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Biology

Bestimmung der reproduktive Kompetenz durch Bestätigung pubertären Beginn und Durchführung eines Fruchtbarkeit Assays bei Mäusen und Ratten

Published: October 13, 2018 doi: 10.3791/58352
Automatic Translation
1
1Department of Animal Science, Michigan State University

Summary

Viele Behandlungen und genetische Mutationen beeinflussen den Zeitpunkt der Geschlechtsreife und Fruchtbarkeit. Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Methode zur Evaluierung der pubertären Ausbruch bei Mäusen und Ratten vor der Einrichtung einer Fruchtbarkeit Studie bei geschlechtsreifen Tieren.

Abstract

Beurteilung der reproduktive Kompetenz ist entscheidend für das Verständnis der Wirkung einer Behandlung oder Genmanipulation auf der reproduktiven Achse, auch genannt die Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden Achse. Die reproduktiven Achse ist ein wichtiger Integrator von Umwelt- und internen Eingang Anpassung der Fruchtbarkeit zu günstigen Bedingungen für die Reproduktion. Vor dem Einschiffen auf einer Fruchtbarkeit Studie an Mäusen und Ratten, Geschlechtsreife wird ausgewertet, um die Möglichkeit auszuschließen, die durch die beobachteten reproduktiven Phänotypen entstehen verzögerte oder fehlende pubertären auftreten. Dieses Protokoll beschreibt einen nicht-invasive Ansatz um pubertäre auftreten bei Männern durch die Bestimmung der Präputial Trennung und bei Frauen durch vaginale Öffnung und erste Brunst zu beurteilen. Nach der Bestätigung der Abschluss der Pubertät und das Erreichen der Geschlechtsreife kann eine Fruchtbarkeit Studie initiiert werden. Das Verfahren beschreibt die optimale Brutbedingungen für Mäuse und Ratten, eine Fertilitätsstudie einrichten und welche Parameter zu beurteilen und festzustellen, ob die Behandlung oder gen Löschung auf die Fruchtbarkeit auswirkt.

Introduction

Der Übergang durch die Pubertät ist erforderlich, um die sexuelle Reife und reproduktive Kompetenz zu erreichen. Der pubertären Übergang und die Erhaltung der Fruchtbarkeit im Erwachsenenalter unterliegt der reproduktiven Achse, auch genannt die Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden Achse (Abbildung 1). Das Timing der pubertären Ausbruch und Wartung der Fruchtbarkeit ist durch interne als auch die ökologischen Faktoren erhöhen die Überlebenschancen der Nachkommen und Eltern1,2streng reguliert. Dieses Protokoll bietet einen nicht-invasive Ansatz ermitteln pubertären Ausbruch bei Mäusen und Ratten, Geschlechtsreife vor der Einrichtung einer Fruchtbarkeit Studie reproduktive Kompetenz beurteilen zu bestätigen.

Eine Fruchtbarkeit Studie ist bei geschlechtsreifen Tieren durchgeführt und kann eingeleitet werden, nachdem die Tiere Pubertät durchlaufen haben. Vor pubertären Ausbruch die reproduktiven Achse ist Ruhestrom und wesentliche Treiber der sexuellen Reifung, Gonadotropin – Releasing Hormon (GnRH), erscheint auf der Hypophyse in unzureichenden Mengen, Pubertät (Abbildung 1) zu initiieren. Pubertären Ausbruch ist ein komplexer Prozess, der zu erhöhten GnRH-Freisetzung in die mittlere Eminenz führt. GnRH fördert Luteinisierendes Hormon (LH) und Follikel-stimulierende (FSH) Hormonsekretion aus der Hypophyse, zwei Hormone, die wichtig für die Gonaden Reifung und reproduktive Funktion (Abbildung 1)3,4,5 .

Beleidigungen der reproduktiven Achse verminderte Fruchtbarkeit zur Folge und können auch vorab oder Verzögerung pubertären Ausbruch. Bekannt, dass das Timing der pubertären Ausbruch und reproduktive Kompetenz beeinflussen Bedingungen gehören die Exposition gegenüber Chemikalien6,7, erhöht/verringert Körper Gewicht1,8, Änderungen in der endokriner 2,Tag Länge9 und Genmutationen10,11,12,13,14,15.

Beginn der Geschlechtsreife ist ein entscheidender Schritt, die vor der Einrichtung einer Fruchtbarkeit Tests abgeschlossen werden muss. Die Vorteile pubertären Ausbruch durch Präputial Trennung, vaginale Öffnung und erste Brunst zu bestimmen sind die nicht-invasive Eigenschaften dieser Verfahren, da sie keine Blutentnahme oder Opfer der Tiere16, erfordern 17.

Nachdem pubertären Ausbruch festgelegt ist, korrekt Einrichten einer Fruchtbarkeit Studie liefern wichtige Informationen über die Integrität der reproduktiven Achse und hat in der Regel den zweiten Vorteil der Erzeugung von Versuchstieren auf ein weiterführendes Studium (Refinement) 18. die Fruchtbarkeit Studie Setup beschrieben in diesem Protokoll kann kleinere und größere Defizite in reproduktive Kompetenz in Männchen und Weibchen erkennen. Wichtige Parameter ausgewertet sind (1) Zeit, der erste Wurf, 2) Anzahl der Würfe, die in einem bestimmten Zeitrahmen und 3) Wurf Größe erzeugt. Schließlich gehören Empfehlungen für die Art der Follow-up-Studien, die durchgeführt werden, um die Ursache der Beeinträchtigung der Fruchtbarkeit zu identifizieren.

Das beschriebene Protokoll bezieht sich auf Mäuse und repräsentativen Daten spiegeln Arbeit in transgenen Mäusen. Jedoch sind alle enthalten Protokolle gleichermaßen gültig bei Ratten.

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Protocol

Alle hier beschriebene Verfahren wurden genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Ausschuss der Michigan State University und gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

1. bestimmen Sie pubertären Ausbruch

  1. Institutionellen Richtlinien für Bekleidung, auf ein Minimum, ist es notwendig, einen sauberen Laborkittel und saubere Handschuhe zu tragen. Handhaben Sie Mäuse mit sauberen Handschuhen.
  2. Bereiten Sie den Arbeitsbereich indem er eine Pad auf den Tisch.
    1. Legen Sie eine sauberes Maus Käfig-Spitze mit dem Gitter nach oben auf dem Pad.
    2. Einrichten einer Skala im Arbeitsbereich. Stellen Sie eine saubere 500 – 1000 mL-Becherglas auf das Ausmaß und die Tara.
    3. Legen Sie ein Blatt neben den Arbeitsbereich Rekord Körpergewicht und Präputial Trennung, vaginale Öffnung oder erste Brunst.
  3. Identifizieren Sie die Mäuse für die Studie. Führen Sie tägliche Inspektionen für pubertären Ausbruch bis Pubertät erreicht ist. Durchzuführen Sie die Inspektion zur gleichen Zeit des Tages während der gesamten Studie. Pubertären Ausbruch kann früh postnatale Tag 11-12-19, auftreten, beginnt jedoch in die meisten Versuchsaufbauten, pubertären Ausbruch Überwachung ~ 22 Tage.
  4. Platzieren Sie die Maus Käfig im Arbeitsbereich (Schritt 1.2). Öffnen Sie den Käfig und legen Sie Deckel, Trinkflasche und Halter Lebensmittel auf den Tisch.
  5. Bestimmung der Präputial Trennung bei männlichen Mäusen.
    1. Halten Sie die Maus am Schwanz, legen Sie es auf die saubere Maus Käfig-Spitze aus Schritt 1.2.1. Halten Sie sanft auf das Heck, lassen Sie die Maus zu erkunden das Raster der Käfig-Spitze für ~ 5 s.
    2. Ziehen Sie vorsichtig die Rute nach hinten; Dies führt in der Regel das Tier beim Festhalten an das Netz mit seinen Vorderbeinen voran. Ansatz der anderen Hand die Haut in der Nähe der Hals und die Ohren.
    3. Fassen Sie die lose Haut zwischen den Schultern und Nacken mit Daumen und Zeigefinger. Es ist wichtig, einen guten Halt der Haut zu erhalten, wie es die Maus verhindern, drehen den Kopf um zu beißen.
    4. Greifen Sie die Haut auf dem Rücken mit den restlichen Fingern und halten Sie ihn durch Drücken gegen die Hand. Festhalten Sie, ohne zu behindern, Atmung, Blut fließen oder schädliche Knochen, Muskeln oder Haut. Drehen Sie die Hand um den Bauch der Maus, freizulegen und unterstützen den Rücken von der Maus in die Handfläche.
    5. Mit der freien Hand sanft zurückschieben der Haut rund um den Penis ohne zu zwingen. Präputial Trennung gleitet die Präputial Haut rückwärts Freilegung der Eichel (Abb. 2A, Pfeil zeigt Präputial Trennung). Das Vorhandensein oder Fehlen der Präputial Trennung aufzeichnen.
    6. Wiegen Sie die Maus durch sanftes auflegen es in 500-1000 mL-Becherglas aus Schritt 1.2.2 und nehmen Sie das Gewicht.
    7. Wiedereinführung der Maus in das Gehäuse Käfig durch die Becher 0-2 cm über den Boden halten und langsam kippen den Becher, so dass die Maus um auf seine eigenen zu verlassen. Reinigen Sie das Becherglas mit Wasser und einem milden Reinigungsmittel und trocknen Sie es ab, bevor er es auf das Ausmaß und die Waage Tarieren.
  6. Bestimmung der Scheideneingang bei weiblichen Mäusen.
    1. Legen Sie einen Wattebausch, Becher und eine Flasche steriles Wasser im Arbeitsbereich (Schritt 1.2). Gießen Sie das Wasser in den Becher. Befeuchten Sie den Wattebausch mit sterilem Wasser und legen Sie sie neben dem Käfig-Spitze aus Schritt 1.2.1.
    2. Platzieren Sie die Maus Käfig im Arbeitsbereich (Schritt 1.2) und übertragen Sie die Maus aus seinem Hause Käfig zu Käfig-Spitze (Schritt 1.2.1) indem Sie es an der Unterseite der Rute halten. Ziehen Sie vorsichtig wieder die Rute um eine Vorwärtsbewegung der Maus zu fördern.
    3. Heben Sie das Heck während die Hüften mit den freien Fingern zu unterstützen. Lassen Sie die Hinterbeine in Kontakt mit der Spitze des Käfigs stehen. Wenn die Maus zu viel bewegt, halten Sie ihn in der Hand wie in 1.5.1-1.5.4 Schritten beschrieben.
    4. Sanft Reinigen der Vulva mit dem Wasser befeuchteten Wattebausch ab Schritt 1.6.1. Verwenden Sie einen sauberen befeuchteten Wattebausch für jede Maus. Vaginale Öffnung zu bestimmen, untersuchen die Vulva, festzustellen, ob die Vagina völlig offen ist (Abbildung 2A, weibliche vaginale Öffnung).
    5. Nehmen Sie auf, wenn vaginale Öffnung aufgetreten ist. Wiegen Sie die Maus und schicken Sie es an die Heimat Käfig beschriebenen Schritte 1.5.6-1.5.7.
  7. Erste Brunst ein Indikator für die ersten Eisprung.
    1. Stellen Sie einen Becher mit sterilem Wasser, einen beschrifteten Objektträger und 200 µL Pipette mit einer sauberen Spitze im Arbeitsbereich (Schritt 1.2).
    2. Halten Sie das Weibchen wie in Schritt 1.6.2-1.6.3 beschrieben. Setzen Sie die PIPETTENSPITZE mit ~ 50 µL steriles Wasser auf die vaginale Öffnung.
    3. Spülen Sie sanft die Zellen aus der Scheidenwand durch die Einführung und normalisieren ~ 50 µL Wasser 2-4 mal. Schmieren Sie den Inhalt aus der Pipettenspitze auf einen beschrifteten Glas-Objektträger.
    4. Beobachten Sie aufmerksam die zelluläre Morphologie auf dem Hellfeld-Mikroskop mit einem 10 X oder 20 X Objektiv oder lassen Sie den Abstrich Airdry für ~ 1 h und dann gegenfärbung mit 0,1 % Methylenblau-Lösung (aufgelöst in DdH2O) (Abb. 2 b). Um gegenfärbung, Tauchen die getrocknete Folie in die 0,1 % Methylenblau-Lösung für ~ 30 s. Lassen Sie die Folie der Luft für 1 h trocknen.
    5. Beobachten Sie die Folien aus Schritt 1.7.4 auf dem Hellfeld-Mikroskop 10 X oder 20 X. Richten Sie die Phase des Estrous Zyklus (Abb. 2 b)20 durch die Beobachtung der Zellmorphologie, die es erlaubt, um die vier Phasen des Estrous Zyklus (Abb. 2 b) zu unterscheiden.
      Hinweis: Metestrus zeichnet sich durch eine Mischung aus verhornten plattenepithelzellen Epithelzellen und Leukozyten, Diestrus von Leukozyten, Proestrus durch eine Mischung von Leukozyten und kernhaltigen Epithelzellen und Brunst von verhornten Epithelzellen (Abb. 2 b) 20.
    6. Zeichnen Sie das Körpergewicht und zurückkehren Sie die Maus zu seinem Hause Käfig, beschriebenen Schritte 1.5.6-1.5.7. Vaginaler Abstrich werden am Tag beendet, wenn die Maus seine erste Brunst (Abbildung 2 b hat).

(2) wünschenswert Zimmer Deckbedingungen

  1. Sicherzustellen, dass die Zucht-Zimmer verfügt über eine Temperatur von ~ 20-24 ° C, mit 55 ± 10 % Luftfeuchtigkeit und homogenen Raum Licht mit einer Intensität von ~ 300-400 Lux ca. 1 m über dem Boden21. Diese Lichtstärke ermöglicht die wünschenswerte Mid Käfig Lichtintensität von 25-80 Lux. Um die Lichtintensität zu testen, verwenden Sie einen Belichtungsmesser.
  2. Verwenden Sie ein automatisiertes System zur Steuerung der Beleuchtung in den Brutraum zum geeigneten Zeitpunkt der Beleuchtung während des Experiments zu gewährleisten. Die Dauer des Tages Optimalbedingungen Fruchtbarkeit bei Nagetieren Palette von 12 h am Tag (12 h Licht und 12 Stunden Dunkelheit, LD12:12), zu "sommerlich" Bedingungen mit 14 h Licht und 10 h Dunkelheit (LD14:10)21bewerten.
  3. Bereiten Sie Zucht Käfige.
    1. Bereiten Sie einen sauberen Maus Käfig mit Deckel, Wasser, Lebensmittel, Bettwäsche und pro Brutpaar nisten.
    2. Füllen Sie die Käfig-Karten mit allen erforderlichen Informationen, einschließlich Geschlecht, Geburtsdatum, Maus-Stamm und das Datum, wann die Paarung ist eingerichtet.

(3) Fruchtbarkeit Studie

  1. Identifizieren Sie die Tiere für die Fruchtbarkeit Studie verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass die Tiere geschlechtsreif (Schritt 1). Eine in der Regel verwendete Altersspanne zum Einrichten einer Fruchtbarkeit Studie an Mäusen ist 10-16 Wochen alt, ein Alter, wo sexuelle Reifung in die experimentellen Bedingungen abgeschlossen hat.
  2. Legen Sie auf einen sauberen Tisch den Zucht-Käfig im Schritt 2.3 vorbereitet.
  3. Fangen Sie und halten Sie die Maus.
    1. Langsam einführen einer behandschuhten Hand in den Käfig Maus. Lassen Sie die Hand in den Käfig für eine kurze Zeit (~ 5-30 s), so dass die Mäuse zur Anpassung an den Geruch der Handschuh und Hand. Vermeiden Sie hektische und ruckartige Bewegungen.
    2. Senken Sie die hohle Hand nah an dem Boden des Käfigs und nähern Sie langsam um die Mäuse zu. Sie Rennen Weg. Wenn sie über die Hand laufen, fangen Sie das Heck des Mausklick zwischen Daumen und Zeigefinger.
    3. Heben Sie die Maus am Schwanz für 2-3 s. Wenn die Maus länger gehalten werden muss, halten Sie die Rute und platzieren Sie den Mauszeiger in die hohle Hand, die Aufrechterhaltung der Halt am Heck.
  4. Transfer 1 männlich und danach 1 weiblichen in den Käfig Zucht halten, durch den Schweif (Schritt 3.3). Sicherstellen Sie, dass die Weibchen in der gleichen estrous Bühne beim Einrichten der Fruchtbarkeit-Assay. Bestimmen Sie die estrous Bühne der Weibchen durch einen vaginalen Abstrich durchführen, wie unter Schritt 1,7.
  5. Schließen Sie den Käfig, und sicherzustellen Sie, dass die Mäuse Futter, Wasser und Verschachtelung Material haben. Den Käfig-Kartenhalter mit Käfig-Karte an den Käfig anbringen.
  6. Legen Sie den Zucht-Käfig auf dem Rack Gehäuse. Lassen Sie die Zucht Käfig so ungestört wie möglich für die gesamte Dauer der Fruchtbarkeit Studie. Führen Sie die Fruchtbarkeit Studie für 30 Tage. Aufzeichnungen Sie für jedes Zuchtpaar ausführliche und notieren Sie (1) das Datum, das die Paarung eingerichtet ist, (2) das Datum, die Würfe geboren werden und (3) die Anzahl der Welpen geboren, einschließlich tot und Leben Welpen. Durchführen Sie Wurf-Prüfungen täglich während der gesamten Studie.
  7. Verlängern die Fruchtbarkeit Studie für eine zusätzliche 30-60 Tage, wenn keine oder eine schwache Auswirkung auf die Fruchtbarkeit ist Schritt 3.6 gegründet.

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Representative Results

Die vorgestellten Ergebnisse stammen aus zwei verschiedenen transgenen Mausmodellen wo die Transkription Faktor ventrale vordere Homeobox 1 (Vax1) im ganzen Körper auf einem Allel, hier bezeichnet als Heterozygote Mäuse (HET)13oder Vax1 gelöscht wurde bedingt innerhalb von GnRH Neuronen22, hier bezeichnet bedingte KO (cKO) gelöscht wurde. Vor der Einrichtung der Fruchtbarkeit Studie, ist es wichtig, pubertären Ausbruch in den Mäusen bestätigen.

Zunächst wurden die Tag und das Gewicht am Scheideneingang und Präputial Trennung gegründet. Bei den Mäusen HET vaginale Öffnung und Präputial Trennung ereignete sich um das gleiche Alter und Gewicht wie in der Kontroll-Mäusen (Abb. 3A und F, beziehungsweise). Im Gegensatz dazu vaginale Öffnung und Präputial Trennung waren deutlich verzögert in cKO Weibchen und Männchen und erhöhtes Körpergewicht zugeordnet (Abb. 3 b und G, beziehungsweise). Pubertären Ausbruch ist zu einem gewissen Grad mit Körpergewicht verbunden, und dies gilt besonders für Frauen23. Um festzustellen, ob die Verzögerung bei der Scheidenöffnung und Präputial Trennung mit einer Verzögerung bei der Gewichtszunahme verbunden war, wurde das Körpergewicht auf das Durchschnittsalter der Scheidenöffnung und Präputial Trennung in Steuerelementen (4,5 Wochen alt) auf das Körpergewicht in cKO bei Männern verglichen. und Frauen im Alter von 4,5 Wochen. Im Alter von 4,5 Wochen hatten weibliche Kontrollen und cKO vergleichbaren Körpergewicht (Abbildung 3), während cKO Männchen etwas schwerer als Steuerelemente (Abbildung 3 H) waren. Dies bedeutet, dass die Verzögerung bei der Scheidenöffnung und Präputial Trennung in cKO nicht mit einer Verzögerung bei der Gewichtszunahme verbunden ist.

Vaginale Öffnung ist ein früher Marker der sexuellen Reifung und erste Brunst ein Indikator, der den ersten Eisprung stattgefunden hat, eine Markierung über den Abschluss der Pubertät17. Um festzustellen, ob HET und cKO Weibchen erste Brunst im gleichen Alter und Gewicht als Steuerelemente erreichte, wurden täglich ab dem Tag des Scheideneingangs bis erste Brunst (Abbildung 3E und 3D) vaginalen Abstrich durchgeführt. Bei den Mäusen HET war erste Brunst und das Gewicht beim ersten Brunst vergleichbar zwischen Steuerelementen und HETs (Abbildung 3D). Im Gegensatz dazu cKO nicht den Estrous Zyklus durchlaufen und hatte keinen ersten Brunst im Alter von 80 Tagen (Abbildung 3E). Diese Verzögerung war nicht durch reduzierte Körpergewicht (Abbildung 3E).

Die HET Mäuse mit bestätigten pubertären Ausbruch wurden verwendet, um die Fruchtbarkeit Studie einrichten. Die Fruchtbarkeit-Assay wurde in 12 h Licht und 12 h dunklen Bedingungen (LD12:12) bei transgenen Mäusen auf C57BL/6J genetischen Hintergrund eingerichtet. Die Mäuse wurden im Alter von 10-16 Wochen zu Beginn des Experiments. Vier Gruppen von Mäusen wurden untersucht: Paarungen (WTxWT) zu kontrollieren, Steuern, Männchen mit HET Weibchen (WTxHET), HET Männchen mit WT-Weibchen (HETxWT) und HET Männchen mit HET Weibchen (HETxHET). Zunächst wurde die Anzahl der Würfe in 3 Monaten einen ermittelt. Kontrolle Paarungen (WTxWT) erzeugt durchschnittlich 2,8 Liter in 3 Monaten, die HET Männchen gepaart mit Kontrolle Weibchen (HETxWT Paarung, Abbildung 4A) vergleichbar war. HET Weibchen erzeugt, ob gepaart mit ein WT männlichen (Steuerung) oder eine männliche, HET deutlich weniger Würfe in der 3-Monats-Fruchtbarkeit-Studie enthüllt, dass HET Weibchen subfertilen13sind. Um die Bedeutung der Bestätigung pubertären Ausbruch vor der Einrichtung eines Fruchtbarkeit Assays zu veranschaulichen, wurde reproduktive Kompetenz bewertet bei cKO Mäusen, wo die Männchen war Präputial Trennung (Abbildung 3) verschoben und die Weibchen haben nicht ihre erste Brunst durch 80-Tage alt (Abbildung 3E). Die Fruchtbarkeit Studie wurde eingerichtet, > 1 Woche nach Männchen Präputial Trennung hatte und bei Frauen bei > 80 Tage alt. Während der 70 Tage Fruchtbarkeit Studie Kontrolle Paarungen erzeugt durchschnittlich 2,2 Würfe, während keine Würfe aus generiert wurden weibliche cKO gepaart mit einem WT-Mann oder das cKO Männchen gepaart mit einer Steuerung (WT) weiblich (Abbildung 4 b), zeigen, dass diese Mäuse sind unfruchtbar5,22.

Um die Fruchtbarkeit Phänotyp der HET Weibchen besser zu charakterisieren, verzeichneten wir die Anzahl der Tage, die es dauerte, bis um den ersten Wurf zu generieren. WTxWT Paarungen generiert ihren ersten Wurf in einem Durchschnitt von 22 Tagen (Abbildung 4), die war vergleichbar mit HET Männchen gepaart mit WT-Weibchen. HET Weibchen gepaart mit WT Männchen dauerte durchschnittlich 58 Tage, um ihren ersten Wurf zu produzieren, der ähnlich wie HETxHET Paarungen (Abbildung 4). Allerdings war die Verzögerung bei der Erzeugung der ersten Wurfes der HET Weibchen sehr heterogen, und verzögerte mehr in HETxHET Paarungen, schlägt ein semi-Penetranz des Phänotyps und einem Beitrag von HET Männer zu der subfertilität beobachtet in HETxHET Paarungen13 .

Bewertung der Wurfgröße kann wichtige Informationen über Eisprung/Einnistung und Sperma Produktion geben. Die durchschnittliche Größe von den ersten 3 Würfen wurde ermittelt. Interessanterweise alle Paarung Kombinationen (WTxHET, HETxWT, HETxHET) produziert deutlich kleinere Würfe im Vergleich zu Kontrollen (WTxWT, Abb. 4), zeigen, dass sowohl weibliche als auch männliche HET Mäuse subfertilen sind.

Figure 1
Abbildung 1: die Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden Achse steuert die Geschlechtsreife und Reproduktion. An der Spitze der reproduktiven Achse Neuronen des Hypothalamus Kisspeptin-Neuronen (gelbe Kreise) und Gonadotropin – Releasing Hormon (GnRH) (grüne Kreise). Kisspeptin-Neuronen loslassen in der juvenile Periode (präpubertären) wenig Kisspeptin auf GnRH Neuronen. Nach pubertären Ausbruch wird Kisspeptin Release auf GnRH Neuronen (post-pubertären) ergänzt. Erhöhten GnRH-Freisetzung in der Spätzeit der Jugendkriminalität steigt dramatisch Luteinisierendes Hormon (LH) und Follikel-stimulierende Hormon (FSH)-Freisetzung aus der Hypophyse führt zu Gonaden Reifung und reproduktive Funktion im Erwachsenenalter. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Ermittlung der pubertären Ausbruch bei Mäusen. Ein externer Marker pubertären Erkrankungsalter bei Mäusen ist Präputial Trennung (A) bei den Männern und vaginale Öffnung bei den Weibchen. Maßstabsleiste = 1 cm. (B) Beispielbilder von vaginalen Lavage zur Bestimmung der ersten Brunst. Folien für 30 counterstained waren s mit 0,1 % Methylenblau, luftgetrockneten und bei 20 X Vergrößerung beobachtet. Schwarze Pfeile zeigen kernhaltigen Epithelzellen, gelbe Pfeile mit schwarzer Umrandung zeigen Leukozyten und weißen Pfeile zeigen die verhornten Epithelzellen. Erste Brunst ereignete sich am 10. Tag nach vaginale Öffnung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Daten, die aus einer pubertären Ausbruch-Studie erzeugt werden können. (A, B) Vaginale Öffnung und Gewicht bei vaginale Öffnung in den transgenen Mausmodellen. (C) Gewicht 4,5 Wochen in Kontrolle und cKO Weibchen. (D, E) Alter und Gewicht beim ersten Brunst. (F, G) Alter und Gewicht bei Präputial Trennung. (H) Gewicht 4,5 Wochen in Kontrolle und cKO Männchen. Darstellung von Daten bedeutet ± SEM. N = 5-10 pro Gruppe, statistische Analyse des Schülers-t-Test. p< 0,01; p< 0,001. Diese Zahlen wurden von früheren Veröffentlichung13,22geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Analyse aus einer Fruchtbarkeit Studie von transgenen Mäusen. Fruchtbarkeit (A) Vax1 HET Mäuse und (B) cKO wurde durchgeführt in Jungfrau 10 bis 16 Wochen alten Mäusen und die Anzahl der Würfe in der angegebenen Zeiträume aufgezeichnet. Daten stellen Mittel ± SEM statistische Analyse durch einfache ANOVA gefolgt von Dunnett mehrere Vergleichstest durchgeführt wurde. * p< 0,05; p< 0,001. (C) die Anzahl der Tage, die ersten Wurf (n = 5-12), und (D) durchschnittlichen Wurfgröße von den ersten drei Würfen (n = 10-13) wurde ermittelt. Daten darstellen Mittel ± SEM statistische Analyse durch Schülers-t-Test im Vergleich zu WT erfolgte x WT *p< 0,05; p< 0,01. Diese Zahlen wurden von früheren Veröffentlichung13,22geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Einrichten eines Fruchtbarkeit-Assays. (A) Beispiel von Zucht-Schema und vorgeschlagene Anzahl von Tieren, die für eine Fruchtbarkeit Test erforderlich. Die Gesamtzahl der Tiere, die für eine Studie mit 2 Bedingungen erforderlich, wie z. B. ein Steuerelement im Vergleich zu KO oder Kontrolle Ernährung im Vergleich zu fettreiche Ernährung wo sich die Fruchtbarkeit bei Männern und Frauen bemisst ist: 2 Mäuse pro Paarung (1 Männchen x 1 weiblich) x 8 Tiere pro Gruppe 2 Bedingungen 2 Geschlecht s (auszuwertende sowohl weibliche als auch männliche Fruchtbarkeit) = insgesamt 64 Tiere pro Studie. Wenn die männliche und weibliche Fruchtbarkeit Studie parallel erfolgt, kann einen Satz von Kontrolle x Kontrolle Paarungen in der Regel dazu dienen, sowohl die Auswirkungen auf die männlichen und weiblichen Fortpflanzung zu vergleichen. (B) bei der Einrichtung einer Fruchtbarkeit-Assay, müssen die Mäuse verwendet sexuelle Reife erreicht haben. Verschiedene Stämme von Mäusen haben unterschiedliche reproduktiven Merkmale und erreichen die Geschlechtsreife bei unterschiedlichen Alters24. Für Informationen über Ratten siehe vorherige Veröffentlichung25. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Das allgemeine Wohlbefinden der Mäuse ist entscheidend für eine erfolgreiche Fruchtbarkeit Assay21. Wenn Sie eine Fruchtbarkeit Test durchführen, ist es wichtig, nicht physisch an den Mäusen täglich überprüfen, da dies zu Stress führen kann. Weitere häufige Käfig Änderungen zu vermeiden sind auch stressig. Im Idealfall werden Käfig Änderungen nicht mehr als 1-2 mal pro Woche erfolgen. Belichtung während der Dunkelphase wirkt sich negativ auf die Zucht in den nächtlichen Nagetieren. Lichter in den Brutraum in den dunklen Stunden nicht einschalten. Wenn Eintritt in das Zimmer in den dunklen Stunden erforderlich ist, verwenden Sie dim Rotlicht Beleuchtung. Ein weiterer Stressor ist das Vorhandensein von übermäßige Gerüche, Erschütterungen oder Lärm in das Vivarium für alle oder einen Teil der Studie. Um Stress zu lindern und Maus Wohlbefinden und Zucht zu verbessern, geben Sie die Mäuse nisten Material oder andere Arten der Bereicherung. Nestbau ist eine wichtige Verhalten bei Mäusen und Bruterfolg zu erhöhen. Die Nester können auch die Mäuse einen Platz zum verstecken und spielen. Gesunde und gut genährte Tiere Rasse gut, daher ist es wichtig, Ad Libitum Zugang zu qualitativ hochwertigen Lebensmitteln und Wasser. Wenn Brutpaare beginnen, zeigen Symptome der Krankheit, wie Dermatitis (häufig in C57BL/6J), zahnärztliche Zahnfehlstellung oder anderen schließen Sie aus, diese Mäuse aus der Studie. Darüber hinaus, wenn die Studie in immungeschwächte Mäuse durchgeführt wird, ist es entscheidend, dass die Maus-Zimmer sauber, Fruchtbarkeit zu erhalten gehalten ist.

Um eine Fruchtbarkeit Studie entsprechend einzurichten, ist es wichtig zu entscheiden, ob die Studie im jungfräulichen Mäuse erfolgt oder bewährte Züchter sowie sorgfältig wählen Sie die Mäuse für Kontrolle Paarungen verwendet. Kontrolle-Paarungen sollte parallel zu den experimentellen Züchter ausgeführt werden. Dies ist zwingend notwendig als unbekannt oder unvorhergesehene Stressoren und Veränderungen in der Umwelt kann Änderungen in der Zucht Rate. Kontrolle-Paarungen bestehen vorzugsweise aus Wurfgeschwister, die experimentellen Mäuse (Abb. 5A). Dies ist besonders wichtig, wenn die Fruchtbarkeit Studie an Mäusen mit gemischten genetischen Hintergrund aufgrund der großen Schwankungen in der Zucht Merkmale zwischen Mausstämme (Abb. 5 b) erfolgt.

Identifizierung eines subfertilität Phänotyps kann aufgrund der längeren Länge der Studie und die Notwendigkeit, zusätzliche Parameter analysieren schwierig sein, um seine Ursache zu offenbaren. Die HET Maus in den repräsentativen Daten ist ein gutes Beispiel für einen bescheidenen subfertilität Phänotyp (Abbildung 4), und die erweiterte Analyse erforderlich, um die männlichen subfertilität identifizieren. Wie in den Vertreter Ergebnisse (Abbildung 3 und 4) gezeigt, kann normaler Beginn der Pubertät (Abb. 3A, Dund F) sowohl weibliche als auch männliche subfertilität (Abbildung 4A, C, D zugeordnet werden ). In diesem Fall die Mäuse waren nur Sub fruchtbar, und damit die Länge der Studie wurde auf 120 Tage verlängert. Dies ist wichtig, da eine kürzere Fruchtbarkeit Studie (zB., 60 Tage) hätte nicht in der Lage, den Phänotyp zu offenbaren. Die männlichen subfertilität war bescheiden, und zuerst aufgedeckt wenn HET Männchen waren gepaart mit HET Weibchen, die waren auch subfertilen (Abb. 4A). In der Tat wurde der subfertilität HET Männchen bestätigt, bei der Bewertung der durchschnittlichen Größe der Würfe gezeugt (Abbildung 4). Follow-up Studien bestätigt die männlichen subfertilität und offenbart eine schlechte Spermienqualität der Männer HET mit ner ~ 80 % bewegliche Spermien13.

Beim Durchführen einer Fruchtbarkeit und pubertären Ausbruch bei Mäusen mit einer großen Verspätung im pubertären Ausbruch studieren (> 5 Tage), es ist wichtig, die verschiedenen Faktoren zu berücksichtigen, die pubertären Ausbruch26zu regulieren. Obwohl die vaginale Öffnung und erste Brunst in den meisten Fällen begleitend bei Ratten passieren, tritt erste Brunst bei Mäusen in der Regel ca. 10 Tage nach vaginale Öffnung25,27. Daher empfiehlt es sich, sicherzustellen, dass die vaginale Öffnung und erste Brunst niedergelassen sind, bei der Arbeit in Ratten und Mäusen18,28. Pubertären Ausbruch ist verbunden mit Stoffwechsellage und des Körpergewichts bei Frauen und zu einem geringen Teil im Männchen1,7,9,29, und als solche eine Behandlung oder eine genetische Mutation, die tierischen Wachstumsverlangsamung wird in einigen Fällen eine verzögerte pubertäre auftreten. Um festzustellen, ob die Verzögerung/Weiterentwicklung der pubertären Ausbruch schnelle/langsame Wachstum zugeordnet werden kann, ist es wichtig, die Mäusen täglich bei der Beurteilung der pubertären Ausbruch zu wiegen. Wie in Abbildung 3 b und C, sowie G und Hgesehen, die Verzögerung der pubertären Ausbruch war nicht verbunden mit einem geringeren Körpergewicht, aber war eine wahre Verzögerung in pubertären auftreten, Gonaden Histologie und zirkulierenden Hormons bestätigt Level22. Eines der großen Einschränkungen bei der Verwendung von Präputial-Separation und vaginale Öffnung als Marker der pubertären Ausbruch ist, dass beide oft anders als schließlich im Laufe der Zeit durch Mechanismen geschehen werden eine erhöhte Aktivität der reproduktiven Achse18, 30 , 31 (Abbildung 1). Ein Beispiel hierfür ist die verzögerte vaginale Öffnung in die cKO-Weibchen (Abb. 3 b). Die cKO-Weibchen werden nie fruchtbar wegen fehlender Eisprung22 (Abbildung 3E). In der Tat zeigte weitere Studien Hormonspiegel und Gonaden Histologie der cKO Mäuse, dass diese Mäuse nie Pubertät abgeschlossen und unfruchtbar22 (Abbildung 4 b waren). Dies zeigt die Grenze der Verwendung externer Marker pubertären Ausbruch zu bestimmen. Abschluss der Pubertät und Geschlechtsreife erfordert erhöhte GnRH-Freisetzung und Aktivierung der reproduktiven Achse (Abbildung 1), und bestätigen Sie voll Geschlechtsreife Gonaden Morphologie und zirkulierenden Hormonspiegel müssen bewertet werden 22 , 31. in den Männern, Testosteron Messung und Bewertung der Samenblase und Hoden Morphologie und Größe neben der Qualität der Spermien werden bestätigen Pubertät war erreichten16,22,32. Bei Frauen wird die Messung von Progesteron und Östrogen Ebenen in Kombination mit Gebärmutter und Eierstöcke Gewicht und Morphologie der Abschluss der Pubertät17,19,22,33bestätigen.

Wurfgröße kann Schwangerschaft Länge und pubertäre Erkrankungsalter auswirken. Die meisten Mausstämme haben eine Tragzeit von 18-22 Tage. Jedoch, wenn die Mutter einen großen Wurf erwartet, tendenziell die Tragzeit reduzierte34,35. Auf der anderen Seite, wenn die Mutter einen vorherigen Wurf Krankenpflege ist, kann eine Verlängerung der gestational Periode5dadurch. Welpen in großen Würfen auch tendenziell pubertären Ausbruch verzögert haben. Dies wird verursacht durch ihr Wachstum leicht verspätet1,9,34,35. Wenn eine Fruchtbarkeit Studie durchgeführt wird und eines der Maus-Gruppen (Kontrolle oder experimentelle) produziert sehr große Würfe, es empfiehlt sich, Wurf Größen, auch genannt Keulung, so dass die untersuchten Würfe zu vergleichbare Größen haben zu homogenisieren.

Reproduktion kann nur beurteilt in Vivo durch die mehrere Organe beteiligt bei der Fortpflanzung (Abbildung 1) und die umfangreiche Feedback-Mechanismen zur Regulierung der reproduktiven Achse3. Bestimmte Aspekte der reproduktive Kompetenz können schnell durch eine vaginale einstecken Assay ausgewertet werden, wo die Kapazität der das Männchen das Weibchen zu montieren und lassen einen körperlichen Stecker in der Vagina13,36beobachtet wird. Obwohl dies ein sinnvoller Ansatz ist, männliche sexuelle Verhalten zu beurteilen, diese Art der Studie nicht die Erkennung von kleineren Problemen bei der Fortpflanzung erlaubt noch es beurteilt beibehalten Fruchtbarkeit für längere Zeit oder daraus resultierenden Wurfgröße und elterliche Verhalten. Das hier beschriebene Protokoll bietet zahlreiche Vorteile gegenüber einen einstecken-Assay, der Major wird die Fähigkeit, sowohl kleine als auch große Auswirkungen auf die reproduktive Kompetenz bei Männern und Frauen (Abbildung 4) zu identifizieren.

Fruchtbarkeit mit dem Alter abnimmt, und darüber hinaus der weiblichen Estrous Zyklus wird länger und unregelmäßiger während der Alterung5,28. Es wird daher empfohlen, starten eine Fruchtbarkeit Studie in jungen und Tiere geschlechtsreif. Eine in der Regel verwendete Altersspanne zum Einrichten einer Fruchtbarkeit Studie ist 10-16 Wochen alt. Allerdings ist es wichtig sich mit der reproduktiven Besonderheiten der Maus Belastung in der Studie verwendeten auskennen, da gibt es große Unterschiede bei der Fortpflanzung und Geschlechtsreife zwischen verschiedenen Maus oder Ratte-Stämme (Abbildung 5 b). Weitere Informationen über reproduktive Eigenschaften finden Sie in der JAX Maus Phenome Datenbank https://phenome.jax.org/. Durchführung einer längeren (> 4 Monate) Fruchtbarkeit Studie hat den Vorteil des Seins frühe reproduktive Rückgang zu erkennen, wo die Mäuse züchten normalerweise für die ersten 1-2 Monate des Assays Fruchtbarkeit könnte, aber dann haben einen frühe Rückgang bei der Fortpflanzung ab, bevor 6 Monate alt.

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Disclosures

Der Autor hat nichts preisgeben.

Acknowledgments

Ich danke die Autoren einen Beitrag an die erste Arbeit, die die Grundlage dieser Veröffentlichung ist. Dank Aitor Aguirre, Genevieve E. Ryan und Erica L. Schoeller für Hilfe bereitet das Manuskript. Vielen Dank Jessica Sora Lee und Austin Kinn für technische Hilfe mit dem Manuskript. H.M.H. wurde von Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & Human Development der National Institutes of Health unter Preis Anzahl R00HD084759 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile Cotton Balls Fisher 22456885
Surface protector Fisher 1420637
Light meter VWR 21800-014
Methylene blue  Sigma-Aldrich M9140
Microscope Slides Genesee Scientific 29-101
Optimouse rack with cages AnimalCare systems C89100
Water Bottle Basket  AnimalCare systems C61011
Filtered Cage Tops AnimalCare systems C78210
Optimice Standard Feeder AnimalCare systems C40100SG
Cage Card Holder AnimalCare systems C43251
Cage Cards AnimalCare systems M52010
Bottle Assambley AnimalCare systems C79122P
Bed R'Nest Nesting The Andersons BRN4WSR
1/8" Corn Cob bedding  The Andersons 8B
Standard mouse chow Teklad 7904 (7004)
Scale VWR 10205-004
Polypropylene Beaker Fisher 14-955-111F

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References

  1. Schneider, J. E. Energy balance and reproduction. Physiology and Behavior. 81 (2), 289-317 (2004).
  2. Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function. Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2012).
  3. Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, (2016).
  4. Kauffman, A. S. Sexual differentiation and the Kiss1 system: Hormonal and developmental considerations. Peptides. , (2009).
  5. Bronson, F. H., Dagg, C. P., Snell, G. D. Reproduction. , Dover Publications, Inc. New York. (1966).
  6. Chehab, F. F., Mounzih, K., Lu, R., Lim, M. E. Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin. Science. , (1997).
  7. Yoshimura, S., Yamaguchi, H., Konno, K., Ohsawa, N., Noguchi, S., Chisaka, A. Observation of Preputial Separation is a Useful Tool for Evaluating Endocrine Active Chemicals. J Toxicologic Pathology. 18, 141-157 (2005).
  8. Ahima, R. S., Dushay, J., Flier, S. N., Prabakaran, D., Flier, J. S. Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice. Journal of Clinical Investigation. 99 (3), 391-395 (1997).
  9. Bohlen, T. M., et al. A short-day photoperiod delays the timing of puberty in female mice via changes in the kisspeptin system. Frontiers in Endocrinology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
  10. Shahab, M., Mastronardi, C., Seminara, S. B., Crowley, W. F., Ojeda, S. R., Plant, T. M. Increased hypothalamic GPR54 signaling: A potential mechanism for initiation of puberty in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2005).
  11. Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, 5-9 (2016).
  12. Navarro, V. M., et al. Role of Neurokinin B in the Control of Female Puberty and Its Modulation by Metabolic Status. Journal of Neuroscience. 32 (7), 2388-2397 (2012).
  13. Hoffmann, H. M., Tamrazian, A., Xie, H., Pérez-Millán, M. I., Kauffman, A. S., Mellon, P. L. Heterozygous deletion of ventral anterior homeobox (Vax1) causes subfertility in mice. Endocrinology. 155 (10), 4043-4053 (2014).
  14. Kauffman, A. S., et al. The Kisspeptin Receptor GPR54 Is Required for Sexual Differentiation of the Brain and Behavior. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8826-8835 (2007).
  15. Teles, M. G., et al. Brief report: A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty. New England Journal of Medicine. , (2008).
  16. Korenbrot, C. C., Huhtaniemi, I. T., Weiner, R. I. Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biology of reproduction. , (1977).
  17. Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: The puberty ovarian maturation score (Pub-Score). Scientific Reports. 7 (March), 1-11 (2017).
  18. Caligioni, C. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , 1-11 (2010).
  19. Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor -signaling in kisspeptin neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22693-22698 (2010).
  20. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. (67), 4-9 (2012).
  21. Hedrich, H. The Laboratory Mouse. , Academic Press. (2012).
  22. Hoffmann, H. M., Trang, C., Gong, P., Kimura, I., Pandolfi, E. C., Mellon, P. L. Deletion of Vax1 from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Abolishes GnRH Expression and Leads to Hypogonadism and Infertility. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3506-3518 (2016).
  23. Sloboda, D. M., Howie, G. J., Pleasants, A., Gluckman, P. D., Vickers, M. H. Pre- and postnatal nutritional histories influence reproductive maturation and ovarian function in the rat. PLoS ONE. , (2009).
  24. Manual, R. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. Management. , (2007).
  25. Kennedy, G. C., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. The Journal of Physiology. , (1963).
  26. Sisk, C. L., Foster, D. L. The neural basis of puberty and adolescence. Nature Neuroscience. 7 (10), 1040-1047 (2004).
  27. Nelson, J. F., Karelus, K., Felicio, L. S., Johnson, T. E. Genetic influences on the timing of puberty in mice. Biology of reproduction. , (1990).
  28. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. , (1982).
  29. Falconer, D. S. Weight and age at puberty in female and male mice of strains selected for large and small body size. Genetical Research. , (1984).
  30. Rodriguez, I., Araki, K., Khatib, K., Martinou, J. C., Vassalli, P. Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of Bcl2. Developmental Biology. , (1997).
  31. Lomniczi, A., Wright, H., Ojeda, S. R. Epigenetic regulation of female puberty. Frontiers in Neuroendocrinology. 36, 90-107 (2015).
  32. Selmanoff, M. K., Goldman, B. D., Ginsburg, B. E. Developmental changes in serum luteinizing hormone, follicle stimulating hormone and androgen levels in males of two inbred mouse strains. Endocrinology. 100 (1), 122-127 (1977).
  33. Larder, R., Clark, D. D., Miller, N. L. G., Mellon, P. L. Hypothalamic Dysregulation and Infertility in Mice Lacking the Homeodomain Protein Six6. Journal of Neuroscience. 31 (2), 426-438 (2011).
  34. Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number. Comparative Biochemistry and Physiology -- Part A: Physiology. 84 (1), 127-133 (1986).
  35. Chahoud, I., Paumgartten, F. J. R. Influence of litter size on the postnatal growth of rat pups: is there a rationale for litter-size standardization in toxicity studies. Environmental research. 109 (8), 1021-1027 (2009).
  36. Pandolfi, E. C., Hoffmann, H. M., Schoeller, E. L., Gorman, M. R., Mellon, P. L. Haploinsufficiency of SIX3 Abolishes Male Reproductive Behavior Through Disrupted Olfactory Development, and Impairs Female Fertility Through Disrupted GnRH Neuron Migration. Molecular Neurobiology. , (2018).

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Biologie Ausgabe 140 pubertären Ausbruch Fruchtbarkeit Assay reproduktive Kompetenz Präputial Trennung vaginale Öffnung erste Brunst Maus Nager Ratte männlich weiblich Körpergewicht
Bestimmung der reproduktive Kompetenz durch Bestätigung pubertären Beginn und Durchführung eines Fruchtbarkeit Assays bei Mäusen und Ratten
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Hoffmann, H. M. Determination of… More

Hoffmann, H. M. Determination of Reproductive Competence by Confirming Pubertal Onset and Performing a Fertility Assay in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (140), e58352, doi:10.3791/58352 (2018).

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