaluere både mandlige og kvindelige fertilitet) = alt 64 dyr pr. undersøgelse. Hvis mandlige og kvindelige fertilitet undersøgelsen er udført sideløbende, kan ét sæt kontrol x kontrol parringer normalt tjene til at sammenligne både indvirkning på mandlige og kvindelige reproduktion. (B) når du opretter en fertilitet assay, musene brugt skal har nået kønsmodenhed. Forskellige stammer af mus har forskellige reproduktive egenskaber og kønsmodne på forskellige aldre24. Oplysninger om rotter, se tidligere publikation25. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den generelle velfærd af musene er afgørende for en vellykket frugtbarhed assay21. Når du udfører en fertilitet assay, er det vigtigt at ikke fysisk check på mus hver dag, da dette kan forårsage stress. Yderligere undgå hyppige bur ændringer, da disse er også stressende. Ideelt vil bur ændringer blive gjort mere end 1 - 2 gange om ugen. Lys eksponering i den mørke fase påvirker negativt avl i natlig gnavere. Ikke tænde lys i avl værelse i de mørke timer. Hvis der kræves adgang til rummet i de mørke timer, brug dim rødt lys belysning. En anden stressor er tilstedeværelsen af overdreven lugte, vibrationer eller støj i vivarium for hele eller dele af undersøgelsen. Til at lindre stress og forbedre mus velfærd og opdragelse, give musene nesting materiale eller andre former for tilsætning. Reden bygning er et vigtigt problem i mus og vil øge avl succes. Reder også tillade mus et sted at skjule og spille. Sundt og godt plejet dyr race godt, derfor er det vigtigt at give ad libitum adgang til fødevarer af høj kvalitet og vand. Hvis ynglende par begynder at udvise symptomer på sygdom, såsom dermatitis (hyppig i C57BL/6J), dental malocclusion eller andre, at udelukke disse mus fra undersøgelsen. Hvis undersøgelsen foretages i immundefekte mus, er det Derudover nøglen at musen rum holdes rent at bevare fertiliteten.
For at korrekt sat op en Fertilitetsundersøgelse, er det vigtigt at beslutte, om undersøgelsen vil blive udført i jomfru mus eller dokumenteret opdrættere såvel som omhyggeligt vælge mus bruges til kontrol parringer. Kontrol parringer bør køre parallelt med de eksperimentelle opdrættere. Dette er nødvendigt som ukendt eller uventede stressfaktorer og ændringer i miljøet kan forårsage ændringer i avl sats. Kontrol parringer er fortrinsvis sammensat af kuldsøskende til eksperimentelle mus (figur 5A). Dette er især vigtigt, når Fertilitetsundersøgelse sker i mus med blandet genetiske baggrund på grund af de store variationer i avl egenskaber mellem mus stammer (figur 5B).
At identificere en subfertilitet fænotype kan være udfordrende på grund af langvarig længden af undersøgelsen, og behovet for at analysere yderligere parametre til at afsløre årsagen. HET musen i den repræsentative data er et godt eksempel på en beskeden subfertilitet fænotype (figur 4), og den udvidede analyse skal identificere den mandlige Subfertilitet. Som vist i Repræsentative resultater (figur 3 og 4), kan normalt begyndelsen af puberteten (figur 3A, Dog F) være forbundet med både mandlige og kvindelige subfertilitet (figur 4A, C, D ). I dette tilfælde musene var kun sub frugtbare, og dermed længden af undersøgelsen blev udvidet til 120 dage. Dette er vigtigt, som en kortere frugtbarhedsundersøgelse (fx., 60 dage) ville ikke har kunnet afsløre fænotype. Den mandlige subfertilitet var beskedne, og først afsløret når HET hanner blev parret med HET hunner, som også var subfertile (figur 4A). Faktisk, subfertilitet HET hanner blev bekræftet ved vurderingen af den gennemsnitlige størrelse af kuld far (figur 4D). Opfølgende undersøgelser bekræftet den mandlige subfertilitet og afslørede en dårlig sædkvalitet hos HET mænd, med en ~ 80% reduktion i motile sædceller13.
Hvornår udfører en fertilitet og puberteten indsættende studere i mus med en større forsinkelse i puberteten debut (> 5 dage), det er vigtigt at overveje de forskellige faktorer, der regulerer puberteten indsættende26. Selv om vaginal åbning og første estrus oftest ske samtidig i rotter, opstår første estrus i mus normalt ~ 10 dage efter vaginal åbning25,27. Det anbefales derfor, at sikre, at både vaginal åbning og første estrus oprettes, når du arbejder i både rotter og mus18,28. Puberteten debut er knyttet til metaboliske status og kropsvægten hos kvinder og i mindre grad i hanner1,7,9,29, og som sådan en behandling eller genetiske mutation hæmmer dyrenes vækst vil i nogle tilfælde resultere i en forsinket puberteten indsættende. For at afgøre, om forsinkelse/avancement i puberteten debut kan være forbundet med hurtig/langsom vækst, er det vigtigt at afveje mus dagligt under vurderingen af puberteten debut. Som det ses i figur 3B og C, samt G og H, forsinkelse i puberteten debut var ikke associeret med reduceret kropsvægt, men blev et sandt forsinkelse i puberteten debut, hvilket bekræftes af gonadale histologi og cirkulerende hormon niveau22. En af de store begrænsninger ved brug af preputial adskillelse og skedeåbningen som markører for puberteten debut er at begge ofte vil ske i sidste ende over tid på grund af mekanismer end øget aktivitet af reproduktive akse18, 30 , 31 (figur 1). Et eksempel herpå er den forsinkede vaginal åbning i for cKO hunner (figur 3B). For cKO hunnerne blive aldrig frugtbare på grund af manglende ægløsning22 (figur 3). Faktisk yderligere viste undersøgelser evaluering af hormonelle niveauer og gonadale histologi for cKO mus at disse mus aldrig afsluttet puberteten og var ufrugtbar22 (figur 4B). Dette viser grænsen for at bruge eksterne markører til at bestemme puberteten debut. Afslutningen af puberteten og nå seksuel modenhed kræver øget GnRH frigivelse og aktivering af den reproduktive akse (figur 1), og du kan fuldt ud bekræfte seksuel modenhed både gonadale morfologi og cirkulerende hormonniveauer skal vurderes 22 , 31. i hanner, måling af testosteron, og evaluering af sædblæren størrelse og testiklerne morfologi og størrelse ud over sædkvalitet vil bekræfte puberteten blev opnået16,22,32. Hos kvinder, vil måling af progesteron og østrogen niveauer i kombination med uterus og æggestokkene vægt og morfologi bekræfte afslutningen af puberteten17,19,22,33.
Kuldstørrelse kan påvirke både drægtigheden længde og alder på puberteten debut. De fleste mus stammer har en drægtig af 18-22 dage. Dog, hvis moderen forventer et stort kuld, drægtighedsperioden tendens til at være reduceret34,35. På den anden side hvis moderen sygepleje en tidligere kuld, kan dette resultere i en forlængelse af gestationsalder periode-5. Unger i store kuld også tendens til at have forsinket puberteten debut. Dette er forårsaget af deres vækst bliver lidt forsinket1,9,34,35. Hvis en Fertilitetsundersøgelse er udført og en af grupperne musen (kontrol eller eksperimentel) producerer meget store kuld, anbefales det at homogenisere kuld størrelser, også kaldt nedslagtning, så de studerede kuld at have sammenlignelige størrelser.
Reproduktion kan kun blive vurderet i vivo på grund af flere organer involveret i reproduktionen (figur 1) og de omfattende feedbackmekanismer regulere reproduktive akse3. Visse aspekter af reproduktive kompetence kan evalueres hurtigt gennem en vaginal plugging assay, hvor kapaciteten af de mandlige at montere kvinden og efterlade en fysisk plug i skeden er observeret13,36. Selv om dette er en nyttig tilgang til at vurdere mandlige seksuelle adfærd, denne type af undersøgelse tillader ikke påvisning af mindre problemer i reproduktion, og heller ikke vurderer det vedligeholdes frugtbarhed i en lang periode af tid eller resulterende kuldstørrelse og forældrenes adfærd. Protokollen beskrevet her præsenterer talrige fordele over en plugging assay, større at være i stand til at identificere både mindre og større indvirkning på reproduktive kompetence i hanner og hunner (figur 4).
Fertiliteten falder med alderen, og desuden den kvindelige estrous cyklus bliver længere og uregelmæssige under aldring5,28. Det anbefales derfor at starte en Fertilitetsundersøgelse hos unge og seksuelt modne dyr. En typisk anvendte aldersgruppe til at oprette en Fertilitetsundersøgelse er 10-16 ugens i alder. Det er dog vigtigt at være fortrolig med de særlige reproduktive karakteristika af musen stamme anvendes i undersøgelsen, som store forskelle i reproduktion og seksuel modenhed mellem forskellige mus eller rotte stammer (figur 5B). Yderligere oplysninger om reproduktive egenskaber kan findes i JAX mus Phenome Database https://phenome.jax.org/. Udfører en længere (> 4 måned) Fertilitetsundersøgelse har fordelen at være i stand til at opdage tidlige reproduktive tilbagegang, hvor musene kan avle normalt for de første 1-2 måneder af fertilitet assay, men derefter har en tidlig tilbagegang i reproduktion begynder inden den 6 måneder i alder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har intet at videregive.
Acknowledgments
Tak til de forfattere, der bidrager til det indledende arbejde, som er grundlaget for denne offentliggørelse. Aitor Aguirre, Genevieve E. Ryan og Erica L. Schoeller for hjælp forberede håndskriftet. Tak til Jessica Sora Lee og Austin hage for teknisk bistand med håndskriftet. H.M.H. blev støttet af Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & menneskelig udvikling af National Institutes of Health under Award nummer R00HD084759.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Cotton Balls | Fisher | 22456885 | |
| Surface protector | Fisher | 1420637 | |
| Light meter | VWR | 21800-014 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Microscope Slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Optimouse rack with cages | AnimalCare systems | C89100 | |
| Water Bottle Basket | AnimalCare systems | C61011 | |
| Filtered Cage Tops | AnimalCare systems | C78210 | |
| Optimice Standard Feeder | AnimalCare systems | C40100SG | |
| Cage Card Holder | AnimalCare systems | C43251 | |
| Cage Cards | AnimalCare systems | M52010 | |
| Bottle Assambley | AnimalCare systems | C79122P | |
| Bed R'Nest Nesting | The Andersons | BRN4WSR | |
| 1/8" Corn Cob bedding | The Andersons | 8B | |
| Standard mouse chow | Teklad | 7904 (7004) | |
| Scale | VWR | 10205-004 | |
| Polypropylene Beaker | Fisher | 14-955-111F |
References
- Schneider, J. E.
- Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function. Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2012).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, (2016).
- Kauffman, A. S. Sexual differentiation and the Kiss1 system: Hormonal and developmental considerations. Peptides. , (2009).
- Bronson, F. H., Dagg, C. P., Snell, G. D. Reproduction. , Dover Publications, Inc. New York. (1966).
- Chehab, F. F., Mounzih, K., Lu, R., Lim, M. E. Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin. Science. , (1997).
- Yoshimura, S., Yamaguchi, H., Konno, K., Ohsawa, N., Noguchi, S., Chisaka, A. Observation of Preputial Separation is a Useful Tool for Evaluating Endocrine Active Chemicals. J Toxicologic Pathology. 18, 141-157 (2005).
- Ahima, R. S., Dushay, J., Flier, S. N., Prabakaran, D., Flier, J. S. Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice. Journal of Clinical Investigation. 99 (3), 391-395 (1997).
- Bohlen, T. M., et al. A short-day photoperiod delays the timing of puberty in female mice via changes in the kisspeptin system. Frontiers in Endocrinology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
- Shahab, M., Mastronardi, C., Seminara, S. B., Crowley, W. F., Ojeda, S. R., Plant, T. M. Increased hypothalamic GPR54 signaling: A potential mechanism for initiation of puberty in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2005).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, 5-9 (2016).
- Navarro, V. M., et al. Role of Neurokinin B in the Control of Female Puberty and Its Modulation by Metabolic Status. Journal of Neuroscience. 32 (7), 2388-2397 (2012).
- Hoffmann, H. M., Tamrazian, A., Xie, H., Pérez-Millán, M. I., Kauffman, A. S., Mellon, P. L. Heterozygous deletion of ventral anterior homeobox (Vax1) causes subfertility in mice. Endocrinology. 155 (10), 4043-4053 (2014).
- Kauffman, A. S., et al. The Kisspeptin Receptor GPR54 Is Required for Sexual Differentiation of the Brain and Behavior. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8826-8835 (2007).
- Teles, M. G., et al. Brief report: A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty. New England Journal of Medicine. , (2008).
- Korenbrot, C. C., Huhtaniemi, I. T., Weiner, R. I. Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biology of reproduction. , (1977).
- Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: The puberty ovarian maturation score (Pub-Score). Scientific Reports. 7 (March), 1-11 (2017).
- Caligioni, C. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , 1-11 (2010).
- Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor -signaling in kisspeptin neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22693-22698 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. (67), 4-9 (2012).
- Hedrich, H. The Laboratory Mouse. , Academic Press. (2012).
- Hoffmann, H. M., Trang, C., Gong, P., Kimura, I., Pandolfi, E. C., Mellon, P. L. Deletion of Vax1 from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Abolishes GnRH Expression and Leads to Hypogonadism and Infertility. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3506-3518 (2016).
- Sloboda, D. M., Howie, G. J., Pleasants, A., Gluckman, P. D., Vickers, M. H. Pre- and postnatal nutritional histories influence reproductive maturation and ovarian function in the rat. PLoS ONE. , (2009).
- Manual, R. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. Management. , (2007).
- Kennedy, G. C., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. The Journal of Physiology. , (1963).
- Sisk, C. L., Foster, D. L. The neural basis of puberty and adolescence. Nature Neuroscience. 7 (10), 1040-1047 (2004).
- Nelson, J. F., Karelus, K., Felicio, L. S., Johnson, T. E. Genetic influences on the timing of puberty in mice. Biology of reproduction. , (1990).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. , (1982).
- Falconer, D. S. Weight and age at puberty in female and male mice of strains selected for large and small body size. Genetical Research. , (1984).
- Rodriguez, I., Araki, K., Khatib, K., Martinou, J. C., Vassalli, P. Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of Bcl2. Developmental Biology. , (1997).
- Lomniczi, A., Wright, H., Ojeda, S. R. Epigenetic regulation of female puberty. Frontiers in Neuroendocrinology. 36, 90-107 (2015).
- Selmanoff, M. K., Goldman, B. D., Ginsburg, B. E. Developmental changes in serum luteinizing hormone, follicle stimulating hormone and androgen levels in males of two inbred mouse strains. Endocrinology. 100 (1), 122-127 (1977).
- Larder, R., Clark, D. D., Miller, N. L. G., Mellon, P. L. Hypothalamic Dysregulation and Infertility in Mice Lacking the Homeodomain Protein Six6. Journal of Neuroscience. 31 (2), 426-438 (2011).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number. Comparative Biochemistry and Physiology -- Part A: Physiology. 84 (1), 127-133 (1986).
- Chahoud, I., Paumgartten, F. J. R. Influence of litter size on the postnatal growth of rat pups: is there a rationale for litter-size standardization in toxicity studies. Environmental research. 109 (8), 1021-1027 (2009).
- Pandolfi, E. C., Hoffmann, H. M., Schoeller, E. L., Gorman, M. R., Mellon, P. L. Haploinsufficiency of SIX3 Abolishes Male Reproductive Behavior Through Disrupted Olfactory Development, and Impairs Female Fertility Through Disrupted GnRH Neuron Migration. Molecular Neurobiology. , (2018).
