Summary
많은 치료 및 유전자 변이 성적 성숙과 다 산의 타이밍에 영향을. 이 프로토콜 pubertal 발병 쥐 및 쥐에 성적으로 성숙한 동물 불 임 연구를 설정 하는 이전에 평가 하는 비-침략 적 방법을 설명 합니다.
Abstract
생식 능력의 평가 치료 또는 또한 불린 hypothalamic-뇌 하 수 체-gonadal 축 생식 축에 유전자 조작의 영향을 이해 하는 데 중요 하다. 생식 축 다 산 재생산에 유리한 조건에 적응 하는 환경 및 내부 입력의 주요 통합 이다. 쥐 및 쥐에 불 임 연구에 착수, 이전 성적 성숙 평가 제외 가능성 관찰된 생식 고기에 의해 발생 하는 지연 또는 pubertal 발병 결 석. 이 프로토콜 pubertal 발병 preputial 분리의 결정을 통해 남성 및 질 및 첫 발 정기를 통해 여성을 평가 하는 비-침략 적 접근 방식을 설명 합니다. 사춘기의 성적 성숙의 공적 및 확인 후 불 임 연구를 시작할 수 있습니다. 절차는 쥐와 쥐, 불 임 연구를 설정 하는 방법 및 어떤 매개 변수를 평가 하 고 치료 또는 유전자 삭제 다 산에의 영향을에 있는지 확인에 대 한 최적의 번 식 조건을 설명 합니다.
Introduction
사춘기를 통해 전환 성적 성숙 및 생식 능력을 달성 하기 위해 필요 합니다. Pubertal 전환 및 성인에서 비 옥의 정비 hypothalamic-뇌 하 수 체-gonadal 축 (그림 1) 불리는 생식 축에 의해 통제 된다. Pubertal 개시의 타이밍 및 비 옥의 정비 단단히 자손과 부모1,2의 생존의 기회를 높이기 위해 내부 뿐만 아니라 환경 요인에 의해 통제 된다. 이 프로토콜에는 생쥐와 쥐 생식 능력을 평가 하는 불 임 연구를 설정 하기 전에 성적 성숙 확인 pubertal 발병을 확인 하는 비-침략 적 접근 방식을 제공 합니다.
불 임 연구는 성적으로 성숙한 동물에서 수행 되 고 동물 사춘기를 통해 간 후에 시작 될 수 있다. Pubertal 발병 전에 생식 축, 이며 사춘기 (그림 1)를 시작에 부족 금액에 뇌 하 수 체에 성적인 성숙, 생식 샘 자극 호르몬-방출 호르몬 (GnRH)의의 핵심 드라이버 릴리스입니다. Pubertal 발병 증가 GnRH 릴리스 중간 예 하에서 발생 하는 복잡 한 프로세스입니다. GnRH 황 호르몬 (LH)과 여 포 자극 호르몬 (FSH) 분 비 뇌 하 수 체에서 2 개의 호르몬 gonadal 성숙 및 생식 기능 (그림 1)3,,45 에 대 한 필수적인 촉진 .
생식 축에 모욕 감소 다 산 되며 또한 사전 또는 지연 pubertal 발병 할 수 있다. Pubertal 발병과 생식 능력의 타이밍에 영향을 알려진 조건 포함 화학6,7, 증가/감소 몸 무게1,8에 변화를 방해 하는 내 분 비에 노출 날 길이2,9 그리고 유전자 변이10,11,12,13,,1415.
성적인 성숙의 개시 다 산 분석 결과를 설정 하기 전에 완료 해야 할 중요 한 단계 이다. Preputial 분리, 질 및 첫 발 정기를 통해 pubertal 개시 결정의 장점은 이러한 절차의 비-침략 적 특성으로 혈액 또는 동물16, 의 희생을 요구 하지 않기 17.
Pubertal 개시 결정 후 불 임 연구를 제대로 설정 생식 축의 무결성에 대 한 중요 한 정보를 제공 합니다 있으며 일반적으로 생성 하는 추가 연구 (수정)에 대 한 실험 동물의 두 번째 장점은 18.이 프로토콜에서 설명 하는 불 임 연구 설치 남성과 여성 생식 능력에서 미성년자와 주요 적자를 검색할 수 있습니다. 키 매개 변수 계산 포함 1) 첫 번째 쓰레기, 2) 주어진된 시간 프레임 및 3) 담가 크기에서 생성 하는 새끼의 수를 시간. 마지막으로, 후속 불 임 장애의 원인을 파악 하기 위해 실시 수 있는 연구의 유형에 대 한 권장 사항이 포함 되어 있습니다.
유전자 변형 쥐에 일을 반영 하는 대표적인 데이터 및 설명된 프로토콜 마우스를 말합니다. 그러나, 모든 포함된 프로토콜은 쥐에서 동등 하 게 유효 합니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드를 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 미시간 주립 대학에 의해 승인 하 고 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 실시 되었습니다.
1. 확인할 Pubertal 발병
- 의류, 최소한 기관 지침에 따라, 그것은 깨끗 한 실험실 외 투 및 깨끗 한 장갑을 착용 하는 데 필요한. 항상 깨끗 한 장갑을 착용 하는 마우스를 처리 합니다.
- 테이블에 패드를 배치 하 여 작업 영역을 준비 합니다.
- 패드를 위쪽으로 향하게 하는 그리드와 깨끗 한 마우스 케이지 상단을 놓습니다.
- 작업 영역에서 규모를 설정 합니다. 규모와 자체에 깨끗 한 500-1000 mL 비 커를 배치 합니다.
- 기록의 몸 무게와 preputial 분리, 질 또는 첫 번째 발 정기 작업 영역 옆에 있는 시트를 놓습니다.
- 연구에 대 한 마우스를 식별 합니다. 사춘기에 도달할 때까지 pubertal 발병에 대 한 일상적인 검사를 수행 합니다. 연구를 통해 하루 중 같은 시간에 검사를 수행 합니다. 그러나 Pubertal 발병 빠르면 생 후 11-12 일19, 발생할 수 있습니다, 가장 실험적인 셋업에서 pubertal 발병 모니터링 시작 ~ 22 일.
- 작업 영역 (단계 1.2)에 마우스 케이지를 놓습니다. 새 장을 열고 테이블에 뚜껑, 물병, 음식 홀더를 배치 합니다.
- 남성 쥐에서 preputial 분리 결정.
- 마우스 꼬리를 잡고 있는 동안 단계의 1.2.1 깨끗 한 마우스 케이지 위에 놓습니다. 부드럽게 꼬리에 잡고, 마우스 ~ 5에 대 한 감 금 소의 그리드를 탐험 하자 s.
- 살짝 꼬리를 뒤로; 당겨 일반적으로 그것의 앞 다리와 눈금 들고 앞으로 이동 하는 동물 발생 합니다. 피부에 접근 다른 손으로 목과 귀를 닫습니다.
- 어깨와 목 엄지와 집게손가락 사이 느슨한 피부를 파악. 그것은 피부, 좋은 잡아 중요 하다 마우스 무의 머리 주위를 선회에서 되지 것입니다.
- 나머지 손가락으로 뒤에 피부를 잡아을 눌러 손에 대 한. 호흡, 혈액 흐름, 또는 손상 뼈, 근육 또는 피부를 방해 하지 않고 단단히 잡으십시오. 손의 손바닥 안에서 마우스의 뒷면을 지 원하는 하는 동안 마우스의 배꼽 노출 손을 설정 합니다.
- 자유 손으로 가볍게 눌러 다시 음 경 주위 피부를 강요 하지 않고. Preputial 분리에서 preputial 피부 슬라이드 뒤로 노출 귀 두 남 근 (그림 2A, 화살표 preputial 분리를 보여주는). Preputial 분리의 유무를 기록 합니다.
- 부드럽게 단계 1.2.2에서에서 500-1000 mL 비 커에 그것을 배치 하 여 마우스 무게 고 무게를 기록 합니다.
- 케이지 바닥에 비 커 0-2 cm를 개최 하 여 주택 장에 마우스를 다시 하 고 천천히 마우스를 허용 하는 비 커를 자체적으로 종료 팁. 물과 순 한 세제로 비 커를 깨끗 하 고 규모에 그것을 반환 하 고 규모를 taring 하기 전에 그것을 건조.
- 여성 쥐에 질 구는 결정.
- 작업 영역 (단계 1.2)에 목화 공, 비 커와 메 마른 물 한 병을 놓습니다. 비 커에 물을 붓으십시오. 메 마른 물으로 목화 공을 축이다를 단계 1.2.1에서에서 케이지 상단 옆 넣습니다.
- 마우스 케이지를 작업 영역 (단계 1.2)에 놓고 꼬리의 기지에서 개최 하 여 케이지 상단 (1.2.1 단계)에 자사의 홈 장에서 마우스를 전송 합니다. 부드럽게 마우스의 앞으로 움직임을 장려 하기 위해 꼬리를 뒤로 잡아 당기십시오.
- 무료 손가락으로 엉덩이 지원 하면서 꼬리를 들어올립니다. 케이지의 상단와 접촉을 유지 하기 위해 hindlimbs를 허용 한다. 마우스를 너무 많이 이동, 단계 1.5.1-1.5.4에 설명 된 대로 손에 잡으십시오.
- 부드럽게 단계 1.6.1에서에서 물 습도 목화 공을 외 음부를 청소. 각 마우스에 대 한 깨끗 한 습도 면봉을 사용 합니다. 결정 질, 외 음부 검사 및 질은 완전히 오픈 여부 확인 (그림 2A, 여성 질 개통).
- 질 발생 한 경우 기록 합니다. 마우스 무게 고 단계 1.5.6-1.5.7에 설명 된 대로 홈 케이지를 반환 합니다.
- 첫 번째 발 정기 첫 배 란의 지표로
- 작업 영역 (단계 1.2)에 살 균 물, 레이블이 지정 된 유리 슬라이드와 깨끗 한 팁 200 µ L 피펫으로 비 커를 배치 합니다.
- 1.6.2-1.6.3 단계에에서 설명 된 대로 여성을 잡아. 질에 살 균 물 ~ 50 µ L을 포함 하는 피 펫의 끝을 놓습니다.
- 부드럽게 소개 하 고 reabsorbing ~ 50 µ L의 물 2-4 회 하 여 질 벽에서 세포를 플러시. 레이블이 지정 된 유리 현미경 슬라이드에 피 펫 팁에서 콘텐츠 얼룩.
- 똑똑히 관찰 하는 10 배 또는 20 X 목표를 사용 하 여 명시 야 현미경에 세포 형태학 또는 얼룩 airdry ~ 1 h 시키고 다음 0.1% 메 틸 렌 블루 솔루션 (ddH2O에에서 용 해)와 counterstain (그림 2B). Counterstain를 위한 0.1% 메 틸 렌 블루 솔루션으로 말린된 슬라이드 찍어 ~ 30 s. 슬라이드 어 1 h 동안 건조 하자.
- 10 X 20 X에서 밝은 분야 현미경에 1.7.4 단계에서 슬라이드를 확인 합니다. Estrous 주기 (그림 2B)의 4 가지 단계를 구분할 수 있는 세포 형태를 관찰 하 여 estrous 주기 (그림 2B)20 의 단계를 설정 합니다.
참고: Metestrus 백혈구와 nucleated 상피 세포, 그리고 cornified 상피 세포 (그림 2B)에 의해 발 정기의 혼합물에 의해 cornified 편평 상피 세포와 백혈구, 백혈구에 의해 diestrus, proestrus의 혼합물에 의해 특징입니다. 20. - 몸 무게를 기록 하 고 단계 1.5.6-1.5.7에 설명 된 대로 그것의 가정 케이지를 마우스를 반환 합니다. 얼룩 질 날 때 마우스는 그것의 첫 번째 발 정기 (그림 2B)에 종료 됩니다.
2입니다. 바람직한 사육 실 조건
- 사육 실 ~ 20-24의 온도 ° C, 습도 55 ± 10%, 그리고 균질 성 방 ~ 300-400의 강도의 빛 럭21바닥 위에서 약 1 m. 이 빛의 강도를 25-80 럭 스의 바람직한 중간 케이지 광도를 수 있습니다. 빛의 강도 테스트 하려면 빛 미터를 사용 합니다.
- 실험을 통해 조명의 적절 한 타이밍을 위해 사육 방에 조명을 제어 하는 자동된 시스템을 사용 합니다. 빛과 10 h 어둠 (LD14:10)2114 h "여름 같은" 조건에 12 h 하루 (12 h 빛과 12 h 어둠, LD12:12)에서 설치류 범위에서 다 산을 평가 하기 위해 최적의 날 길이 조건.
- 사육 케이지를 준비 합니다.
- 뚜껑, 물, 음식, 침구 및 번 식 쌍 당 중첩 깨끗 한 마우스 케이지를 준비 합니다.
- 섹스를 포함 하 여 모든 필요한 정보를 케이지 카드 작성의 출생, 마우스, 긴장과 때 짝짓기 설정 날짜 날짜.
3. 불 임 연구
- 불 임 연구에 사용 될 동물을 식별 합니다. 동물 성적 성숙 (1 단계) 인지 확인 합니다. 마우스에 있는 불 임 연구를 설정 하려면 일반적으로 사용 되 나이 범위는 연령, 어디 성적 성숙 완료 된 가장 실험 조건에 나이 10-16 주.
- 깨끗 한 테이블에서 단계 2.3에서 준비 사육 케이지를 놓습니다.
- 캐치 마우스를 누르고 있습니다.
- 천천히 마우스 케이지에 gloved 손을 소개 합니다. 마우스의 장갑과 손 냄새에 적응을 허용 (~ 5-30 s), 시간의 짧은 기간에 대 한 감 금 소에 손을 두십시오. 바쁜와 육 포의 움직임을 피하십시오.
- 감 금 소의 바닥에 가까운 cupped 손에 낮은 고 천천히 쥐에 접근. 그들은 도망 됩니다. 그들은 손을 통해 실행, 엄지와 검지 손가락 사이 한 마우스의 꼬리를 함정.
- 2-3에 대 한 꼬리에 의해 마우스를 들어올립니다. 마우스를 더 이상 개최 하는 경우 꼬리를 지키고 고 꼬리에 보류를 유지 cupped 손에 마우스를 놓습니다.
- 1 남자 및 그 후 여성 1 번 식으로 꼬리 (단계 3.3)으로 유지 함으로써 전송. 다 산 분석 결과를 설정할 때 암컷 같은 estrous 단계 인지 확인 합니다. 1.7 단계에에서 설명 된 대로 질 세 포진 검사를 수행 하 여 여성의 estrous 단계를 결정 합니다.
- 케이지, 닫고 쥐 음식, 물, 중첩 물자를 갖도록 합니다. 케이지 카드 케이지 케이지 카드 홀더를 연결 합니다.
- 주택 선반에 사육 케이지를 놓습니다. 다 산 연구의 전체 기간 동안 사육 케이지를 최대한 그대로 두고. 30 일 동안 불 임 연구를 실시 합니다. 각 breeding 쌍에 대 한 자세한 기록을 유지 하 고 1) 짝짓기를 설정 날짜, 2) 새끼 태어난 날짜 및 3) 새끼, 죽은 및 라이브 새끼를 포함 하 여 수 합니다. 연구를 통해 매일 쓰레기 검사를 수행 합니다.
- 다 산 연장 30-60 일 더 없는 경우 또는 다 산에 약한 영향에 대 한 연구 단계 3.6에서 설정 됩니다.
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Representative Results
발표 결과 녹음 방송 요인 복 부 앞쪽 homeobox 1 (Vax1) 여기 라고도 heterozygote 쥐 (HET)13또는 Vax1 1 개의 대립 유전자에 몸 전체에서 삭제 된 두 개의 서로 다른 유전자 변형 마우스 모델에서 조건에 따라 GnRH 신경 세포22, 여기 조건부 코 (cKO)를 되 나 이내 삭제 되었습니다. 불 임 연구를 설정 하기 전에 모든 쥐에 pubertal 발병을 확인 하는 것이 중요입니다.
첫째, 하루와 질 및 preputial 분리에 무게는 설치 되었다. HET 마우스 질 및 preputial 분리 동일한 나이 및 무게 컨트롤 마우스에서 발생 (그림 3A 와 F, 각각). 반면, 질 preputial 분리 크게 cKO 여성 및 남성에 지연 그리고 bodyweight 증가와 관련 된 (그림 3B 와 G, 각각). Pubertal 발병 몸 무게와 관련 된 어느 정도 이며 이것은 특히 여성23에. 질 지연 preputial 분리 된 체중 증가 지연 연관 인지 확인, 질 및 preputial 분리 컨트롤 (4.5 주 세)의 평균 나이에 몸 무게 남성에서 cKO의 몸 무게에 비해 그리고 나이의 4.5 주 여성입니다. 4.5 주 나이, 여성 컨트롤 cKO 했다 유사한 몸 무게 (그림 3C), 반면 cKO 남성 컨트롤 (그림 3 H) 보다 약간 더 무 겁 했다. 이 질에 지연과 cKO preputial 분리 체중 증가 지연와 연결 되지 않은 나타냅니다.
질은 성적 성숙 및 첫 번째 발 정기 첫 배 란 발생 한 지표로 사춘기17의 완료의 감 적의 조기 표식. HET 및 cKO 여성 컨트롤과 같은 연령과 체중에 첫 발 정기 도달 확인 하 질 얼룩은 첫 발 정기 (그림 3E 및 3D)까지 질 개통의 일에서 매일 수행 했다. 노 한 마우스에 첫 발 정기와 첫 발 정기에 무게 컨트롤과 HETs (그림 3D) 사이 비교 했다. 대조적으로, cKO estrous 사이클을 통해 진행 하지 않았다 고 80 일 (그림 3E)의 나이에 첫 발 정기를 없 었 어 요. 이 지연 때문에 감소 된 몸 무게 (그림 3E) 아니었다.
확인 pubertal 발병 한 쥐 불 임 연구를 설정에 사용 되었다. 다 산 분석 결과 12 h 빛과 유전자 변형 마우스 C57BL/6J 유전 배경에에서 12 h 어두운 조건 (LD12:12)에 세워졌다. 쥐 실험의 시작에 10-16 주 세 했다. 쥐의 4 개의 그룹 공부 했다: matings (WTxWT) 제어, 한 여성 (WTxHET), WT 여성 (HETxWT)와 함께 한 남성와 한 여성 (HETxHET)와 함께 한 남성 남성을 제어. 첫째, 3 개월에 생성 하는 새끼의 수는 결정 되었다. 제어 matings (WTxWT) 생성 2.8 새끼의 평균 3 개월에 제어 여성 (HETxWT 짝짓기, 그림 4A)와 결합 한 남성에 비해 했다. 한 여성, WT 남성 (제어), 또는 남성, HET와 결합 여부 생성 현저 하 게 몇몇 새끼 3 개월 불 임 연구에서 한 여성 subfertile13는 공개. 다 산 분석 결과 설정 전에 pubertal 발병 확인의 중요성을 설명 하기 위해 생식 능력 cKO 쥐, 남성 preputial 분리 (그림 3)를 지연 했다 및 여성에 그들의 첫번째 없에 평가 되었다 80-일 세 (그림 3E)의 발 정기. 불 임 연구 설정 > 남성 preputial 분리 후 1 주 및에서 여성에서 > 시대의 80 일. 70 일 불 임 연구 기간 동안 제어 matings 생성 2.2 새끼의 평균, 아무 새끼에서 생성 된 반면 여성 cKO WT 남성와 결합 또는 cKO 남성 보여주는 이러한 마우스 컨트롤 (WT) 여성 (그림 4B)와 결합 불 임5,22입니다.
더 나은 특징의 한 여성 불 임 형, 우리는 첫번째 담가 생성 하는 데 걸리는 일 수를 기록 했다. WTxWT matings WT 여자와 결합 한 남성을 비교 했다 (그림 4C), 22 일의 평균에 그들의 첫번째 담가 생성. 한 여성 WT 남성와 HETxHET matings (그림 4C)와 유사 했던 그들의 첫 번째 쓰레기 생산 58 일의 평균을 했다. 그러나 생성 한 암컷의 첫 번째 쓰레기 지연 매우 이기종 되었고, 표현 형의 반 penetrance subfertility HETxHET matings13에서에서 관찰을 한 남자의 기여를 제안 하는 HETxHET matings에 더 지연, .
담가 크기를 평가 배 란/주입 및 정자 생산에 대 한 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다. 처음 3 새끼의 평균 크기를 결정 했다. 흥미롭게도, 모든 조합 (WTxHET, HETxWT, HETxHET) 생산 컨트롤 (WTxWT, 그림 4D)에 비해 훨씬 작은 새끼 짝짓기, 둘 다 남성과 여성 한 마우스는 subfertile 보여주는.
그림 1: hypothalamic-뇌 하 수 체-gonadal 축 제어 성적 성숙 및. 생식 축의 정점에 있습니다 hypothalamic kisspeptin 신경 (노란색 원)과 생식 샘 자극 호르몬-방출 호르몬 (GnRH) 뉴런 (녹색 원). (Prepubertal) 청소년 기간에서는 kisspeptin 신경 GnRH 신경 세포에 작은 kisspeptin을 해제합니다. Pubertal 발병 후 GnRH 신경 세포에 kisspeptin 릴리스 (포스트 pubertal) 보강 합니다. 후반 청소년 기간에 증가 GnRH 릴리스 극적으로 황 호르몬 (LH) gonadal 성숙 및 생식 기능을 선도 하는 성인에서 뇌 하 수 체에서 호르몬 (FSH) 릴리스를 자극 하는 여 포가 증가 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 쥐에 있는 pubertal 발병의 결정. Pubertal 발병 쥐에의 한 외부 표식 (A) preputial 분리는 남성에서 여성에서 여 질 이다. 눈금 막대 = 1 cm. (B) 예를 들어 이미지 첫 발 정기를 결정 하는 데 사용 하는 질 게에서. 슬라이드 30 counterstained 했다 0.1% 메 틸 렌 블루, airdried와 s 20 X 배율에서 관찰 하 고. 검은 화살표 nucleated 상피 세포, 검은 윤곽선이 노란색 화살표 표시 백혈구 나타내고 흰색 화살표는 cornified 상피 세포를 표시 합니다. 첫 번째 발 정기 일 10 질 후에 발생 했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: pubertal 발병 연구에서 생성 될 수 있는 대표적인 데이터. (A, B) 질 고 질에서 유전자 변형 마우스 모델에 무게. (C) 제어 및 cKO 여성에서 4.5 주에 무게. (D, E) 나이 고 첫 발 정기에 무게. (F, G) 나이 고 preputial 분리에 무게. (H) 무게 4.5 주 제어 및 cKO 남성에서. 데이터 표현 수단 ± SEM. N = 그룹, 통계 분석 학생의 t 시험 당 5-10. p< 0.01; p< 0.001. 이러한 수치 이전 게시13,22에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 유전자 변형 쥐의 불 임 연구에서 대표적인 분석. (A) Vax1 HET 마우스 및 (B) cKO의 불 임 평가 처녀 10에 16-주 된 쥐에서 수행한 고 새끼의 수는 지정 된 시간 프레임에 기록. 데이터 나타냅니다 수단 ±를 SEM. 통계 분석 일방통행 ANOVA Dunnett의 여러 비교 테스트에 의해 다음에 의해 수행 됐다. * p< 0.05; p< 0.001. (C) 첫 번째 쓰레기 일 수 (n = 5-12), 그리고 첫번째 3 개의 새끼의 (D) 평균 담가 크기 (n = 10-13) 결정 했다. 데이터 표현 수단 ± SEM. 통계 분석 WT 비교 스튜던트 t 검정에 의해 수행 되었다 WT. x *p< 0.05; p< 0.01. 이러한 수치 이전 게시13,22에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 다 산 분석 결과 설정. (A) 번 식 체계 및 불 임 분석 결과에 필요한 동물의 제안된 수의 예. 와 같은 고 지방 규정식 불 임 남성과 여성 모두에서 평가 대 코 또는 제어 다이어트 대 컨트롤은 2 조건 연구에 필요한 동물의 총 수: 짝짓기 (1 남자 1 여자 x) 그룹 x 2 조건 x 2 성별 당 8 동물 x 당 2 마우스 s (둘 다 남성과 여성의 불 임 평가) = 연구 당 64 동물의 총. 남성과 여성의 불 임 연구를 동시에 완료 되 면 제어 matings x 컨트롤 집합이 모두 남성과 여성의 생식에 미치는 영향을 비교 하 일반적으로 사용할 수 있습니다. (B) 다 산 분석 결과 설정할 때 사용 하는 마우스 필요가 성적 성숙에 도달 했습니다. 쥐의 다른 긴장 다른 생식 특성 있고 다른 세24에 성적인 성숙을 도달. 에 대 한 내용은 쥐, 이전 게시25를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
쥐의 전반적인 복지21성공적인 불 임 분석 결과 대 한 중요 하다. 다 산 분석 결과 수행할 때 육체적으로 확인 하는 쥐에 매일이 스트레스를 일으킬 수로 중요 하다. 이들은 스트레스도 더 자주 케이지 변경을 하지 마십시오. 이상적으로 케이지 변화는 주당 1-2 회 더 이상 해질 것 이다. 어두운 단계 빛 노출 야행성 설치류에 번 식에 부정적인 영향을 미칩니다. 어두운 시간 동안 사육 방에 조명을 설정 하지 않습니다. 방에 항목 어두운 시간 동안 필요한 경우에, 희미 한 붉은 빛 조명을 사용 합니다. 또 다른 스트레스의 과도 한 냄새, 진동 또는 소음 연구의 일부 또는 전체에 대 한 물고기에 존재입니다. 스트레스를 완화 하 고 마우스 복지와 번 식을 개선 하기 위해, 소재 또는 다른 유형의 농축 중첩 마우스를 제공 합니다. 둥지 건물 마우스에서 중요 한 문제 이며 번 식 성공 증가. 둥지도 쥐를 숨기고 재생 장소를 수 있습니다. 잘 건강 하 고 잘 길 러 진 동물 품종, 따라서 그것은 높은 품질 음식과 물에 대 한 광고 libitum 액세스를 제공 하는 것이 중요. 번 식 쌍 (C57BL/6J에 자주) 피부염, 치과 malocclusion 등 다른 질병의 증상을 전시 하기 시작 하는 경우 연구에서이 마우스를 제외 합니다. 또한, 연구 immunodeficient 마우스에서 수행 되고있다, 마우스 룸 비 옥을 유지 하기 위해 깨끗 한 유지 하는 키입니다.
불 임 연구를 적절 하 게 설정 하려면 그것은 처녀 쥐에서 연구를 수행 됩니다 또는 입증 된 사육 뿐만으로 신중 하 게 선택 제어 matings에 사용 하는 마우스를 결정 하는 것이 중요. 제어 matings 실험 사육 병렬로 실행 해야 합니다. 알 수 없거나 예기치 않은 스트레스 요인으로 필수적 이며 환경 변화 번 식 속도에 변화를 일으킬 수 있습니다. 제어 matings 실험 쥐 (그림 5A) 쓰레기의 우선적으로 구성 됩니다. 이 때 특히 중요 한 번 식 특성 마우스 긴장 (그림 5B) 사이 훌륭한 변이 때문 혼합된 유전 배경으로 쥐에 다 산 연구.
Subfertility 형 식별 전하실 수 있습니다 추가 매개 변수를 분석 하는 연구의 장시간된 길이 때문에 그 원인을 공개 하. 대표적인 데이터 HET 마우스 겸손 subfertility 표현 형 (그림 4)의 좋은 예 이며 확장된 분석 남성 subfertility 식별 하는 데 필요한. 대표 결과 (그림 3 및 4)에 같이 (그림 3A, D및 F) 사춘기의 정상적인 개시 (그림 4A, C, D 둘 다 남성과 여성 subfertility 연결 될 수 있습니다. ). 이 경우에 마우스만 하위 비옥한 되었고 따라서 연구의 길이 120 일에 확장 되었다. 이것은 짧은 불 임 연구로 서 중요 하다 (예., 60 일) 표현 형을 밝힐 수 있게 되지 않았을 것 이다. 남성 subfertility 겸손, 그리고 처음 공개 때 한 남성 subfertile (그림 4A) 했다, 한 여자와 결합 했다. 실제로, 한 남성 subfertility 새끼 물려받은 (그림 4D)의 평균 크기를 평가할 때 확인 되었다. 후속 연구는 남성 subfertility 확인 그리고 운동 정자13~ 80% 감소 한 남성에서 가난한 정자의 품질.
때 pubertal 발병에 주요 지연 쥐에서 연구 수행 산과 pubertal 발병 (> 5 일), 조절 pubertal 발병26여러 요소를 고려 하는 것이 중요 하다. 비록 질 첫 번째 발 정기와 가장 자주 발생 수반 쥐, 쥐에 첫 발 정기는 질25,27후 ~ 10 일에 일반적으로 발생 합니다. 따라서, 질 및 첫 번째 발 정기 때 쥐와 쥐18,28일 설정 된 보장 하는 것이 좋습니다. Pubertal 발병 대사 상태와 여성 그리고 남성1,7,,929, 사소한 정도에 몸 무게에 연결 되며 같은, 치료 또는 유전자 변이 동물 성장 둔화 지연된 pubertal 발병에 일부 경우에 결과. 확인할 pubertal 발병 지연/발전 빠른/느린 성장에 연결 되어있을 수 있습니다, 그것이 pubertal 발병의 평가 중에 매일 쥐를 무게 중요 합니다. 그림 3B 와 C로 G 및 H에서 볼 있듯이, pubertal 발병 지연 감소 된 몸 무게와 관련 되었다 했지만 진정한 지연 gonadal 조직학 및 호르몬 순환에 의해 확인으로 pubertal 발병 레벨22. Pubertal 발병의 마커는 그 둘 다 종종 일어날 메커니즘으로 인해 시간이 지남에 따라 결국 이외의 preputial 분리 및 질을 사용 하 여의 주요 한계 중 하나는 생식 축18, 의 활동 증가 30 , 31 (그림 1). 이 예는 cKO 여성 (그림 3B)에서 지연된 질 오프닝입니다. 결코 cKO 여성 배 란22 (그림 3E)의 부재로 인해 비옥한 될. 실제로, 호르몬 수준, gonadal 조직학 cKO 쥐의 평가 연구 입증이 쥐 적 사춘기 완료 및 불 임22 (그림 4B) 했다 되었습니다. 이것은 외부 마커를 사용 하 여 확인할 pubertal 발병 하도 보여줍니다. 사춘기의 성적 성숙에 도달 완료 요구 증가 GnRH 릴리스 및 생식 축 (그림 1), 활성화 하 고 완전히 확인 성적 성숙 gonadal 형태와 순환 호르몬 수준의 평가 될 필요가 22 , 31. 남성, 남성 호르몬을 측정 하 고 정액 소포 크기와 고환 형태 및 정자의 품질에 뿐만 아니라 크기를 평가 확인할 것 이다 사춘기 달성된16,,2232이었다. 여성, 자 궁 및 난소 무게와 형태와 함께에서 황 체 호르몬과 에스트로겐 수준을 측정 하 사춘기17,19,,2233의 완료를 확인할 것 이다.
담가 크기 임신 기간과 pubertal 발병에 영향을 줄 수 있습니다. 대부분 마우스 긴장 18-22 일의 임신 기간을가지고. 그러나, 어머니는 큰 쓰레기를 기대 하 고, 경우 임신 기간은 경향이 감소34,35. 다른 한편으로, 어머니는 이전 쓰레기 간호는,이 임신 기간5의 연장선 상에 서에서 발생할 수 있습니다. 또한 큰 새끼에 새끼 pubertal 발병 지연 되는 경향이 있다. 이 발생은 그들의 성장에 의해1,9,,3435지연 약간 되 고. 불 임 연구를 수행 하는 경우 마우스 그룹 중 하나 (컨트롤 또는 실험) 매우 큰 새끼를 생산 하 고 균질 쓰레기 크기, 또한 불린 학살, 유사한 크기를가지고 공부 새끼를 수 있도록 하는 것이 좋습니다.
복제만 평가 vivo에서 복제 (그림 1)에 관련 된 여러 장기와 광범위 한 피드백 메커니즘 규제 생식 축3될 수 있습니다. 탑재 하는 여성 고 질에서 실제 플러그를 떠나 남자의 용량13,36관찰 질 plugging 분석 결과 통해 생식 능력의 특정 측면을 빠르게 평가할 수 있습니다. 비록 이것이 남성의 성적 행동을 평가 하는 유용한 접근, 연구의이 유형을 복제에서 사소한 문제의 탐지를 허용 하지 않습니다도 않습니다 그것 평가 시간 또는 결과 담가 크기와 부모의 행동의 긴 기간에 대 한 다 산을 유지. 여기에 설명 된 프로토콜 수많은 장점이 plugging 분석 결과, 주요 선물 되 고 미성년자와 주요 남성 및 여성 (그림 4) 생식 능력에 영향을 식별 하는 능력.
불 임, 나 이와 함께 감소 하 고 또한 여성 estrous 주기 동안에 된다 더 이상 하 고 불규칙 한 에이징5,28. 그것은 따라서 젊은 불 임 연구를 시작 하 고 동물을 성적으로 성숙 하는 것이 좋습니다. 불 임 연구를 설정 하려면 일반적으로 사용 되 나이 범위는 나이의 10-16 주. 그러나, 그것은 다른 마우스 또는 쥐 긴장 (그림 5B) 사이 재생산과 성적인 성숙에 주요 차이 존재는 연구에 사용 된 마우스 긴장의 특정 생식 특성을 잘 알고 있어야 하는 것이 중요. 잭 스 마우스 발형체 데이터베이스 https://phenome.jax.org/에 생식 특성에 대 한 추가 정보를 찾을 수 있습니다. 더 이상 수행 (> 4 달) 불 임 연구는 초기 생식 감소, 쥐 다 산 분석 결과의 첫 번째 1-2 개월에 대 한 일반적으로 번 식 수도 있지만 다음 재생 하기 전에 시작에 있는 초기 감소를 감지 할 수 있는 이점이 있다. 나이의 6 개월입니다.
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Disclosures
저자는 공개 상관이 있다.
Acknowledgments
이 게시의 기초는 초기 작업에 기여 하는 저자를 감사 합니다. Aitor 아구, 제네 비 브 중 라이언과 에리카 L. Schoeller 원고를 준비 하는 도움 원고와 기술 지원에 대 한 제시카 소라 리와 오스틴 턱에 감사. H.M.H. 유 니스 케네디 슈 라이버 국립 연구소의 아동 건강 및 보너스 번호 R00HD084759에서 건강의 국가 학회의 인간 발달에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Cotton Balls | Fisher | 22456885 | |
| Surface protector | Fisher | 1420637 | |
| Light meter | VWR | 21800-014 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Microscope Slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Optimouse rack with cages | AnimalCare systems | C89100 | |
| Water Bottle Basket | AnimalCare systems | C61011 | |
| Filtered Cage Tops | AnimalCare systems | C78210 | |
| Optimice Standard Feeder | AnimalCare systems | C40100SG | |
| Cage Card Holder | AnimalCare systems | C43251 | |
| Cage Cards | AnimalCare systems | M52010 | |
| Bottle Assambley | AnimalCare systems | C79122P | |
| Bed R'Nest Nesting | The Andersons | BRN4WSR | |
| 1/8" Corn Cob bedding | The Andersons | 8B | |
| Standard mouse chow | Teklad | 7904 (7004) | |
| Scale | VWR | 10205-004 | |
| Polypropylene Beaker | Fisher | 14-955-111F |
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