Summary
Molti trattamenti e mutazioni genetiche impatto i tempi della maturità sessuale e la fertilità. Questo protocollo descrive un metodo non invasivo per valutare l'Inizio puberale in topi e ratti prima della creazione di uno studio di fertilità negli animali sessualmente maturi.
Abstract
Valutazione della competenza riproduttiva è fondamentale per comprendere l'impatto di un trattamento o la manipolazione genetica sull'asse riproduttivo, anche definito l'asse ipotalamico-ipofisi-gonadi. L'asse riproduttivo è un integratore di chiave di input ambientali e interni, adattando la fertilità a condizioni favorevoli per la riproduzione. Prima di imbarcarsi su uno studio di fertilità nei topi e nei ratti, la maturità sessuale viene valutata per escludere la possibilità che i fenotipi osservati riproduttivi sono causati da ritardato o assente Inizio puberale. Questo protocollo descrive un approccio non invasivo per valutare Inizio puberale nei maschi attraverso la determinazione di separazione del prepuzio che nelle femmine attraverso l'apertura vaginale e primo estro. Dopo la conferma del completamento della pubertà e il raggiungimento della maturità sessuale, uno studio di fertilità può essere avviato. La procedura descrive le condizioni di allevamento ottimali per topi e ratti, come impostare uno studio di fertilità e i parametri da valutare e determinare se il trattamento o l'omissione del gene ha un impatto sulla fertilità.
Introduction
Per raggiungere la maturità sessuale e riproduttiva competenza è necessaria la transizione attraverso la pubertà. La transizione puberale e il mantenimento della fertilità in età adulta è regolata dall'asse riproduttivo, anche definito l'asse ipotalamico-ipofisi-gonadi (Figura 1). I tempi dell'Inizio puberale e mantenimento della fertilità è strettamente regolati da fattori interni, nonché dell'ambiente per aumentare le probabilità di sopravvivenza della prole e genitori1,2. Questo protocollo fornisce un approccio non invasivo per determinare l'Inizio puberale in topi e ratti per confermare la maturità sessuale prima della creazione di uno studio di fertilità per valutare la competenza riproduttiva.
Uno studio di fertilità viene eseguito negli animali sessualmente maturi e può essere avviato dopo che gli animali sono passati attraverso la pubertà. Prima dell'Inizio puberale, l'asse riproduttivo è quiescente, e il driver della chiave di maturazione sessuale, gonadotropina - releasing hormone (GnRH), viene rilasciato sulla ghiandola pituitaria in quantità insufficiente per iniziare la pubertà (Figura 1). Inizio puberale è un processo complesso che si traduce in un aumentato rilascio di GnRH presso l'eminenza mediana. GnRH promuove l'ormone luteinizzante (LH) e follicolo-stimolante secrezione dell'ormone (FSH) dall'ipofisi, due ormoni essenziali per maturazione gonadica e funzione riproduttiva (Figura 1)3,4,5 .
Insulti all'asse riproduttivo provocare ridotta fertilità e possono anche Inizio puberale di anticipo o ritardo. Condizioni note per influenzare la tempistica dell'Inizio puberale e competenza riproduttiva includono l'esposizione a sostanze chimiche6,7, aumentata/diminuita corpo peso1,8, cambiamenti nel sistema endocrino giorno lunghezza2,9 e mutazioni genetiche10,11,12,13,14,15.
L'inizio della maturità sessuale è un passo fondamentale che deve essere completato prima della creazione di un test di fertilità. I vantaggi della determinazione Inizio puberale attraverso la separazione del prepuzio, apertura vaginale e primo estro, sono le caratteristiche non-invasiva di queste procedure, in quanto non necessitano di raccolta del sangue o sacrificio dell' animale16, 17.
Dopo Inizio puberale è determinato, impostare correttamente da uno studio di fertilità fornirà importanti informazioni circa l'integrità dell'asse riproduttivo e di solito ha il secondo vantaggio di generare animali da esperimento per ulteriori studi (perfezionamento) 18. l'installazione di studio di fertilità descritto nel presente protocollo in grado di rilevare i deficit maggiori e minori in termini di competenza riproduttivo nei maschi e nelle femmine. Principali parametri valutati comprendono 1) tempo per la prima cucciolata, 2) numero di cucciolate generate in un determinato lasso di tempo e 3) lettiera le dimensioni. Infine, consigli per il tipo di follow-up studi che possono essere condotti per identificare la causa della compromissione della fertilità sono inclusi.
Il protocollo descritto si riferisce ai topi e i dati rappresentativi riflettono il lavoro svolto in topi transgenici. Tuttavia, tutti i protocolli inclusi sono ugualmente validi in ratti.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato della Michigan State University e condotti in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
1. determinare Inizio puberale
- Seguire le linee guida istituzionali per l'abbigliamento, come minimo, è necessario indossare un camice da laboratorio pulito e guanti puliti. Maneggiare sempre topi indossando guanti puliti.
- Preparare l'area di lavoro posizionando un pad sul tavolo.
- Posizionare un top di gabbia pulita del mouse con la griglia rivolta verso l'alto sul pad.
- Impostare una scala nell'area di lavoro. Posizionare un bicchiere pulito 500 – 1000 mL sulla scala e Tara.
- Collocare un foglio accanto all'area di lavoro per peso corporeo record e separazione del prepuzio, apertura vaginale o primo estro.
- Identificare i topi per lo studio. Eseguire ispezioni giornaliere per Inizio puberale fino al raggiungimento della pubertà. Eseguire l'ispezione allo stesso tempo del giorno in tutto lo studio. Inizio puberale può accadere più presto postnatale giorno 11-1219, tuttavia, nelle configurazioni più sperimentale, monitoraggio di Inizio puberale inizia alle ~ 22 giorni.
- Posizionare la gabbia del mouse nell'area di lavoro (punto 1.2). Aprire la gabbia e mettere il coperchio, bottiglia d'acqua e titolare di cibo sul tavolo.
- Determinazione della separazione del prepuzio in di topo maschio.
- Tenendo premuto il mouse per la coda, posizionarlo sulla parte superiore della gabbia di mouse pulito dal punto 1.2.1. Tenendo delicatamente sulla coda, lasciare che il mouse Esplora la griglia della parte superiore della gabbia per ~ 5 s.
- Tirare delicatamente la coda indietro; Questo provoca solitamente l'animale muovendo in avanti tenendo la griglia con le zampe anteriori. Approccio l'altra mano alla pelle nelle vicinanze il collo e le orecchie.
- Afferrare la pelle flaccida tra le spalle e il collo con il pollice e l'indice. È importante ottenere una buona tenuta della pelle, come il mouse impedirà di girare la testa intorno a mordere.
- Afferrare la pelle sul retro con le barrette restanti e tenerlo premendo contro la mano. Tenere saldamente senza ostruire la respirazione, sangue flusso, o danneggiare le ossa, muscoli o pelle. Girare la mano per esporre la pancia del mouse, pur sostenendo il retro del mouse all'interno del palmo della mano.
- Con la mano libera, spingere delicatamente indietro la pelle intorno al pene senza forzare. Alla separazione del prepuzio, la pelle preputial scivola indietro esponendo il pene di glans (Figura 2A, freccia che indica la separazione del prepuzio). Registrare la presenza o l'assenza di separazione del prepuzio.
- Pesare il mouse posizionando delicatamente nel becher 500-1000 mL dal punto 1.2.2 e registrare il peso.
- Reintrodurre il mouse nella gabbia alloggiamento tenendo il bicchiere 0-2 cm sopra il pavimento della gabbia e rovesciarsi lentamente il becher permettendo il mouse per uscire da sola. Pulire il becher con acqua e detergente delicato e asciugarlo prima di restituirlo alla scala e tarare la bilancia.
- Determinare l'apertura vaginale nei topi femmina.
- Posto un batuffolo di cotone, bicchiere e una bottiglia di acqua sterile nell'area di lavoro (punto 1.2). Versare l'acqua nel contenitore. Umidificare il batuffolo di cotone con acqua sterile e posizionarlo accanto alla parte superiore della gabbia dal punto 1.2.1.
- Posizionare la gabbia del mouse nell'area di lavoro (punto 1.2) e trasferire il mouse dalla sua gabbia a casa fino alla cima della gabbia (punto 1.2.1) tenendolo alla base della coda. Tirare delicatamente indietro la coda per favorire un movimento in avanti del mouse.
- Sollevare la coda, sostenendo i fianchi con le dita gratuite. Consentire le zampe posteriori mantenere il contatto con la parte superiore della gabbia. Se il mouse si muove troppo, tenerlo in mano come descritto nella procedura 1.5.1-1.5.4.
- Pulire delicatamente la vulva con il batuffolo di cotone umidificata acqua dal punto 1.6.1. Usare un batuffolo di cotone pulito umidificato per ogni mouse. Per determinare l'apertura vaginale, esaminare la vulva e determinare se la vagina è completamente aperta (Figura 2A, apertura vaginale femmina).
- Record se si è verificato l'apertura vaginale. Pesare il mouse e ritornare alla gabbia a casa, come descritto nella procedura 1.5.6-1.5.7.
- Primo estro un indicatore di ovulazione prima.
- Porre un becher con acqua sterile, una lastra di vetro con etichetta e una pipetta 200 µ l con una punta pulita nell'area di lavoro (punto 1.2).
- Tenere la femmina come descritto nel passo 1.6.2-1.6.3. Posizionare la punta della pipetta contenente ~ 50 µ l di acqua sterile all'apertura vaginale.
- Lavare delicatamente le cellule dalla parete vaginale introducendo e riassorbire ~ 50 µ l di acqua 2 - 4 volte. Spalmare il contenuto dalla punta della pipetta su un vetrino per microscopio con etichetta.
- Osservare attentamente la morfologia cellulare su un microscopio a campo chiaro utilizzando un 10 X o 20 X obiettivo o lasciare che il airdry striscio per ~ 1 h e poi colorante di contrasto con una soluzione di blu di metilene di 0,1% (disciolta in ddH2O) (Figura 2B). Per colorante di contrasto, immergere la diapositiva secca nella soluzione 0,1% di blu di metilene per ~ 30 s. Lasciare asciugare per 1 h l'aria di diapositiva.
- Osservare le diapositive dal punto 1.7.4 su un microscopio a campo chiaro a 10x o 20x. Stabilire la fase del ciclo estrale (Figura 2B)20 osservando la morfologia delle cellule, che permette di distinguere le quattro fasi distinte del ciclo estrale (Figura 2B).
Nota: Il Metaestro è caratterizzato da una miscela di cellule epiteliali squamose cornified e leucociti, diestro dai leucociti, proestro da una miscela di leucociti e cellule epiteliali nucleate ed estro di cellule epiteliali cornified (Figura 2B) 20. - Registrare il peso corporeo e tornare il mouse alla sua gabbia a casa, come descritto nella procedura 1.5.6-1.5.7. Gli strisci vaginali sono terminati il giorno quando il mouse ha il suo primo estro (Figura 2B).
2. auspicabile camera condizioni di allevamento
- Assicurarsi che la camera di allevamento ha una temperatura di ~ 20-24 ° C, con 55 ± 10% di umidità e omogeneo in camera luce di un'intensità di ~ 300-400 lux circa 1 m di sopra del piano21. Questa intensità luminosa consente l'intensità della luce metà gabbia desiderabile di 25-80 lux. Per testare l'intensità della luce, utilizzare un misuratore di luce.
- Utilizzare un sistema automatizzato per controllare l'illuminazione della camera di allevamento per garantire adeguata temporizzazione dell'illuminazione in tutto l'esperimento. Condizioni ottimali di lunghezza del giorno per valutare la fertilità nella gamma di roditori da una giornata di 12 ore (12h luce e buio di 12 h, LD12:12), alle condizioni di "estate-like" con 14 h di luce e 10 h tenebre (LD14:10)21.
- Preparare le gabbie di allevamento.
- Preparare una gabbia pulita del mouse con coperchio, acqua, cibo, biancheria da letto e nidificazione per coppia di allevamento.
- Compilare le schede di gabbia con tutte le informazioni necessarie, compreso il sesso, data di nascita, razza del topo e la data quando l'accoppiamento è impostato.
3. studio di fertilità
- Identificare gli animali da utilizzare per lo studio di fertilità. Assicurarsi che gli animali siano sessualmente maturi (passaggio 1). Una fascia di età in genere usati per impostare uno studio di fertilità nei topi è di 10-16 settimane di età, un'età in cui la maturazione sessuale è stata completata in condizioni più sperimentali.
- Su un tavolo pulito, posizionare la gabbia di allevamento preparata al punto 2.3.
- Catturare e tenere premuto il mouse.
- Introdurre lentamente una mano guantata nella gabbia del mouse. Lasciare la mano nella gabbia per un breve periodo di tempo (~ 5-30 s), permettendo che i topi di adattarsi all'odore del guanto e della mano. Evitare movimenti a scatti e frenetici.
- Abbassare la mano a Coppa vicino al fondo della gabbia e lentamente si avvicinano ai topi. Corrono via. Quando corrono sopra la mano, intercettare la coda del uno mouse tra il pollice e il dito indice.
- Sollevare il mouse per la coda per 2-3 s. Se il mouse ha bisogno di essere tenuto più a lungo, tenere sulla coda e posizionare il mouse in mano a Coppa mantenendo la presa sulla coda.
- Trasferire 1 maschio e, successivamente, 1 femmina nella gabbia allevamento tenendoli per la coda (punto 3.3). Assicurarsi che le femmine siano nella stessa fase di estro, quando si configura il test di fertilità. Determinare la fase di estro delle femmine eseguendo uno striscio vaginale come descritto in passaggio 1.7.
- Chiudere la gabbia e assicurarsi che i topi hanno cibo, acqua e nidificazione materiale. Allegare il titolare della carta di gabbia con la scheda della gabbia della gabbia.
- Posizionare la gabbia di allevamento al ripiano di alloggiamento. Lascia la gabbia di allevamento come indisturbata come possibile per l'intera durata dello studio della fertilità. Condurre lo studio di fertilità per 30 giorni. Per ogni coppia di allevamento, conservare registri dettagliati e nota 1) la data che l'accoppiamento è impostato, 2) la data sono nate cucciolate e 3) il numero di cuccioli nati, compresi i cuccioli morti e dal vivo. Eseguire controlli di lettiera ogni giorno in tutto lo studio.
- Prolungare la fertilità Studio per altri 30-60 giorni se no o un debole impatto sulla fertilità è stabilito nel punto 3.6.
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Representative Results
I risultati presentati derivano da due modelli di topi transgenici differenti dove il fattore trascrizione anteriore ventrale homeobox 1 (Vax1) è stato eliminato in tutto il corpo su un allele, qui indicato come heterozygote topi (HET)13, o Vax1 è stato eliminato in modo condizionale all'interno di GnRH neuroni22, qui chiamato condizionale KO (cKO). Prima di impostare lo studio di fertilità, è importante confermare l'Inizio puberale in tutti i topi.
In primo luogo, sono stati stabiliti il giorno e il peso all'apertura vaginale e separazione del prepuzio. Nei topi HET, apertura vaginale e separazione del prepuzio si è verificato alla stessa età e peso come i topi di controllo (Figura 3A e F, rispettivamente). Al contrario, apertura vaginale e separazione del prepuzio erano significativamente in ritardo cKO femmine e maschi e associati con aumento di peso corporeo (Figura 3B e G, rispettivamente). Inizio puberale è in una certa misura associata con il peso corporeo, e questo è particolarmente vero in femmine23. Per determinare se il ritardo nell'apertura vaginale e separazione del prepuzio è stato associato con un ritardo nell'aumento di peso, il peso del corpo all'età media di apertura vaginale e separazione del prepuzio in controlli (4,5 settimane di età) è stato confrontato con il peso corporeo in cKO nei maschi e le femmine a 4,5 settimane dell'età. All'età 4,5 settimane, comandi femminili e cKO aveva peso corporeo paragonabile (Figura 3), mentre i maschi cKO erano leggermente più pesanti rispetto ai controlli (Figura 3 H). Questo indica che il ritardo nell'apertura vaginale e separazione del prepuzio in cKO non è associati con un ritardo nell'aumento di peso.
Apertura vaginale è un indicatore in anticipo di maturazione sessuale e primo estro un indicatore che si è verificato l'ovulazione prima, un indicatore di completamento della pubertà17. Per determinare se le femmine HET e cKO raggiunto primo estro alla stessa età e peso come controlli, gli strisci vaginali sono stati effettuati tutti i giorni dal giorno dell'apertura vaginale fino al primo estro (Figura 3E e 3D). Nei topi HET, primo estro e il peso al primo estro è stata paragonabile tra i controlli e HETs (Figura 3D). Al contrario, cKO non ha progredito attraverso il ciclo estrale e non ha avuto il primo estro all'età di 80 giorni (Figura 3E). Questo ritardo non era a causa del peso corporeo ridotto (Figura 3E).
I topi HET con Inizio puberale confermato sono stati utilizzati per impostare lo studio di fertilità. Il test di fertilità è stato istituito nel 12 h condizioni di luce e 12 h scuro (LD12:12) in topi transgenici su una priorità bassa genetica di C57BL/6J. I topi sono stati invecchiati 10-16 settimane all'inizio dell'esperimento. Quattro gruppi di topi sono stati studiati: controllare gli accoppiamenti (WTxWT), controllare i maschi con le femmine HET (WTxHET), HET maschi con femmine WT (HETxWT) e HET maschi con le femmine HET (HETxHET). In primo luogo, è stato determinato il numero di cucciolate generata in 3 mesi. Accoppiamenti di controllo (WTxWT) generata una media di 2,8 cucciolate in 3 mesi, che era comparabile ai maschi HET accoppiati con femmine di controllo (HETxWT accoppiamento, Figura 4A). Femmine HET, se accoppiato con un maschio di WT (controllo), o un uomo, HET generato significativamente meno cucciolate nello studio di fertilità di 3 mese, rivelando che le femmine HET sono subfertili13. Per illustrare l'importanza di conferma Inizio puberale prima della creazione di un test di fertilità, competenza riproduttiva è stata valutata in cKO topi, dove i maschi avevano ritardato la separazione del prepuzio (Figura 3) e le femmine non hanno avuto loro primo estro di 80 giorni di età (Figura 3E). Studio di fertilità è stato istituito > 1 settimana dopo che i maschi hanno avuti separazione del prepuzio e nelle femmine a > 80 giorni di età. Durante lo studio di fertilità di 70 giorni, accoppiamenti di controllo generato una media di 2,2 cucciolate, mentre nessun cucciolate sono stati generati da sia il cKO femmina in coppia con un maschio WT o il maschio cKO accoppiato con una femmina di controllo (WT) (Figura 4B), mostrando che questi topi sono infertili5,22.
Per meglio caratterizzare il fenotipo di fertilità delle femmine HET, abbiamo registrato il numero di giorni che necessari per generare la prima cucciolata. Accoppiamenti di WTxWT generata loro prima cucciolata in una media di 22 giorni (Figura 4), che era paragonabile ai maschi HET accoppiati con femmine WT. HET femmine accoppiate con i maschi WT hanno preso una media di 58 giorni per produrre la loro prima cucciolata, che era simile al HETxHET accoppiamenti (Figura 4). Tuttavia, il ritardo nel generare la prima cucciolata di femmine HET era molto eterogenea e in ritardo più in HETxHET accoppiamenti, suggerendo una semi-penetranza del fenotipo e un contributo del maschio HET alla subfertilità osservata in accoppiamenti HETxHET13 .
Valutare la dimensione della lettiera può dare importanti informazioni sulla produzione di ovulazione / l'impianto e lo sperma. La dimensione media delle prime 3 cucciolate è stata determinata. Interessante, tutti mating combinazioni (WTxHET, HETxWT, HETxHET) prodotti cucciolate significativamente più piccole rispetto ai comandi (WTxWT, Figura 4), mostrando che i topi HET sia maschili che femminili sono subfertili.
Figura 1: l'asse ipotalamo-ipofisi-gonadi controlla maturazione sessuale e riproduzione. All'apice dell'asse riproduttivo sono i neuroni ipotalamici kisspeptin (cerchi gialli) e la gonadotropina - releasing hormone (GnRH) neuroni (cerchi verdi). Nel periodo giovanile (prima della pubertà), kisspeptin neuroni rilasciano poco kisspeptin su neuroni GnRH. Dopo l'Inizio puberale, kisspeptin rilascio sui neuroni GnRH è aumentata (post-puberale). Rilascio di GnRH aumentato nel tardo periodo giovanile aumenta drammaticamente l'ormone luteinizzante (LH) e follicolo-stimolante il rilascio di ormone (FSH) dall'ipofisi, che porta a maturazione gonadica e funzione riproduttiva in età adulta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: determinazione dell'Inizio puberale in topi. Un indicatore esterno dell'Inizio puberale nei topi è separazione del prepuzio (A) nei maschi e nelle femmine di apertura vaginale. Barra della scala = 1 cm. immagini di esempio (B) da lavanda vaginale utilizzato per determinare il primo estro. Scivoli erano controcolorati per 30 s con 0.1% blu di metilene, airdried e osservato a 20 ingrandimenti. Le frecce nere indicano le cellule epiteliali nucleate, frecce gialle con contorno nero indicano leucociti e frecce bianche indicano le cellule epiteliali cornificate. Primo estro si è verificato il giorno 10, dopo l'apertura vaginale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: dati rappresentativi che possono essere generati da uno studio di Inizio puberale. (A, B) Apertura vaginale e peso all'apertura vaginale nei modelli murini transgenici. (C) peso a 4,5 settimane nelle femmine di controllo e chiamare l'operatore. (D, E) Età e peso al primo estro. (F, G) Età e peso alla separazione del prepuzio. (H) peso a 4,5 settimane nei maschi di controllo e chiamare l'operatore. I dati rappresentano mezzi ± SEM. N = 5-10 per la prova di analisi di gruppo, statistica dello studente-t. p< 0.01; p< 0,001. Queste cifre sono state modificate dal precedente pubblicazione13,22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: analisi rappresentativa da uno studio di fertilità dei topi transgenici. Valutazione di fertilità dei topi HET Vax1 (A) e (B) cKO è stata eseguita in vergini 10 - a 16-settimana-vecchi topi e registrato il numero di cucciolate nei tempi indicati. I dati rappresentano mezzi ± SEM. Statistical analysis è stata eseguita da One-way ANOVA seguita da test di confronto più di Dunnett. * p< 0,05; p< 0,001. (C) il numero di giorni prima cucciolata (n = 5-12) e (D) cucciolata media dimensione delle prime tre cucciolate (n = 10-13) è stata determinata. I dati rappresentano mezzi ± SEM. statistica analisi è stata fatta dalla prova dello studente-t rispetto al WT x WT *p< 0,05; p< 0.01. Queste cifre sono state modificate dal precedente pubblicazione13,22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: creazione di un test di fertilità. (A) esempio di schema e numero di animali necessari per un'analisi di fertilità suggerito da riproduzione. Il numero totale di animali necessari per uno studio con 2 condizioni come un controllo contro KO o controllo dieta contro dieta grassa alta dove la fertilità è valutata sia maschi che femmine è: 2 topi per accoppiamento (1 maschio x 1 femmina) x 8 animali per sesso di gruppo x 2 condizioni x 2 s (per valutare la fertilità sia maschile che femminile) = totale di 64 animali per studio. Se lo studio della fertilità maschile e femminile è fatto in parallelo, un set di controllo x controllo accoppiamenti di solito può servire per confrontare sia l'impatto sulla riproduzione maschile e femmina. (B) durante l'impostazione di un test di fertilità, i topi utilizzati devono avere raggiunto la maturità sessuale. Diversi ceppi di topi hanno differenti caratteristiche riproduttive e raggiungono la maturità sessuale a diverse età24. Per informazioni sui ratti, vedere precedente pubblicazione25. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il benessere generale dei topi è critico per un test di fertilità successo21. Quando si esegue un test di fertilità, è importante controllare non fisicamente sui topi ogni giorno come questo può causare stress. Evitare ulteriori modifiche frequenti gabbia, come questi sono anche stressanti. Idealmente le modifiche gabbia saranno fatto non più di 1 - 2 volte alla settimana. L'esposizione alla luce durante la fase scura influisce negativamente sulle allevamento nei roditori notturni. Non accendere le luci in camera allevamento durante le ore scure. Se ingresso alla camera è necessaria durante le ore scure, utilizzare illuminazione fioca luce rossa. Un altro fattore è la presenza di odori eccessivi, vibrazioni o rumore nel vivario per tutto o parte dello studio. Per aiutare ad alleviare lo stress e migliorare l'allevamento e il benessere del mouse, dare i topi nidificazione materiale o altri tipi di arricchimento. Costruzione del nido è un comportamento importante in topi e aumenterà il successo riproduttivo. I nidi permettono anche i topi un posto per nascondersi e giocare. Razza di animali sani e ben nutriti bene, pertanto è importante fornire accesso ad libitum all'alta qualità del cibo e acqua. Se coppie riproduttrici iniziano a mostrare sintomi di malattia, quali dermatite (frequente in C57BL/6J), malocclusione dentaria o altro, è possibile escludere questi topi dallo studio. Inoltre, se lo studio è stato fatto in topi immunodeficienti, esso è la chiave che la camera del mouse è tenuta pulita per preservare la fertilità.
Per impostare in modo appropriato uno studio di fertilità, è importante decidere se lo studio verrà eseguito in topi vergini o allevatori provati anche con la stessa cura selezionare i topi utilizzati per accoppiamenti di controllo. Accoppiamenti di controllo devono essere eseguiti in parallelo con gli allevatori sperimentali. Questo è imperativo come sconosciuti o imprevisti fattori di stress e cambiamenti nell'ambiente possono causare cambiamenti nel tasso di allevamento. Accoppiamenti di controllo sono preferenzialmente composti da compagni di cucciolata per topi sperimentali (Figura 5A). Ciò è particolarmente importante quando lo studio di fertilità è fatto in topi con fondo misto genetica a causa delle grandi variazioni nell'allevamento caratteristiche tra ceppi murini (figura 5B).
Identificare un fenotipo di subfertilità può essere difficile a causa della prolungata lunghezza dello studio e la necessità di analizzare parametri aggiuntivi per rivelare la sua causa. Il mouse HET nei dati del rappresentante è un buon esempio di un fenotipo di subfertilità modesto (Figura 4), e l'analisi estesa necessario per identificare la subfertilità maschile. Come mostrato nei Risultati di rappresentante (Figura 3 e 4), normale arrivo della pubertà (Figura 3A, De F) può essere associato con subfertilità maschile e femminile (Figura 4A, C, D ). In questo caso, i topi erano solo sub-fertili, e così la lunghezza dello studio è stato esteso a 120 giorni. Questo è importante, come uno studio di fertilità più breve (ad es., 60 giorni) non sarebbe stato in grado di rivelare il fenotipo. La subfertilità maschile era modesto e in primo luogo ha rivelato quando i maschi HET sono stati accoppiati con femmine HET, che inoltre sono stati subfertile (Figura 4A). Infatti, la subfertilità di maschi HET è stata confermata quando si valuta la dimensione media delle cucciolate desiderato (Figura 4). Follow-up studies ha confermato la subfertilità maschile e ha rivelato una scarsa qualità dello sperma nei maschi HET, con una riduzione di ~ 80% di spermatozoi motili13.
Quando eseguire un fertilità e Inizio puberale studio nei topi con un importante ritardo nell'Inizio puberale (> 5 giorni), è importante considerare i diversi fattori che regolano l'Inizio puberale26. Anche se l'apertura vaginale e primo estro più spesso accadono simultaneamente in ratti, primo estro nei topi si verifica solitamente ~ 10 giorni dopo l'apertura vaginale25,27. Pertanto, è consigliabile per garantire che sia apertura vaginale e primo estro sono stabiliti quando si lavora in topi e ratti18,28. Inizio puberale è legato alla condizione metabolica e peso corporeo nelle femmine e in misura minore in maschi1,7,9,29, e come tale, un trattamento o una mutazione genetica, rallentando la crescita degli animali sarà in alcuni casi un inizio in ritardo puberale. Per determinare se il ritardo/avanzamento nell'Inizio puberale può essere associata a crescita veloce/lento, è importante pesare i topi al giorno durante la valutazione dell'Inizio puberale. Come visto in Figura 3B e C, così come G e H, il ritardo nell'Inizio puberale non è stato associato con peso corporeo ridotto, ma è stato un vero ritardo nell'Inizio puberale, come confermato dall'istologia gonadica e ormone circolante livelli di22. Uno dei principali limiti di utilizzo di separazione del prepuzio e apertura vaginale come marcatori dell'Inizio puberale è che entrambi spesso accadrà alla fine nel tempo a causa di meccanismi diversi da quelli aumentata attività dell'asse riproduttivo18, 30 , 31 (Figura 1). Un esempio di questo è l'apertura vaginale in ritardo nelle femmine cKO (Figura 3B). Le femmine di cKO mai diventano fertili a causa di un'assenza di ovulazione22 (Figura 3E). Infatti, ulteriori studi che valutano i livelli ormonali e l'istologia gonadica dei topi cKO ha dimostrato che questi topi mai completato la pubertà e sono stati infertile22 (Figura 4B). Ciò indica il limite di usando gli indicatori esterni per determinare Inizio puberale. Completamento della pubertà e raggiunge la maturità sessuale richiede maggiore rilascio di GnRH e attivazione dell'asse riproduttivo (Figura 1), e per confermare pienamente la maturità sessuale sia gonadica morfologia e livelli di ormone di circolazione devono essere valutati 22 , 31. nei maschi, testosterone di misurazione e valutazione della vescichetta seminale dimensioni e morfologia del testicolo e dimensioni oltre a qualità dello sperma confermerà la pubertà era raggiunto16,22,32. Nelle femmine, la misurazione dei livelli di estrogeni e progesterone in combinazione con peso uterino ed ovarico e morfologia confermerà il completamento della pubertà17,19,22,33.
Dimensione della lettiera possa avere un impatto sia la lunghezza di gestazione e l'età d'esordio puberale. Maggior parte dei ceppi di topi hanno un periodo di gestazione di 18-22 giorni. Tuttavia, se la madre è in attesa di una cucciolata di grandi dimensioni, il periodo di gestazione tende ad essere ridotto34,35. D'altra parte, se la madre sta allattando una cucciolata precedente, questo può comportare un'estensione del periodo gestazionale5. Cuccioli in grandi cucciolate tendono anche ad avere Inizio puberale in ritardo. Questo è causato dalla loro crescita essendo leggermente ritardato1,9,34,35. Se viene eseguito uno studio di fertilità e uno dei gruppi del mouse (control o sperimentale) produce cucciolate molto numerose, si raccomanda di omogeneizzare cucciolata dimensioni, anche definiti l'abbattimento, permettendo le cucciolate studiate avere dimensioni comparabili.
Riproduzione può solo essere valutati in vivo a causa di più organi coinvolti nella riproduzione (Figura 1) e i meccanismi di feedback vasto che regolano l' asse riproduttivo3. Taluni aspetti di competenza riproduttiva possono essere rapidamente valutate attraverso un'analisi di tamponamento vaginale, dove la capacità del maschio di montare la femmina e lasciare una spina fisica nella vagina è osservata13,36. Anche se si tratta di un approccio utile per valutare il comportamento sessuale maschile, questo tipo di studio non consente la rilevazione di piccoli problemi nella riproduzione, né giudica mantenuto fertilità per un lungo periodo di tempo o dimensione risultante di lettiera e comportamento parentale. Il protocollo descritto qui presenta numerosi vantaggi rispetto ad un'analisi di tamponamento, il maggiore è la capacità di identificare i maggiori e minori impatti sulla competenza riproduttivo nei maschi e nelle femmine (Figura 4).
La fertilità diminuisce con l'età, e in più il ciclo estrale femminile diventa più lunga e irregolare durante invecchiamento5,28. Si raccomanda pertanto di avviare uno studio di fertilità nel giovane e sessualmente maturi animali. Una fascia di età in genere usati per impostare uno studio di fertilità è 10-16 settimane di età. Tuttavia, è importante avere familiarità con le specifiche caratteristiche riproduttive del ceppo del mouse utilizzato nello studio, come grandi differenze nella riproduzione e nella maturità sessuale esistano tra diverso mouse o ceppi di ratti (figura 5B). Ulteriori informazioni su caratteristiche riproduttive possono essere trovati in https://phenome.jax.org/ il JAX Mouse fenomeno Database. Esecuzione di un più lungo (> 4 mese) studio di fertilità ha il vantaggio di essere in grado di rilevare il declino iniziale riproduttiva, dove i topi potrebbero riprodursi normalmente per l'1-2 mesi primi del test di fertilità, ma poi hanno un declino iniziale nella riproduzione a partire prima 6 mesi di età.
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Disclosures
L'autore non ha nulla di divulgare.
Acknowledgments
Ringrazio gli autori che contribuiscono al lavoro iniziale che è alla base di questa pubblicazione. Grazie a Aitor Aguirre, Genevieve E. Ryan ed Erica L. Schoeller per aiuto preparazione del manoscritto. Grazie a Jessica Sora Lee e Austin Chin per assistenza tecnica con il manoscritto. H.M.H è stato sostenuto da Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & sviluppo umano dei National Institutes of Health, sotto Premio numero R00HD084759.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Cotton Balls | Fisher | 22456885 | |
| Surface protector | Fisher | 1420637 | |
| Light meter | VWR | 21800-014 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Microscope Slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Optimouse rack with cages | AnimalCare systems | C89100 | |
| Water Bottle Basket | AnimalCare systems | C61011 | |
| Filtered Cage Tops | AnimalCare systems | C78210 | |
| Optimice Standard Feeder | AnimalCare systems | C40100SG | |
| Cage Card Holder | AnimalCare systems | C43251 | |
| Cage Cards | AnimalCare systems | M52010 | |
| Bottle Assambley | AnimalCare systems | C79122P | |
| Bed R'Nest Nesting | The Andersons | BRN4WSR | |
| 1/8" Corn Cob bedding | The Andersons | 8B | |
| Standard mouse chow | Teklad | 7904 (7004) | |
| Scale | VWR | 10205-004 | |
| Polypropylene Beaker | Fisher | 14-955-111F |
References
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