Summary
Många behandlingar och genetiska mutationer påverkar tidpunkten för könsmognad och fertilitet. Det här protokollet beskriver en icke-invasiv metod för att utvärdera pubertala debut på möss och råttor innan ställa in en fertilitetsstudie på könsmogna djur.
Abstract
Bedömning av reproduktiva kompetens är avgörande för att förstå effekten av en behandling eller genetisk manipulation den reproduktiva axeln, också betecknas i hypotalamus-hypofysaxeln. Den reproduktiva axeln är en nyckel integratör av miljö- och inre indata anpassning fertilitet till goda förutsättningar för reproduktion. Innan du påbörjar en fertilitetsstudie på möss och råttor, könsmognad utvärderas för att utesluta att de observerade reproduktiv fenotyperna orsakas av fördröjd eller frånvarande pubertala debut. Det här protokollet beskriver en icke-invasiv metod för att bedöma pubertala debut hos män genom bestämning av preputiala separation, och hos kvinnor genom slidöppningen och första brunst. Efter bekräftelse av slutförandet av puberteten och uppnåendet av sexuell mognad, kan en fertilitetsstudie initieras. Förfarandet beskrivs de optimala avel villkor för möss och råttor, hur du ställer in en fertilitetsstudie och vilka parametrar som ska utvärdera och avgöra om behandlingen eller gen radering har en inverkan på fertilitet.
Introduction
Att uppnå könsmognad och reproduktiv kompetens krävs övergången igenom puberteten. Pubertala övergången och upprätthållandet av fertiliteten i vuxen ålder är reglerat av den reproduktiva axeln, också betecknas i hypotalamus-hypofysaxeln (figur 1). Tidpunkten för pubertala debut och underhåll av fertilitet är hårt reglerad av inre såväl som miljömässiga faktorer för att öka chanserna för överlevnad av avkomman och föräldrar1,2. Detta protokoll ger en icke-invasiv metod för att bestämma pubertala debut hos mus och råtta bekräftar könsmognad innan ställa in en fertilitetsstudie att bedöma reproduktiv kompetens.
En fertilitetsstudie utförs i könsmogna djur och kan initieras efter djuren har gått igenom puberteten. Den reproduktiva axeln är quiescent före könsmognad debut, och nyckel föraren av sexuell mognad, gonadotropinfrisättande hormon (GnRH), släpps på hypofysen i otillräckliga mängder att initiera pubertet (figur 1). Pubertala debut är en komplicerad process som resulterar i ökad GnRH frisättning vid median överlägsenhet. GnRH främjar luteiniserande hormon (LH) och follikelstimulerande hormon (FSH) sekretion från hypofysen, två hormoner som är väsentliga för gonadala mognad och fortplantningsförmågan (figur 1)3,4,5 .
Förolämpningar reproduktiv axel resultera i minskad fertilitet och kan också förskott eller dröjsmål pubertala debut. Villkoren kända för att påverka tidpunkten för pubertala debut och reproduktiv kompetens omfattar exponering för hormonstörande kemikalier6,7, ökade/minskade kropp vikt1,8, förändringar i dag längd2,9 och genetiska mutationer10,11,12,13,14,15.
Uppkomsten av sexuell mognad är ett avgörande steg som måste slutföras innan ställa in en fertilitet assay. Fördelarna med att fastställa pubertala debut genom preputiala separation, slidöppningen och första brunst, är dessa förfaranden, icke-invasiva egenskaper som de inte kräver blodinsamling eller offer av djur16, 17.
Efter pubertala debut bestäms, korrekt ställa in en fertilitetsstudie kommer att ge viktig information om integriteten i den reproduktiva axeln och har vanligtvis den andra fördelen generera försöksdjur för fortsatta studier (förfining) 18. den fertility studie inställning som beskrivs i detta protokoll kan upptäcka både mindre och större underskott i reproduktiv kompetens hos män och kvinnor. Viktiga parametrar utvärderas inkluderar 1) tid till den första kullen, 2) antal kullar som genereras i en given tidsram och 3) kull storlek. Slutligen ingår rekommendationer för typ av uppföljning av studier som kan genomföras för att identifiera orsaken till nedsatt fertilitet.
Protokollet beskrivs refererar till möss och representativa data återspeglar arbetet i transgena möss. Alla medföljande protokoll är dock lika giltiga i råttor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av institutionella djur vård och användning kommittén av Michigan State University och utförs i enlighet med guiden för skötsel och användning av försöksdjur.
1. Bestäm pubertala debut
- Följ anvisningar för kläder, minst, är det nödvändigt att bära en ren labbrock och rena handskar. Hantera alltid möss med rena handskar.
- Förbered arbetsytan genom att placera en pad på bordet.
- Placera en ren mus bur topp med rutnätet uppåt på pad.
- Ställa in en skala i arbetsområdet. Placera en ren 500 – 1000 mL bägare på skala och tare.
- Placera ett ark intill arbetsområdet till rekord kroppsvikt och preputiala separation, slidöppningen eller första brunst.
- Identifiera möss för studien. Utföra dagliga inspektioner för pubertala debut tills puberteten nås. Utföra besiktningen vid samma tid på dagen under hela studien. Pubertala debut kan uppstå så tidigt som postnatal dag 11-1219, dock i mest experimentella uppställningar, pubertal debut övervakning börjar vid ~ 22 dagar.
- Placera musen buren i arbetsområdet (steg 1,2). Öppna buren och placera locket, vattenflaska och mat innehavaren på bordet.
- Att fastställa preputiala separation hos hanmöss.
- Håll musen i svansen och placera den ovanpå buren ren mus från steg 1.2.1. Håll försiktigt på svansen och låt musen utforska nätet av bur toppen för ~ 5 s.
- Försiktigt dra svansen bakåt; Detta resulterar oftast i djuret framåt medan du håller på att rutnätet med sina framben. Strategi å andra sidan att huden stänger av hals och öron.
- Förstå den lösa huden mellan axlar och nacke med tummen och pekfingret. Det är viktigt att få bra tag i huden, eftersom det kommer att hindra musen från vända huvudet att bita.
- Greppa huden på ryggen med återstående fingrarna och håll den genom att trycka mot handen. Håll ett stadigt grepp utan att hindra andningen, blod flöde eller skadliga ben, muskler eller hud. Slå handen att utsätta magen av musen, samtidigt stödja baksidan av musen inom handflatan.
- Med den fria handen försiktigt trycka tillbaka huden runt penis utan att tvinga. På preputiala separation glider preputiala huden bakåt utsätta ollonet (figur 2A, pil visar preputiala separation). Registrera närvaro eller frånvaro av preputiala separation.
- Väga musen genom att försiktigt placera den i 500-1000 mL-bägaren från steg 1.2.2 och anteckna vikten.
- Återinföra musen i bostäder buren genom att hålla den bägare 0-2 cm över golvet bur och långsamt välta bägaren så att musen att avsluta på egen hand. Rengöra bägaren med vatten och milt rengöringsmedel och torka av den innan du återvänder det till skalan och tarering skalan.
- Att fastställa slidöppningen hos honmöss.
- Placera en bomullstuss, bägare och en flaska med sterilt vatten i arbetsområdet (steg 1,2). Häll vatten i bägaren. Fukta en bomullstuss med sterilt vatten och placera den bredvid buren upp från steg 1.2.1.
- Placera musen buren i arbetsområdet (steg 1,2) och överföra musen från sin hem bur bur överst (steg 1.2.1) genom att hålla den vid basen av svansen. Dra försiktigt tillbaka svansen för att uppmuntra en framåt rörelse av musen.
- Lyft svansen samtidigt stödja höfterna med gratis fingrarna. Att bakbenen att hålla kontakt med toppen av buren. Om musen rör sig för mycket, håll den i handen som beskrivs i steg 1.5.1-1.5.4.
- Försiktigt rengöra vulva med vatten fuktad bomullstuss från steg 1.6.1. Använd en ren fuktad bomullstuss för varje mus. Att bestämma slidöppningen, undersöka vulva och avgöra om slidan är helt öppet (figur 2A, kvinnliga slidöppningen).
- Registrera om slidöppningen har inträffat. Väga musen och returnera den till buren som beskrivs i steg 1.5.6-1.5.7.
- Första brunst en indikator på första ägglossningen.
- Placera en bägare med sterilt vatten, en märkt glasskiva och en 200 µL pipett med ren spets i arbetsområdet (steg 1,2).
- Håll kvinnligt som beskrivs i steg 1.6.2-1.6.3. Placera spetsen på pipetten innehållande ~ 50 µL sterilt vatten vid slidöppningen.
- Spola försiktigt cellerna från vaginalväggen genom att införa och balanserad ~ 50 µL av vatten 2 - 4 gånger. Smeta innehållet från pipettspetsen på ett märkt glas objektglas.
- Noggrant följa cellernas morfologi på brightfield Mikroskop med en 10 X eller 20 X-objektiv eller låt den smeta airdry för ~ 1 h och sedan motfärg med en 0,1% lösning av metylenblått (upplöst i ddH2O) (figur 2B). För att motfärg, doppa i torkade bilden i 0,1% metylenblått lösning för ~ 30 s. Låt bilden lufttorka för 1 h.
- Se bilderna från steg 1.7.4 på ljusa fält Mikroskop 10 X eller 20 X. Etablera scenen av östruscykel (figur 2B)20 genom att observera den cellmorfologi som gör det möjligt för att urskilja fyra olika faser av östruscykel (figur 2B).
Obs: Metestrus kännetecknas av en blandning av cornified skivepitelcancer epitelceller och leukocyter, diöstrus av leukocyter, Proöstrus av en blandning av leukocyter och kärnförsedda epitelceller, och brunstigheten av cornified epitelceller (figur 2B) 20. - Spela in kroppsvikt och återgå musen till dess buren som beskrivs i steg 1.5.6-1.5.7. Vaginal cellprov avslutas den dagen när musen har dess första brunst (figur 2B).
2. önskvärd avel rumsvillkoren
- Säkerställa att avel rummet har en temperatur på ~ 20-24 ° C, med 55 ± 10% luftfuktighet, och homogena rum ljus av en intensitet av ~ 300-400 lux ca 1 m ovan golv21. Detta ljusintensiteten tillåter önskvärt mitten av buren ljusintensiteten för 25-80 lux. Testa ljusintensitet, använda en ljusmätare.
- Använda ett automatiserat system för att styra belysningen i rummet för avel att säkerställa lämpliga tidpunkten för belysning i hela experimentet. Optimala dagen-längd förutsättningar att bedöma fertilitet hos gnagare utbud från 12 h om dagen (12 h ljus och 12 h mörker, LD12:12), ”somrigt” villkor med 14 h ljus och 10 h mörker (LD14:10)21.
- Förbereda avel burar.
- Förbered en ren mus bur med lock, vatten, mat, sängkläder och häckning per häckande par.
- Fyll buren korten med all nödvändig information, inklusive kön, födelsedatum, mus stam, och det datum när parningen är inställd.
3. fertilitetsstudie
- Identifiera de djur som ska användas för fertilitetsstudien. Se till att djuren är könsmogna (steg 1). Ett normalt använt åldersintervall att ställa in en fertilitetsstudie på möss är 10-16 veckors ålder, en ålder där sexuell mognad har genomförts under mest experimentella förhållanden.
- På ett rent bord, placera avel buren beredd i steg 2,3.
- Fånga och håll musen.
- Långsamt introducera en behandskade hand i mus buren. Lämna handen i buren under en kort tid (~ 5-30 s), att låta mössen att anpassa sig till lukten av handske och hand. Undvik hektiska och ryckiga rörelser.
- Sänk den kupade handen nära botten av buren och långsamt närma sig den till möss. De kommer att springa iväg. När de kör över handen, fånga svansen av en mus mellan tummen och pekfingret.
- Lyfta musen i svansen för 2-3 s. Om musen behöver hållas längre, hålla fast svansen och Placera musen i den kupade handen att upprätthålla lastrummet på svansen.
- Överför 1 manlig och därefter 1 kvinnliga till avel buren genom att hålla dem i svansen (steg 3.3). Säkerställa att honorna är i samma estrous scenen när du konfigurerar fertilitet analysen. Bestämma estrous scenen av honorna genom att utföra ett vaginala utstryk som beskrivs i steg 1,7.
- Nära buren, och säkerställa att mössen har mat, vatten och häckande material. Fästa buren korthållaren med bur kortet till buren.
- Placera buren avel på bostäder racket. Lämna avel buren så ostört som möjligt under hela av fertilitetsstudien. Genomföra fertilitetsstudien för 30 dagar. För varje avelspar, föra detaljerade register och not 1) datum parningen är inställd, 2) det datum som kullar föds och (3) antalet Valpar födda, inklusive döda och levande ungar. Utför kullen kontroller dagligen under hela studien.
- Förlänga fertiliteten studie för ytterligare 30-60 dagar om ingen eller en svag påverkan på fertiliteten är etablerad i steg 3.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De presenterade resultaten är från två olika transgena musmodeller där de transkription faktorn ventrala främre homeobox 1 (Vax1) har tagits bort i hela kroppen på en allel, här kallade heterozygot möss (HET)13eller Vax1 har raderats villkorligt inom GnRH nervceller22, här kallas villkorad KO (cKO). Innan du konfigurerar fertilitetsstudien, är det viktigt att bekräfta pubertala debut i alla mössen.
Första var dagen och vikt vid slidöppningen och preputiala separation etablerade. Hos mössen med HET slidöppningen och preputiala separation inträffade vid samma ålder och vikt liksom kontroll möss (figur 3A och F, respektive). Däremot slidöppningen och preputiala separation var signifikant fördröjning i cKO honor och hanar och är associerad med ökad kroppsvikt (figur 3B och G, respektive). Pubertala uppkomsten är till viss del är associerad med kroppsvikt och detta är särskilt sant i honor23. För att avgöra om förseningen i slidöppningen och preputiala separation var associerade med en fördröjning i viktökning, var kroppsvikt vid slidöppningen och preputiala separation i kontroller (4,5 veckor gammal) genomsnittliga ålder jämfört med kroppsvikten i cKO hos män och kvinnor vid 4,5 veckors ålder. Vid ålder 4,5 veckor hade kvinnliga kontroller och cKO jämförbar kroppsvikt (figur 3 c), medan cKO män var något tyngre än kontroller (figur 3 H). Detta indikerar att förseningen i slidöppningen och preputiala separation i cKO inte är associerade med en fördröjning i viktökning.
Slidöppningen är en tidig markör av sexuell mognad och första brunst en indikator som första ägglossningen skett, en markör för slutförandet av puberteten17. För att avgöra om HET och cKO honor nått första brunst på samma ålder och vikt som kontroller, utfördes vaginal cellprov dagligen från dagen i slidöppningen tills första brunst (figur 3E och 3D). Hos mössen med HET var första brunst och vikt på första brunst jämförbar mellan kontroller och HETs (figur 3D). Däremot cKO framsteg inte genom östruscykel och hade inte första brunst på åldern av 80 dagar (figur 3E). Denna försening berodde inte på minskad kroppsvikt (figur 3E).
HET möss med bekräftade pubertala debut användes för att ställa in fertilitetsstudien. Fertilitet analysen sattes upp i 12 timmar ljus och 12 h mörka förhållanden (LD12:12) hos transgena möss på C57BL/6J genetiska bakgrund. Mössen var i åldern 10-16 veckor i början av experimentet. Fyra grupper av möss studerades: styra parningar (WTxWT), styra män med HET honor (WTxHET), HET hanar med WT honor (HETxWT) och HET hanar med HET honor (HETxHET). Först bestämdes antalet kullar som genereras i 3 månader. Kontroll parningar (WTxWT) genereras i genomsnitt 2,8 kullar i 3 månader, vilket var jämförbart med HET hanar parat med kontroll honor (HETxWT parning, figur 4A). HET kvinnor, genererats om ihop med en WT manliga (kontroll), eller en hane, HET betydligt färre kullar i 3 månaders fertilitetsstudien, avslöjar att HET honor är subfertile13. För att illustrera vikten av bekräftar pubertala debut före inrättandet en fertilitet assay, utvärderades reproduktiv kompetens i cKO möss, där hanarna hade försenade preputiala separation (figur 3 g) och honorna inte hade sin första brunst genom 80-dagars ålder (figur 3E). Fertilitetsstudien inrättades > 1 vecka efter hanar hade preputiala separation, och hos honor vid > 80 dagars ålder. Under 70-dagars fertilitetsstudien, kontroll parningar genereras i genomsnitt 2,2 kullar, medan inga kullar genererades från antingen den kvinnliga cKO parat med en WT hane eller cKO hanen parat med en kontroll (WT) kvinna (figur 4B), visar att dessa möss är infertila5,22.
För att bättre karaktärisera fertilitet fenotypen av HET honorna, vi spelade in antalet dagar som det tog för att generera den första kullen. WTxWT parningar genereras sin första kull i genomsnitt 22 dagar (figur 4 c), vilket var jämförbart med HET hanar parat med WT honor. HET honor parat med WT män tog i genomsnitt 58 dagar att producera deras första kull, som liknade HETxHET parningar (figur 4 c). Förseningen i genererar den första kullen av HET honorna var dock mycket heterogen och fördröjd mer i HETxHET parningar, vilket tyder på en semi penetrans av fenotypen, och ett bidrag på HET hanen till den subfertility som observerats i HETxHET parningar13 .
Utvärdera kullstorlek kan ge viktig information om ägglossning/implantation och spermieproduktion. Den genomsnittliga storleken på de första 3 kullarna fastställdes. Intressant, alla parning kombinationer (WTxHET, HETxWT, HETxHET) produceras betydligt mindre kullar jämfört med kontroller (WTxWT, figur 4 d), visar att både manliga och kvinnliga HET möss är subfertile.
Figur 1: den hypotalamus-hypofysaxeln styr könsmognaden och reproduktion. Vid spetsen av den reproduktiva axeln är hypotalamus kisspeptin nervceller (gula cirklar) och gonadotropinfrisättande hormon (GnRH) nervceller (gröna cirklar). I den juvenila perioden (prepubertala) släppa kisspeptin nervceller lilla kisspeptin på GnRH nervceller. Efter pubertala debut utökas kisspeptin release på GnRH neuroner (efter pubertala). Ökad GnRH frisättning i den sena juvenila perioden ökar dramatiskt luteiniserande hormon (LH) och follikelstimulerande hormon (FSH) release från hypofysen, vilket leder till gonadala mognad och reproduktiv funktion i vuxen ålder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: bestämning av pubertala debut i möss. En extern markör av pubertala debut hos möss är (A) preputiala separation i hanarna, och vaginal öppning i honorna. Skalstapeln = 1 cm. (B) exempel bilder från vaginal lavage används för att bestämma första brunst. Bilderna var counterstained för 30 s med 0,1% metylenblått, lufttorkad och observerades vid 20 X förstoring. Svarta pilarna visar kärnförsedda epitelceller, gula pilar med svart kontur visar leukocyter och vita pilar indikerar cornified epitelceller. Första brunst inträffade på dag 10 efter slidöppningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa uppgifter som kan genereras från en pubertal debut studie. (A, B) Slidöppningen och vikt vid slidöppningen i de transgena musmodeller. (C) vikt 4,5 veckor i kontroll och cKO honor. (D, E) Ålder och vikt på första brunst. (F, G) Ålder och vikt på preputiala separation. (H) vikt 4,5 veckor i kontroll och cKO hanar. Uppgifterna utgör medel ± SEM. N = 5-10 per grupp, statistisk analys studentens-t test. p< 0,01; p< 0,001. Dessa siffror har ändrats från föregående publikation13,22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativ analys från en fertilitetsstudie på transgena möss. Fertilitet bedömning av (A) Vax1 HET möss och (B) cKO utfördes i virgin 10 - 16 vecka-gamla möss och antalet valpkullar registreras i de angivna tidsramarna. Uppgifterna utgör medel ± SEM. statistisk analys utfördes av envägs ANOVA följt av Dunnetts flera jämförande test. * p< 0,05; p< 0,001. (C) antalet dagar till första kull (n = 5-12), och (D) genomsnittlig kullstorlek av de tre första kullarna (n = 10-13) bestämdes. Uppgifterna utgör medel ± SEM. statistisk analys gjordes av studentens-t test jämfört med WT x WT *p< 0,05; p< 0,01. Dessa siffror har ändrats från föregående publikation13,22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: ställa in en fertilitet assay. (A) exempel på avel systemet och föreslagna antal djur som krävs för en fertilitet analys. Det totala antalet djur som krävs för en studie med 2 villkor såsom en kontroll jämfört med KO eller kontroll kost jämfört med hög fett kost där fertilitet bedöms hos både män och kvinnor är: 2 möss per parning (1 hane x 1 hona) x 8 djur per grupp x 2 villkor x 2 kön s (att utvärdera både manlig och kvinnlig fertilitet) = totalt 64 djur per studie. Om manlig och kvinnlig fertilitetsstudien görs parallellt, kan en uppsättning kontroll x kontroll parningar vanligt serven att jämföra båda effekterna på manlig och kvinnlig reproduktion. (B) när du ställer in en fertilitet assay, möss används måste ha nått könsmognad. Olika stammar av möss har olika reproduktiva egenskaper och når könsmognad vid olika åldrar24. För information om råttor, se föregående publikation25. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det allmänna välmåendet av mössen är avgörande för en framgångsrik fertilitet assay21. När du utför en fertilitet analys, är det viktigt att inte fysiskt kontrollera på möss varje dag eftersom detta kan orsaka stress. Ytterligare undvika frekvent buren förändringar, eftersom dessa är också stressande. Helst kommer att bur ändringar göras mer än 1 - 2 gånger per vecka. Ljusexponering under den mörka fasen inverkar negativt avel i nattaktiva gnagare. Slå inte på lampor i avel rummet under de mörka timmarna. Om posten till rummet krävs under de mörka timmarna, använda dim rött ljus belysning. En annan stressfaktor är förekomsten av överdriven lukt, vibrationer eller brus i ett vivarium för hela eller delar av studien. För att lindra stress och förbättra mus välmående och avel, ge mössen häckande material eller andra typer av berikning. Bobygget ökar avel framgång och är en viktig beteende hos möss. Bon också låta mössen en plats att gömma sig och spela. Friska och välnärda djur rasen väl, därför det är viktigt att ge ad libitum tillgång till högkvalitativ mat och vatten. Om häckande par börjar uppvisa symptom på sjukdom, som dermatit (frekventera i C57BL/6J), dental bettavvikelser eller andra, utesluta dessa möss från studien. Dessutom, om studien görs i nedsatt immunförsvar möss, är det nyckeln att musen rummet hålls ren att bevara fertiliteten.
Konfigurera en fertilitetsstudie på lämpligt sätt, är det viktigt att bestämma om studien utförs i virgin möss eller beprövad uppfödare samt så noga välja möss används för kontroll parningar. Kontroll parningar ska köras parallellt med den experimentella uppfödaren. Detta är absolut nödvändigt som okända eller oförutsedda påfrestningar och förändringar i miljön kan orsaka förändringar i avel ränta. Kontroll parningar består företrädesvis av kullen kompisar till experimentella möss (figur 5A). Detta är särskilt viktigt när fertilitetsstudien görs i möss med blandade genetiska bakgrunden på grund av de stora variationerna i avel egenskaper mellan mus stammar (figur 5B).
Att identifiera en stamcellsforskningen fenotyp kan vara svårt på grund av långvarig längden på studien och behovet av att analysera ytterligare parametrar att avslöja dess orsak. HET musen i representativa data är ett bra exempel på en blygsam stamcellsforskningen fenotyp (figur 4) och en utökad analys krävs för att identifiera den manliga stamcellsforskningen. Som visas i Representativa resultat (figur 3 och 4), kan normal debut av puberteten (figur 3A, Doch F) vara associerad med både manliga och kvinnliga stamcellsforskningen (figur 4A, C, D ). I det här fallet mössen var endast sub bördiga, och thus längden av studien förlängdes till 120 dagar. Detta är viktigt, som en kortare fertilitetsstudie (t.ex., 60 dagar) skulle inte ha kunnat avslöja fenotypen. Den manliga stamcellsforskningen blygsam och först avslöjat när HET hanar parats med HET hondjur, som också var subfertile (figur 4A). Faktiskt bekräftades stamcellsforskningen HET män vid utvärdering av den genomsnittliga storleken på kullar far (figur 4 d). Följa upp studier bekräftat den manliga stamcellsforskningen och avslöjade en dålig spermiekvalitet i HET hanarna, med en minskning på ~ 80% av den rörliga spermier13.
När utför en fertilitet och pubertala debut studie på möss med en stor fördröjning i pubertal debut (> 5 dagar), är det viktigt att överväga de olika faktorer som reglerar pubertala debut26. Även om slidöppningen och första brunst oftast hända samtidigt hos råttor, första brunst hos möss uppstår oftast ~ 10 dagar efter slidöppningen25,27. Därför är det rekommenderat att säkerställa att både slidöppningen och första brunst upprättas när du arbetar i både råttor och möss18,28. Pubertala debut är kopplat till metaboliska status och kroppsvikt hos kvinnor och i mindre grad i hanar1,7,9,29, och som sådan en behandling eller genetisk mutation sakta djurens tillväxt kommer i vissa fall resultera i en pubertal fördröjda. För att avgöra om försening/befordran i pubertal debut kan vara associerade med snabb/långsam tillväxt, är det viktigt att väga möss dagligen under bedömningen av pubertala debut. Som kan ses i figur 3B och C, samt G och H, pubertal debut förseningen var inte associerat med minskad kroppsvikt, men var en sann fördröjning pubertala debut, vilket bekräftades av gonadala histologi och cirkulerande hormon nivå22. En av de stora begränsningarna med att använda preputiala separation och slidöppningen som markörer av pubertala debut är att båda ofta kommer att hända så småningom över tiden på grund av mekanismer annat än ökad aktivitet av reproduktiva axis18, 30 , 31 (figur 1). Ett exempel på detta är fördröjd vaginal öppningen i cKO honorna (figur 3B). CKO honorna bli aldrig fertila på grund av en avsaknad av ägglossning22 (figur 3E). Faktiskt ytterligare visat studier utvärdera hormonella nivåer och gonadala histologi av cKO möss att dessa möss aldrig genomgått puberteten och var infertila22 (figur 4B). Detta visar gränsen för använder yttre markörer för att bestämma pubertala debut. Slutförande av puberteten och når könsmognad kräver ökad GnRH release och aktivering av den reproduktiva axeln (figur 1), och bekräfta fullt könsmogna både gonadala morfologi och cirkulerande hormonnivåer behöver utvärderas 22 , 31. mäta testosteron, och utvärdera seminal vesikel och testiklarna morfologi och storlek förutom spermiekvalitet hos män, kommer att bekräfta puberteten var uppnådda16,22,32. Hos kvinnor, kommer att mäta progesteron och östrogen nivåer i kombination med uterin och ovarial vikt och morfologi bekräfta slutförandet av puberteten17,19,22,33.
Kullstorlek kan påverka både dräktigheten längd och ålder på pubertala debut. De flesta mus stammar har en dräktighetsperiod 18-22 dagar. Men om mamman väntar en stor kull, tenderar dräktighetstiden att vara reducerad34,35. Däremot, om mamman är omvårdnad en tidigare kull, kan detta resultera i en förlängning av graviditetsdiabetes perioden5. Valpar i stora kullar tenderar också att ha försenat pubertala debut. Detta orsakas av deras tillväxt är något försenad1,9,34,35. Om en fertilitetsstudie utförs och en av grupperna mus (kontroll eller experimentella) producerar mycket stora kullar, det rekommenderas att homogenisera kull storlekar, också betecknas utslaktning, så att de studerade kullarna att jämförbara storlekar.
Reproduktionen kan endast bedömas i vivo på grund av att flera organ som är inblandade i reproduktion (figur 1) och de omfattande feedbackmekanismer som reglerar reproduktiv axel3. Vissa aspekter av reproduktiva kompetens kan snabbt utvärderas genom en vaginal pluggning analys, där kapaciteten hos hanen att montera honan och lämna en fysisk kontakt i slidan observeras13,36. Även om detta är en användbar metod att bedöma manliga sexuella beteende, denna typ av studie tillåter inte upptäckt av mindre problem i reproduktion, eller bedömer det underhålls fertilitet under en lång tid eller resulterande kullstorlek och föräldrarnas beteende. Protokollet beskrivs här presenterar många fördelar jämfört med en pluggning analys, stora är förmågan att identifiera både mindre och större effekter på reproduktiv kompetens hos män och kvinnor (figur 4).
Fertiliteten minskar med åldern, och dessutom den kvinnliga östruscykel blir längre och oregelbunden under åldrande5,28. Det rekommenderas därför att starta en fertilitetsstudie i ung och könsmogna djur. Ett normalt använt åldersintervall att ställa in en fertilitetsstudie är 10-16 veckors ålder. Det är dock viktigt att känna till reproduktiv särdrag av mus stammen används i studien, som det finns stora skillnader i reproduktion och sexuell mognad mellan annan mus eller råtta stammar (figur 5B). Ytterligare information om reproduktiv egenskaper kan hittas i JAX mus företeelser databas https://phenome.jax.org/. Utför en längre tid (> 4 månad) fertilitetsstudie har fördelen av att kunna upptäcka tidig reproduktiv nedgång, där möss kan föda normalt för fertilitet analysens första 1-2 månader, men då ha en tidig nedgång i reproduktion börjar före 6 månaders ålder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har något att avslöja.
Acknowledgments
Jag tackar författarna bidra till den inledande arbete som är grunden för denna publikation. Tack Aitor Aguirre, Genevieve E. Ryan och Erica L. Schoeller för hjälp förbereda manuskriptet. Tack till Jessica Sora Lee och Austin hakan för tekniskt bistånd med manuskriptet. H.M.H. stöddes av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & mänsklig utveckling av det nationella Institutes of Health under Award nummer R00HD084759.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Cotton Balls | Fisher | 22456885 | |
| Surface protector | Fisher | 1420637 | |
| Light meter | VWR | 21800-014 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Microscope Slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Optimouse rack with cages | AnimalCare systems | C89100 | |
| Water Bottle Basket | AnimalCare systems | C61011 | |
| Filtered Cage Tops | AnimalCare systems | C78210 | |
| Optimice Standard Feeder | AnimalCare systems | C40100SG | |
| Cage Card Holder | AnimalCare systems | C43251 | |
| Cage Cards | AnimalCare systems | M52010 | |
| Bottle Assambley | AnimalCare systems | C79122P | |
| Bed R'Nest Nesting | The Andersons | BRN4WSR | |
| 1/8" Corn Cob bedding | The Andersons | 8B | |
| Standard mouse chow | Teklad | 7904 (7004) | |
| Scale | VWR | 10205-004 | |
| Polypropylene Beaker | Fisher | 14-955-111F |
References
- Schneider, J. E. Energy balance and reproduction. Physiology and Behavior. 81 (2), 289-317 (2004).
- Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function. Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2012).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, (2016).
- Kauffman, A. S. Sexual differentiation and the Kiss1 system: Hormonal and developmental considerations. Peptides. , (2009).
- Bronson, F. H., Dagg, C. P., Snell, G. D. Reproduction. , Dover Publications, Inc. New York. (1966).
- Chehab, F. F., Mounzih, K., Lu, R., Lim, M. E. Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin. Science. , (1997).
- Yoshimura, S., Yamaguchi, H., Konno, K., Ohsawa, N., Noguchi, S., Chisaka, A. Observation of Preputial Separation is a Useful Tool for Evaluating Endocrine Active Chemicals. J Toxicologic Pathology. 18, 141-157 (2005).
- Ahima, R. S., Dushay, J., Flier, S. N., Prabakaran, D., Flier, J. S. Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice. Journal of Clinical Investigation. 99 (3), 391-395 (1997).
- Bohlen, T. M., et al. A short-day photoperiod delays the timing of puberty in female mice via changes in the kisspeptin system. Frontiers in Endocrinology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
- Shahab, M., Mastronardi, C., Seminara, S. B., Crowley, W. F., Ojeda, S. R., Plant, T. M. Increased hypothalamic GPR54 signaling: A potential mechanism for initiation of puberty in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2005).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, 5-9 (2016).
- Navarro, V. M., et al. Role of Neurokinin B in the Control of Female Puberty and Its Modulation by Metabolic Status. Journal of Neuroscience. 32 (7), 2388-2397 (2012).
- Hoffmann, H. M., Tamrazian, A., Xie, H., Pérez-Millán, M. I., Kauffman, A. S., Mellon, P. L. Heterozygous deletion of ventral anterior homeobox (Vax1) causes subfertility in mice. Endocrinology. 155 (10), 4043-4053 (2014).
- Kauffman, A. S., et al. The Kisspeptin Receptor GPR54 Is Required for Sexual Differentiation of the Brain and Behavior. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8826-8835 (2007).
- Teles, M. G., et al. Brief report: A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty. New England Journal of Medicine. , (2008).
- Korenbrot, C. C., Huhtaniemi, I. T., Weiner, R. I. Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biology of reproduction. , (1977).
- Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: The puberty ovarian maturation score (Pub-Score). Scientific Reports. 7 (March), 1-11 (2017).
- Caligioni, C. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , 1-11 (2010).
- Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor -signaling in kisspeptin neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22693-22698 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. (67), 4-9 (2012).
- Hedrich, H. The Laboratory Mouse. , Academic Press. (2012).
- Hoffmann, H. M., Trang, C., Gong, P., Kimura, I., Pandolfi, E. C., Mellon, P. L. Deletion of Vax1 from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Abolishes GnRH Expression and Leads to Hypogonadism and Infertility. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3506-3518 (2016).
- Sloboda, D. M., Howie, G. J., Pleasants, A., Gluckman, P. D., Vickers, M. H. Pre- and postnatal nutritional histories influence reproductive maturation and ovarian function in the rat. PLoS ONE. , (2009).
- Manual, R. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. Management. , (2007).
- Kennedy, G. C., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. The Journal of Physiology. , (1963).
- Sisk, C. L., Foster, D. L. The neural basis of puberty and adolescence. Nature Neuroscience. 7 (10), 1040-1047 (2004).
- Nelson, J. F., Karelus, K., Felicio, L. S., Johnson, T. E. Genetic influences on the timing of puberty in mice. Biology of reproduction. , (1990).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. , (1982).
- Falconer, D. S. Weight and age at puberty in female and male mice of strains selected for large and small body size. Genetical Research. , (1984).
- Rodriguez, I., Araki, K., Khatib, K., Martinou, J. C., Vassalli, P. Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of Bcl2. Developmental Biology. , (1997).
- Lomniczi, A., Wright, H., Ojeda, S. R. Epigenetic regulation of female puberty. Frontiers in Neuroendocrinology. 36, 90-107 (2015).
- Selmanoff, M. K., Goldman, B. D., Ginsburg, B. E. Developmental changes in serum luteinizing hormone, follicle stimulating hormone and androgen levels in males of two inbred mouse strains. Endocrinology. 100 (1), 122-127 (1977).
- Larder, R., Clark, D. D., Miller, N. L. G., Mellon, P. L. Hypothalamic Dysregulation and Infertility in Mice Lacking the Homeodomain Protein Six6. Journal of Neuroscience. 31 (2), 426-438 (2011).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number. Comparative Biochemistry and Physiology -- Part A: Physiology. 84 (1), 127-133 (1986).
- Chahoud, I., Paumgartten, F. J. R. Influence of litter size on the postnatal growth of rat pups: is there a rationale for litter-size standardization in toxicity studies. Environmental research. 109 (8), 1021-1027 (2009).
- Pandolfi, E. C., Hoffmann, H. M., Schoeller, E. L., Gorman, M. R., Mellon, P. L. Haploinsufficiency of SIX3 Abolishes Male Reproductive Behavior Through Disrupted Olfactory Development, and Impairs Female Fertility Through Disrupted GnRH Neuron Migration. Molecular Neurobiology. , (2018).
