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Biology

Pubertal शुरुआत की पुष्टि करके प्रजनन क्षमता का निर्धारण और चूहों और चूहों में एक प्रजनन परख प्रदर्शन

Published: October 13, 2018 doi: 10.3791/58352
Automatic Translation
1
1Department of Animal Science, Michigan State University

Summary

कई उपचार और आनुवंशिक उत्परिवर्तनों यौन परिपक्वता और प्रजनन क्षमता के समय को प्रभावित । यह प्रोटोकॉल एक गैर इनवेसिव विधि का वर्णन करने के लिए चूहों और चूहों में pubertal शुरुआत का मूल्यांकन करने से पहले यौन परिपक्व जानवरों में एक प्रजनन अध्ययन की स्थापना ।

Abstract

प्रजनन क्षमता का आकलन एक उपचार या प्रजनन धुरी पर आनुवंशिक हेरफेर के प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, यह भी हाइपोथैलेमस-पिट्यूटरी-जननांगों धुरी पद । प्रजनन धुरी पर्यावरण और आंतरिक इनपुट प्रजनन के लिए अनुकूल परिस्थितियों को प्रजनन क्षमता के अनुकूल एक प्रमुख घालमेल है । चूहों और चूहों में एक प्रजनन अध्ययन पर तैयार करने से पहले, यौन परिपक्वता संभावना है कि मनाया प्रजनन phenotypes देरी या अनुपस्थित pubertal शुरुआत के कारण होते हैं बाहर करने के लिए मूल्यांकन किया जाता है. इस प्रोटोकॉल preputial जुदाई के निर्धारण के माध्यम से पुरुषों में pubertal शुरुआत का आकलन करने के लिए एक गैर इनवेसिव दृष्टिकोण का वर्णन, और महिलाओं में योनि खोलने और पहली मद के माध्यम से. यौवन के पूरा होने और यौन परिपक्वता की उपलब्धि की पुष्टि के बाद, एक प्रजनन अध्ययन शुरू किया जा सकता है । प्रक्रिया चूहों और चूहों के लिए इष्टतम प्रजनन शर्तों का वर्णन करता है, कैसे एक प्रजनन अध्ययन स्थापित करने के लिए, और क्या मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए और निर्धारित अगर उपचार या जीन विलोपन प्रजनन क्षमता पर एक प्रभाव है.

Introduction

यौवन के माध्यम से संक्रमण यौन परिपक्वता और प्रजनन क्षमता प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । pubertal संक्रमण और वयस्कता में प्रजनन क्षमता के रखरखाव प्रजनन धुरी द्वारा विनियमित है, यह भी हाइपोथैलेमस-पिट्यूटरी-जननांगों अक्ष (चित्रा 1) का कार्यकाल । pubertal शुरुआत और प्रजनन क्षमता के रखरखाव के समय कसकर के रूप में अच्छी तरह से आंतरिक पर्यावरणीय कारकों के वंश और माता पिता1,2के अस्तित्व की संभावना को बढ़ाने के द्वारा विनियमित है । यह प्रोटोकॉल एक गैर इनवेसिव दृष्टिकोण को चूहों और चूहों में pubertal शुरुआत का निर्धारण करने के लिए प्रजनन क्षमता का आकलन करने के लिए एक उर्वरता अध्ययन स्थापित करने से पहले यौन परिपक्वता की पुष्टि प्रदान करता है ।

एक प्रजनन अध्ययन यौन परिपक्व जानवरों में किया जाता है और जानवरों के यौवन के माध्यम से चला गया है के बाद शुरू किया जा सकता है । pubertal शुरुआत करने से पहले, प्रजनन अक्ष quiescent है, और यौन परिपक्वता के प्रमुख चालक, गोनॉडोट्रॉफिन रिलीज हार्मोन (GnRH), अपर्याप्त मात्रा में पिट्यूटरी पर जारी करने के लिए यौवन शुरू (चित्रा 1) है । Pubertal शुरुआत एक जटिल प्रक्रिया है कि औसत उभार में वृद्धि हुई GnRH रिलीज में परिणाम है । GnRH को बढ़ावा देता है luteinizing हार्मोन (LH) और कूप उत्तेजक हार्मोन (FSH) पिट्यूटरी से स्राव, दो हार्मोन जननांगों परिपक्वता और प्रजनन समारोह के लिए आवश्यक (चित्रा 1)3,4,5 .

कम प्रजनन क्षमता में प्रजनन अक्ष परिणाम को अपमान और भी अग्रिम या pubertal शुरुआत में देरी कर सकते हैं । pubertal शुरुआत और प्रजनन क्षमता के समय को प्रभावित करने के लिए जाना जाता शर्तों के अंत में स्रावी बाधित रसायन6,7, वृद्धि हुई/कमी शारीरिक वजन1,8, में परिवर्तन के लिए जोखिम शामिल दिन की लंबाई2,9 और आनुवंशिक उत्परिवर्तनों10,11,12,13,14,15।

यौन परिपक्वता की शुरुआत एक महत्वपूर्ण कदम है कि जरूरत है एक प्रजनन परख स्थापित करने से पहले पूरा हो गया है । preputial जुदाई, योनि खोलने और पहली मद के माध्यम से pubertal शुरुआत का निर्धारण करने के फायदे, इन प्रक्रियाओं के गैर इनवेसिव विशेषताएं हैं, के रूप में वे रक्त संग्रह या पशु16 के बलिदान की आवश्यकता नहीं है, 17. शी.

pubertal शुरुआत के बाद निर्धारित किया जाता है, सही ढंग से एक प्रजनन अध्ययन की स्थापना प्रजनन अक्ष की अखंडता के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करेगा, और आम तौर पर आगे के अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक पशु पैदा करने का दूसरा लाभ है (शोधन) 18. प्रजनन अध्ययन सेटअप इस प्रोटोकॉल में वर्णित पुरुषों और महिलाओं में प्रजनन क्षमता में दोनों मामूली और बड़े घाटे का पता लगा सकते हैं । मूल्यांकन किया गया मुख्य पैरामीटर 1) पहले कूड़े के लिए समय, 2) एक निश्चित समय सीमा और 3) कूड़े के आकार में उत्पंन कूड़े की संख्या शामिल हैं । अंत में, अध्ययन का पालन करें जो प्रजनन क्षमता के कारण की पहचान करने के लिए आयोजित किया जा सकता है के प्रकार के लिए सिफारिशें शामिल हैं ।

वर्णित प्रोटोकॉल चूहों को संदर्भित करता है और प्रतिनिधि डेटा ट्रांसजेनिक चूहों में किया काम को प्रतिबिंबित. हालांकि, सभी शामिल प्रोटोकॉल चूहों में समान रूप से मान्य हैं.

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Protocol

सभी तरीकों यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और मिशिगन राज्य विश्वविद्यालय के उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है और देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के अनुसार आयोजित की ।

1. निर्धारित Pubertal शुरुआत

  1. कपड़ों के लिए संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन करें, कम से कम, यह एक साफ प्रयोगशाला कोट और साफ दस्ताने पहनना आवश्यक है । हमेशा साफ दस्ताने पहने चूहों संभाल ।
  2. मेज पर एक पैड रखकर कार्य क्षेत्र तैयार करें ।
    1. पैड पर ऊपर की ओर का सामना करना पड़ ग्रिड के साथ एक साफ माउस पिंजरे शीर्ष प्लेस ।
    2. कार्य क्षेत्र में स्केल सेट करें । एक साफ ५०० – १००० एमएल यूरिन स्केल और बारदाना पर लगाएं ।
    3. शरीर के वजन और preputial जुदाई, योनि खोलने या पहली मद रिकॉर्ड करने के लिए कार्य क्षेत्र के बगल में एक चादर रखें ।
  3. अध्ययन के लिए चूहों की पहचान करें । pubertal शुरुआत के लिए दैनिक निरीक्षण प्रदर्शन जब तक यौवन तक पहुंच जाता है । अध्ययन भर में दिन के एक ही समय में निरीक्षण करते हैं । Pubertal शुरुआत के रूप में जन्मोत्तर दिन 11-1219के रूप में जल्दी हो सकता है, तथापि, सबसे प्रयोगात्मक setups में, Pubertal शुरुआत निगरानी ~ 22 दिनों में शुरू होता है ।
  4. कार्य क्षेत्र (चरण १.२) में माउस पिंजरे रखें । पिंजरे खोलने के लिए और मेज पर ढक्कन, पानी की बोतल और भोजन धारक जगह है ।
  5. पुरुष चूहों में preputial जुदाई का निर्धारण.
    1. जबकि पूंछ द्वारा माउस पकड़, यह कदम 1.2.1 से साफ माउस पिंजरे शीर्ष पर जगह है । जबकि धीरे पूंछ पर पकड़े, चलो माउस ~ 5 एस के लिए पिंजरे शीर्ष के ग्रिड का पता लगाने ।
    2. धीरे से पूंछ को पीछे खींचो; इस जानवर में आम तौर पर परिणाम आगे बढ़ रहा है, जबकि अपने forelegs के साथ ग्रिड पर पकड़े । गर्दन और कान से त्वचा बंद करने के लिए दूसरे हाथ दृष्टिकोण ।
    3. अंगूठे और तर्जनी के साथ कंधे और गर्दन के बीच ढीली त्वचा को समझ । यह त्वचा की एक अच्छी पकड़ पाने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में इसे काटने के लिए अपने सिर के आसपास मोड़ से माउस को रोकने जाएगा ।
    4. शेष उंगलियों के साथ पीठ पर त्वचा को पकड़ो और यह हाथ के खिलाफ दबाकर पकड़ । निरोधक श्वास, रक्त प्रवाह, या हानिकारक हड्डियों, मांसपेशियों या त्वचा के बिना दृढ़ता से पकड़ो । हाथ बारी के लिए माउस के पेट बेनकाब, जबकि हाथ की हथेली के भीतर माउस के पीछे का समर्थन ।
    5. मुक्त हाथ के साथ, धीरे मजबूर बिना लिंग के आसपास त्वचा वापस धक्का । preputial जुदाई में, preputial त्वचा की स्लाइड्स पीछे मुंड लिंग को उजागर (चित्रा 2a, preputial जुदाई दिखा तीर) । उपस्थिति या preputial जुदाई की अनुपस्थिति रिकॉर्ड ।
    6. धीरे से वजन 500-1000 मिलीलीटर चोंच में यह कदम 1.2.2 से रखने और वजन रिकॉर्ड माउस ।
    7. पिंजरे फर्श पर चोंच 0-2 सेमी पकड़ और धीरे से अपने आप को बाहर निकलने के लिए माउस की अनुमति चोंच पर टिप से आवास पिंजरे में माउस को फिर से शुरू । पानी और हल्के डिटर्जेंट के साथ यूरिन को साफ करें और उसे स्केल पर लौटने से पहले सुखा लें और स्केल टारिंग ।
  6. मादा चूहों में योनि खोलने का निर्धारण.
    1. एक कॉटन बॉल, यूरिन और काम के क्षेत्र में बाँझ पानी की एक बोतल (स्टेप १.२) लगाएं. चोंच में पानी डाल दें. कपास की गेंद को बाँझ पानी के साथ Humidify और उसे स्टेप 1.2.1 से केज टॉप के बगल में रखें ।
    2. काम के क्षेत्र (चरण १.२) में माउस पिंजरे प्लेस और अपने घर पिंजरे से पिंजरे शीर्ष (कदम 1.2.1) के लिए यह पूंछ के आधार पर पकड़ से माउस हस्तांतरण । धीरे वापस पूंछ खींचने के लिए माउस के आगे आंदोलन को प्रोत्साहित करते हैं ।
    3. पूंछ लिफ्ट जबकि मुक्त उंगलियों के साथ कूल्हों का समर्थन । hindlimbs पिंजरे के शीर्ष के साथ संपर्क बनाए रखने के लिए अनुमति देते हैं । यदि माउस बहुत अधिक चलता है, तो इसे हाथ में धारण करें जैसा कि चरण 1.5.1-1.5.4 में बताया गया है.
    4. धीरे चरण 1.6.1 से पानी humidified कपास की गेंद के साथ योनी साफ । प्रत्येक माउस के लिए एक स्वच्छ humidified कपास गेंद का उपयोग करें । योनि खोलने का निर्धारण करने के लिए, योनी की जांच और योनि पूरी तरह से खुला है कि क्या निर्धारित (चित्रा 2a, महिला योनि खोलने).
    5. रिकार्ड अगर योनि खोलने हुई है । माउस तौलना और यह घर पिंजरे में वापसी के रूप में कदम 1.5.6-1.5.7 में वर्णित है ।
  7. पहले ovulation के एक संकेतक मद ।
    1. बाँझ पानी के साथ एक चोंच प्लेस, एक लेबल ग्लास स्लाइड और एक २०० µ एल पिपेट कार्य क्षेत्र (चरण १.२) में एक साफ टिप के साथ ।
    2. कदम 1.6.2-1.6.3 में वर्णित के रूप में महिला पकड़ो । योनि खोलने पर बाँझ पानी की ~ ५० µ एल युक्त पिपेट के टिप प्लेस ।
    3. धीरे से शुरू करने और अवशोषित से योनि दीवार से कोशिकाओं को फ्लश ~ ५० पानी की µ एल 2-4 बार । एक लेबल कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड पर पिपेट टिप से सामग्री धब्बा.
    4. ध्यान से एक 10x या 20X उद्देश्य का उपयोग कर एक brightfield माइक्रोस्कोप पर सेलुलर आकृति विज्ञान का पालन या ~ 1 ज के लिए धब्बा airdry और फिर एक ०.१% methylene नीले समाधान के साथ counterstain (ddH में भंग2हे) (चित्रा २ बी). counterstain करने के लिए, ०.१% methylene नीले समाधान में सूखे स्लाइड डुबकी ~ 30 एस के लिए । 1 h के लिए स्लाइड हवा को सूखने दें ।
    5. 10x या 20X पर एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप पर कदम 1.7.4 से स्लाइड का निरीक्षण । सेल आकृति विज्ञान जो मद चक्र (चित्रा बी) के चार अलग चरणों में भेद करने की अनुमति देता है अवलोकन द्वारा मद चक्र (चित्रा बी)20 के मंच की स्थापना ।
      नोट: Metestrus cornified स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं और ल्यूकोसाइट्स के मिश्रण की विशेषता है, diestrus द्वारा ल्यूकोसाइट्स, proestrus ल्यूकोसाइट्स और nucleated उपकला कोशिकाओं के मिश्रण द्वारा, और मद उपकला कोशिकाओं (चित्रा बी. 20।
    6. शरीर के वजन रिकॉर्ड और कदम 1.5.6-1.5.7 में वर्णित के रूप में अपने घर पिंजरे में माउस वापस । योनि धब्बों दिन पर समाप्त कर रहे है जब माउस अपनी पहली मद (चित्रा बी) है ।

2. वांछनीय प्रजनन कमरे की स्थिति

  1. सुनिश्चित करें कि प्रजनन कक्ष ~ 20-24 ° c का तापमान है, ५५ ± 10% आर्द्रता के साथ, और समरूप कमरे की एक तीव्रता के प्रकाश ~ 300-400 लक्स21मंजिल ऊपर लगभग 1 मीटर. इस प्रकाश की तीव्रता वांछनीय मध्य पिंजरे 25-80 लक्स के प्रकाश की तीव्रता की अनुमति देता है । प्रकाश की तीव्रता का परीक्षण करने के लिए, एक प्रकाश मीटर का उपयोग करें ।
  2. प्रयोग के दौरान प्रकाश व्यवस्था के उपयुक्त समय को सुनिश्चित करने के लिए प्रजनन कक्ष में प्रकाश को नियंत्रित करने के लिए एक स्वचालित प्रणाली का उपयोग करें । एक 12 ज दिन (12 ज प्रकाश और 12 ज अंधकार, LD12:12) से कुतर में प्रजनन क्षमता का आकलन करने के लिए इष्टतम दिन-लंबाई की स्थिति, प्रकाश के 14 घंटे के साथ "गर्मी की तरह" शर्तों और 10 ज अंधेरे (LD14:10)21।
  3. प्रजनन पिंजरों तैयार करते हैं ।
    1. ढक्कन, पानी, भोजन, बिस्तर और प्रजनन जोड़ी प्रति घोंसले के साथ एक साफ माउस पिंजरे तैयार करते हैं ।
    2. सभी आवश्यक जानकारी के साथ पिंजरे कार्ड भरें, सेक्स, जंम तिथि, माउस तनाव, और जब संभोग की स्थापना की तारीख सहित ।

3. फर्टिलिटी अध्ययन

  1. प्रजनन अध्ययन के लिए इस्तेमाल की जाने वाली जानवरों की पहचान । सुनिश्चित करें कि जानवरों यौन परिपक्व (चरण 1) हैं । एक आम तौर पर इस्तेमाल उंर सीमा तक चूहों में एक प्रजनन अध्ययन की स्थापना की उंर के 10-16 सप्ताह है, एक उंर जहां यौन परिपक्वता सबसे प्रयोगात्मक परिस्थितियों में पूरा किया गया है ।
  2. एक साफ मेज पर, २.३ कदम में तैयार प्रजनन पिंजरे जगह है ।
  3. पकड़ो और माउस पकड़ो ।
    1. धीरे से माउस पिंजरे में एक दस्ताने हाथ परिचय । समय की एक छोटी अवधि (~ 5-30 s) के लिए पिंजरे में हाथ छोड़ दो, चूहों दस्ताने और हाथ की गंध के लिए अनुकूल करने के लिए अनुमति देता है । व्यस्त और मरोड़ते आंदोलनों से बचें ।
    2. cupped हाथ को पिंजरे के नीचे से नीचे की ओर कम करें और धीरे से चूहों के लिए यह दृष्टिकोण । वे भाग जाएंगे । जब वे हाथ पर चलाते हैं, अंगूठे और तर्जनी उंगली के बीच एक माउस की पूंछ जाल ।
    3. 2-3 एस के लिए पूंछ द्वारा माउस उठा । यदि माउस को अब आयोजित की जरूरत है, पूंछ पर पकड़ और cupped हाथ में पूंछ पर पकड़ बनाए रखने के माउस जगह है ।
  4. 1 पुरुष स्थानांतरण और उसके बाद 1 मादा प्रजनन पिंजरे में उंहें पूंछ द्वारा पकड़ द्वारा (३.३ कदम) । सुनिश्चित करें कि महिलाओं को एक ही मद चरण में है जब तक प्रजनन परख की स्थापना । १.७ चरण में वर्णित के रूप में एक योनि धब्बा प्रदर्शन करके महिलाओं के मद चरण का निर्धारण ।
  5. पिंजरे बंद करो, और यह सुनिश्चित करें कि चूहों भोजन, पानी और घोंसले में सामग्री है । पिंजरे के पिंजरे कार्ड के साथ पिंजरे कार्ड धारक संलग्न ।
  6. आवास रैक पर प्रजनन पिंजरे प्लेस । प्रजनन क्षमता अध्ययन की पूरी अवधि के लिए संभव के रूप में अबाधित पिंजरे छोड़ दें । 30 दिनों के लिए प्रजनन अध्ययन आचरण । प्रत्येक प्रजनन जोड़ी के लिए, विस्तृत रिकॉर्ड रखने और नोट 1) सहवास की तिथि निर्धारित की जाती है, 2) तिथि कूड़े का जन्म होता है और 3) मृत और सजीव पिल्लर सहित पिल्ले की संख्या पैदा होती है । पूरे अध्ययन में प्रतिदिन कूड़े की जांच करते हैं ।
  7. एक अतिरिक्त 30-60 दिनों के लिए प्रजनन अध्ययन लंबा यदि कोई या प्रजनन पर एक कमजोर प्रभाव ३.६ कदम में स्थापित है ।

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Representative Results

प्रस्तुत परिणाम दो अलग ट्रांसजेनिक माउस मॉडल जहां प्रतिलेखन कारक Ventral पूर्वकाल homeobox 1 (Vax1) एक एलील पर पूरे शरीर में नष्ट कर दिया गया है से हैं, यहां heterozygote चूहों (हेत)13, या Vax1 के रूप में संदर्भित है सशर्त GnRH ंयूरॉंस के भीतर हटा दिया गया है22, यहां कंडीशनल KO (cKO) । प्रजनन अध्ययन की स्थापना करने से पहले, यह सभी चूहों में pubertal शुरुआत की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है.

सबसे पहले, दिन और योनि खोलने और preputial जुदाई में वजन स्थापित किया गया । हेत चूहों में, योनि खोलने और preputial जुदाई नियंत्रण चूहों (चित्र 3 ए और एफ, क्रमशः) में के रूप में एक ही उम्र और वजन पर हुई । इसके विपरीत, योनि खोलने और preputial जुदाई cKO महिलाओं और पुरुषों में काफी देरी और वृद्धि हुई bodyweight (चित्र बी और जी, क्रमशः) के साथ जुड़े थे । Pubertal शुरुआत कुछ शरीर के वजन के साथ जुड़े डिग्री के लिए है, और यह23महिलाओं में विशेष रूप से सच है । यह निर्धारित करने के लिए कि योनि खोलने में देरी और preputial जुदाई वजन में देरी के साथ जुड़ा हुआ था, योनि खोलने की औसत उम्र में शरीर के वजन और नियंत्रण में preputial जुदाई (उम्र के ४.५ सप्ताह) पुरुषों में cKO में शरीर के वजन की तुलना में था और उंर के ४.५ सप्ताह में महिलाओं । ४.५ सप्ताह की आयु में, महिला नियंत्रण और cKO था तुलनीय शरीर का वजन (आंकड़ा 3सी), जबकि cKO पुरुषों से थोड़ा भारी थे नियंत्रण (चित्रा 3H). यह इंगित करता है कि योनि खोलने में देरी और cKO में preputial जुदाई वजन बढ़ाने में देरी के साथ जुड़ा हुआ नहीं है ।

योनि खोलने के एक प्रारंभिक मार्कर है यौन परिपक्वता और पहले मद एक संकेत है कि पहले ovulation हुआ है, यौवन17के पूरा होने का एक मार्कर. अगर हेत और cKO मादा एक ही उम्र और नियंत्रण के रूप में वजन पर पहली मद पहुंच निर्धारित करने के लिए, योनि धब्बों पहले मद जब तक योनि खोलने के दिन से दैनिक प्रदर्शन किया गया (चित्रा 3E और 3 डी) । हेत चूहों में, पहले मद और पहले मद पर वजन नियंत्रण और हॅटस ऑफ (चित्रा 3 डी) के बीच तुलनीय था । इसके विपरीत cKO ने मद चक्र के माध्यम से प्रगति नहीं की और ८० दिन (चित्रा 3E) की आयु में प्रथम मद नहीं किया । इस देरी के कारण शरीर का वजन कम (फिगर 3E) नहीं था.

पुष्टि की pubertal शुरुआत के साथ हेत चूहों को प्रजनन अध्ययन स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया । प्रजनन परख 12 एच प्रकाश में स्थापित किया गया था और 12 एच अंधेरे शर्तों (LD12:12) ट्रांसजेनिक चूहों में एक C57BL/6J आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर । चूहों प्रयोग के प्रारंभ में 10-16 सप्ताह की आयु के थे । चूहों के चार समूहों का अध्ययन किया गया: नियंत्रण संभोग (WTxWT), हेत मादा के साथ नियंत्रण पुरुषों (WTxHET), WT महिलाओं के साथ हेत नर (HETxWT), और हेत पुरुषों के साथ हेत मादा (HETxHET). सबसे पहले 3 माह में उत्पन्न होने वाले कूड़े की संख्या का निर्धारण किया गया । नियंत्रण संभोग (WTxWT) 3 महीने में २.८ कूड़े के एक औसत उत्पंन है, जो हेत पुरुषों नियंत्रण महिलाओं (HETxWT संभोग, 4a आंकड़ा) के साथ युग्मित करने के लिए तुलनीय था । हेत मादा, चाहे एक WT पुरुष (नियंत्रण), या एक हेत पुरुष के साथ बनती है, 3 महीने प्रजनन अध्ययन में काफी कम कूड़े उत्पंन, खुलासा है कि हेत मादा13उपजाऊ हैं । की पुष्टि करने के महत्व pubertal शुरुआत से पहले एक प्रजनन परख स्थापित करने के लिए, प्रजनन क्षमता cKO चूहों में मूल्यांकन किया गया था, जहां पुरुषों preputial जुदाई में देरी थी (3 जी आंकड़ा) और महिलाओं को अपने पहले नहीं था मद द्वारा ८०-उंर के दिनों (चित्रा 3E) । प्रजनन अध्ययन स्थापित किया गया था > 1 सप्ताह के बाद पुरुषों preputial जुदाई थी, और महिलाओं में > 80 उंर के दिनों में । ७०-दिवसीय प्रजनन अध्ययन के दौरान, नियंत्रण सहवासों में औसतन २.२ लिटर उत्पन्न हुए, जबकि कोई भी कूड़े या तो cKO मादा को एक WT पुरुष के साथ युग्मित, या cKO पुरुष को एक नियंत्रण (WT) मादा (फिगर 4B) के साथ युग्मित किया गया था, दिखा रहा है कि ये चूहे ऊसर५,२२.

बेहतर करने के लिए हेत मादा की प्रजनन phenotype विशेषताएं, हम दिनों यह पहले कूड़े उत्पंन लिया की संख्या दर्ज की गई । WTxWT संभोग 22 दिन (चित्रा 4c), जो हेत पुरुषों WT महिलाओं के साथ युग्मित करने के लिए तुलनीय था की एक औसत में अपने पहले कूड़े उत्पंन । हेत मादा WT पुरुषों के साथ युग्मित ५८ दिनों के एक औसत लिया करने के लिए अपने पहले कूड़े, जो HETxHET संभोग (चित्रा 4c) के समान था उत्पादन । हालांकि, हेत मादा के पहले कूड़े पैदा करने में देरी बहुत heterogenous था, और HETxHET संभोग में अधिक देरी, phenotype के एक अर्द्ध penetrance का सुझाव है, और HETxHET संभोग में मनाया उपप्रजनन के लिए हेत पुरुष का योगदान13 .

कूड़े के आकार का मूल्यांकन ovulation/आरोपण और शुक्राणु उत्पादन के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी दे सकते हैं । पहले 3 लिटर का औसत आकार निर्धारित किया गया था । दिलचस्प है, सभी संभोग युग्म (WTxHET, HETxWT, HETxHET) काफी छोटे कूड़े का उत्पादन के रूप में नियंत्रण की तुलना में (WTxWT, चित्रा 4d), दिखा रहा है कि दोनों पुरुष और महिला हेत चूहों उपउपजाऊ हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: हाइपोथैलेमस-पिट्यूटरी-जननांगों अक्ष यौन परिपक्वता और प्रजनन को नियंत्रित करता है । प्रजनन अक्ष के शीर्ष पर हाइपोथैलेमस kisspeptin न्यूरॉन्स (पीले घेरे) और गोनॉडोट्रॉफिन रिलीज हार्मोन (GnRH) न्यूरॉन्स (हरे घेरे) हैं. किशोर अवधि (prepubertal) में, kisspeptin न्यूरॉन्स GnRH न्यूरॉन्स पर छोटे kisspeptin जारी. pubertal शुरुआत के बाद, GnRH न्यूरॉन्स पर kisspeptin रिलीज संवर्धित (पोस्ट-pubertal) है. देर से किशोर अवधि में वृद्धि हुई GnRH रिहाई नाटकीय रूप से luteinizing हार्मोन (LH) और कूप उत्तेजक हार्मोन (FSH) पिट्यूटरी से रिहाई, वयस्कता में जननांगों परिपक्वता और प्रजनन समारोह के लिए अग्रणी बढ़ जाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: चूहों में pubertal शुरुआत का निर्धारण. चूहों में pubertal शुरुआत का एक बाहरी मार्कर है (क) पुरुषों में preputial जुदाई, और महिलाओं में योनि खोलने. स्केल बार = 1 सेमी. (ख) योनि लेवेज से उदाहरण छवियों पहले मद निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया । स्लाइड ०.१% methylene नीले, airdried के साथ 30 एस के लिए counterstained थे और 20X आवर्धन पर मनाया । काले तीर nucleated उपकला कोशिकाओं, काले रंग की रूपरेखा के साथ पीले तीर संकेत ल्यूकोसाइट्स और सफेद तीर cornified उपकला कोशिकाओं से संकेत मिलता है । पहली मद 10 दिन योनि खोलने के बाद हुई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि डेटा जो एक pubertal शुरुआत अध्ययन से उत्पंन किया जा सकता है । (A, B) योनि खोलने और ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में योनि खोलने में वजन । (ग) नियंत्रण और cKO महिलाओं में ४.५ सप्ताह में वजन । (डी, ई) पहले मद पर आयु और भार । (एफ, जी) आयु और preputial जुदाई में वजन । (ज) नियंत्रण और cKO पुरुषों में ४.५ सप्ताह में वजन । डेटा का प्रतिनिधित्व मतलब ± SEM. N = प्रति समूह 5-10, सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र टी परीक्षण । * *p< 0.01; p< 0.001 । ये आंकड़े पिछले प्रकाशन13,22से संशोधित किए गए हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: ट्रांसजेनिक चूहों के एक प्रजनन अध्ययन से प्रतिनिधि विश्लेषण. के प्रजननता आकलन (क) Vax1 हेत चूहों और (ख) cKO कुंवारी 10 में प्रदर्शन किया गया था-करने के लिए 16 सप्ताह पुराने चूहों और संकेत समय फ्रेम में दर्ज कूड़े की संख्या. डेटा का प्रतिनिधित्व मतलब ± SEM. सांख्यिकीय विश्लेषण एक तरह से ANOVA द्वारा किया गया था Dunnett एकाधिक तुलना परीक्षण के बाद । * p< 0.05; p< 0.001 । (C) पहले कूड़े के दिनों की संख्या (n = 5-12), और (D) पहले तीन लिटर का औसत लिटर आकार (n = 10-13) निर्धारित किया गया था । डेटा प्रतिनिधित्व ± SEM का मतलब है । सांख्यिकीय विश्लेषण WT x WT. *p< 0.05 के साथ तुलना के रूप में छात्र के टी परीक्षण द्वारा किया गया था; * *p< 0.01. ये आंकड़े पिछले प्रकाशन13,22से संशोधित किए गए हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एक प्रजनन परख की स्थापना । (क) प्रजनन योजना का उदाहरण और एक प्रजनन परख के लिए आवश्यक पशुओं की संख्या का सुझाव दिया । एक के साथ एक अध्ययन के लिए आवश्यक जानवरों की कुल संख्या 2 शर्तों जैसे एक नियंत्रण बनाम या नियंत्रण आहार बनाम उच्च वसा वाले आहार जहां प्रजनन क्षमता दोनों पुरुषों और महिलाओं में मूल्यांकन किया गया है के रूप में है: 2 प्रति चूहों (1 पुरुष एक्स 1 महिला) x प्रति समूह 8 पशु x 2 शर्तें x 2 लिंग s (दोनों पुरुष और महिला प्रजनन क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए) = अध्ययन के प्रति ६४ पशुओं के कुल । यदि पुरुष और महिला प्रजनन अध्ययन समानांतर में किया जाता है, नियंत्रण एक्स नियंत्रण संभोग का एक सेट आमतौर पर दोनों पुरुष और महिला प्रजनन पर प्रभाव की तुलना करने के लिए सेवा कर सकते हैं । (ख) जब एक प्रजनन परख की स्थापना, इस्तेमाल किया चूहों की जरूरत है यौन परिपक्वता तक पहुंच गया है । चूहों के विभिन्न उपभेदों विभिन्न प्रजनन विशेषताओं है और विभिन्न उम्र में यौन परिपक्वता तक पहुँचने24. चूहों पर जानकारी के लिए, पिछले प्रकाशन25देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

चूहों की समग्र भलाई एक सफल प्रजनन परख21के लिए महत्वपूर्ण है । जब एक प्रजनन परख प्रदर्शन, यह शारीरिक रूप से हर दिन चूहों पर जांच के रूप में यह तनाव पैदा कर सकता है महत्वपूर्ण नहीं है । इसके अलावा लगातार पिंजरे में परिवर्तन से बचने के लिए, के रूप में ये भी तनावपूर्ण हैं । आदर्श पिंजरे परिवर्तन नहीं किया जाएगा से अधिक 1-2 प्रति सप्ताह बार । डार्क चरण के दौरान लाइट एक्सपोज़र नकारात्मक रूप से स्वप्नदोष में प्रजनन को प्रभावित करते हैं । अंधेरे घंटे के दौरान प्रजनन कक्ष में रोशनी चालू नहीं है । यदि कमरे में प्रवेश अंधेरे घंटे के दौरान आवश्यक है, मंद लाल बत्ती रोशनी का उपयोग करें । एक और तनाव अत्यधिक गंध, कंपन या सभी या अध्ययन के कुछ हिस्सों के लिए vivarium में शोर की उपस्थिति है । मदद करने के लिए तनाव को कम करने और माउस भलाई और प्रजनन में सुधार, चूहों घोंसले सामग्री या संवर्धन के अंय प्रकार दे । घोंसला निर्माण चूहों में एक महत्वपूर्ण व्यवहार है और प्रजनन सफलता में वृद्धि होगी । घोंसले भी चूहों को छिपाने और खेलने के लिए एक जगह की अनुमति देते हैं । स्वस्थ और अच्छी तरह से पाला जानवरों नस्ल अच्छी तरह से, इसलिए यह उच्च गुणवत्ता वाले भोजन और पानी के लिए विज्ञापन libitum पहुँच प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि प्रजनन जोड़े रोग के लक्षण प्रदर्शित करने के लिए शुरू, इस तरह जिल्द की सूजन के रूप में (C57BL/6J में अक्सर), दंत malocclusion या अंय, अध्ययन से इन चूहों को बाहर । इसके अलावा, अगर अध्ययन immunodeficient चूहों में किया जा रहा है, यह महत्वपूर्ण है कि माउस कमरे को साफ रखा है प्रजनन क्षमता को संरक्षित करने के लिए ।

उचित रूप से एक प्रजनन अध्ययन स्थापित करने के लिए, यह तय अगर अध्ययन वर्जिन चूहों या सिद्ध प्रजनकों में प्रदर्शन किया जाएगा और साथ ही ध्यान से नियंत्रण संभोग के लिए इस्तेमाल चूहों का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है । नियंत्रण संभोग प्रयोगात्मक प्रजनकों के साथ समानांतर में चलाया जाना चाहिए । यह आवश्यक है के रूप में अज्ञात या अप्रत्याशित तनाव और पर्यावरण में परिवर्तन प्रजनन दर में परिवर्तन पैदा कर सकता है । नियंत्रण संभोग तरजीही प्रयोगात्मक चूहों (चित्रा 5) के लिए कूड़े साथियों की रचना कर रहे हैं । यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब प्रजनन अध्ययन चूहों में मिश्रित आनुवंशिक माउस उपभेदों (चित्रा 5B) के बीच प्रजनन विशेषताओं में महान विविधताओं के कारण पृष्ठभूमि के साथ किया जाता है ।

एक उपप्रजनन phenotype की पहचान अध्ययन के लंबे समय तक लंबाई के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और इसके कारण प्रकट करने के लिए अतिरिक्त मापदंडों का विश्लेषण करने की आवश्यकता है । प्रतिनिधि के आंकड़ों में हेत माउस एक मामूली उपप्रजनन phenotype (चित्रा 4) का एक अच्छा उदाहरण है, और विस्तारित विश्लेषण के लिए पुरुष उपप्रजनन की पहचान की आवश्यकता है । के रूप में प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है (चित्रा 3 और 4), यौवन की सामांय शुरुआत (आंकड़ा३ ए, डी, और एफ) दोनों पुरुष और महिला उपप्रजनन (चित्र 4a, सी, डी के साथ संबद्ध किया जा सकता है ). इस मामले में, चूहों केवल उप उपजाऊ थे, और इस तरह अध्ययन की लंबाई १२० दिनों के लिए बढ़ाया गया था । यह महत्वपूर्ण है, एक छोटे प्रजनन अध्ययन के रूप में (जैसे, ६० दिन) phenotype प्रकट करने में सक्षम नहीं होता । पुरुष उपप्रजनन मामूली था, और पहली बार पता चला जब हेत पुरुषों हेत महिलाओं, जो भी उपउपजाऊ थे (4a आंकड़ा) के साथ जोड़ा गया । वास्तव में, हेत नर के उपप्रजनन की पुष्टि की जब कूड़े का औसत आकार sired (चित्रा 4d) का मूल्यांकन किया गया । अनुवर्ती अध्ययन पुरुष उपप्रजनन की पुष्टि की और हेत पुरुषों में एक गरीब शुक्राणु की गुणवत्ता से पता चला, के साथ एक ~ ८०% की कमी में गतिशील शुक्राणु13।

pubertal शुरुआत (> 5 दिन) में एक बड़ी देरी के साथ चूहों में एक प्रजनन क्षमता और pubertal शुरुआत अध्ययन प्रदर्शन करते हैं, यह pubertal शुरुआत26को विनियमित जो विभिन्न कारकों पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि योनि खोलने और सबसे पहले मद अक्सर चूहों में concomitantly होता है, चूहों में पहली मद आमतौर पर होता है ~ 10 दिन योनि खोलने के बाद25,27. इसलिए, यह सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है कि दोनों योनि खोलने और पहली मद स्थापित कर रहे हैं जब दोनों चूहों और चूहों में काम18,28. Pubertal शुरुआत चयापचय स्थिति और महिलाओं में शरीर के वजन के लिए और पुरुषों1,7,9,29में एक मामूली डिग्री करने के लिए जुड़ा हुआ है, और इस तरह के रूप में, एक इलाज या आनुवंशिक उत्परिवर्तन जानवर विकास धीमा होगा कुछ मामलों में एक देरी pubertal शुरुआत में परिणाम । यह निर्धारित करने के लिए कि pubertal शुरुआत में देरी/प्रगति के साथ तेजी से जुड़ा हो सकता है/pubertal शुरुआत के आकलन के दौरान चूहों दैनिक वजन करने के लिए महत्वपूर्ण है । के रूप में चित्र बी और सीमें देखा, साथ ही जी और एच, pubertal शुरुआत में देरी कम शरीर के वजन के साथ संबद्ध नहीं था, लेकिन pubertal शुरुआत में एक सच देरी थी, के रूप में जननांगों प्रोटोकॉल और घूम हार्मोन द्वारा की पुष्टि स्तर22. preputial जुदाई और pubertal शुरुआत के मार्कर के रूप में योनि खोलने का उपयोग कर के प्रमुख सीमाओं में से एक यह है कि दोनों अक्सर अंततः प्रजनन अक्ष18की वृद्धि हुई गतिविधि के अलावा अंय तंत्र के कारण समय पर होगा, 30 , ३१ (चित्रा १). इस का एक उदाहरण है cKO महिलाओं में देरी योनि खोलने (चित्र बी) । 22 ovulation के एक अनुपस्थिति के कारण cKO महिलाओं उपजाऊ कभी नहीं हो (चित्रा 3E) । दरअसल, इसके अलावा हार्मोनल स्तर और cKO चूहों के जननांगों प्रोटोकॉल के मूल्यांकन के अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि इन चूहों यौवन पूरा कभी नहीं और22 ऊसर थे (चित्रा 4B) । यह pubertal शुरुआत निर्धारित करने के लिए बाहरी मार्कर का उपयोग करने की सीमा दिखाता है । यौवन के पूरा होने और यौन परिपक्वता तक पहुंचने GnRH जारी है और प्रजनन अक्ष (चित्रा 1) के सक्रियकरण की आवश्यकता है, और पूरी तरह से यौन परिपक्वता की पुष्टि करने के लिए दोनों जननांगों आकृति विज्ञान और परिसंचारी हार्मोन का स्तर मूल्यांकन किया जा करने की आवश्यकता 22 , 31. पुरुषों में, टेस्टोस्टेरोन को मापने, और शुक्राणु की गुणवत्ता के अलावा लाभदायक पुटिका आकार और वृषण आकृति विज्ञान और आकार का मूल्यांकन यौवन16,22,३२हासिल किया गया था की पुष्टि करेगा. महिलाओं में, गर्भाशय और डिंबग्रंथि के वजन और आकृति विज्ञान के साथ संयोजन में प्रोजेस्टेरोन और एस्ट्रोजन के स्तर को मापने यौवन17,19,22,३३के पूरा होने की पुष्टि करेगा ।

कूड़े का आकार pubertal शुरुआत में दोनों हमल लंबाई और उम्र को प्रभावित कर सकता है । अधिकांश माउस उपभेदों 18-22 दिनों के एक हमल अवधि है । हालांकि, अगर मां एक बड़े कूड़े की उंमीद है, हमल अवधि३४,३५कम हो जाता है । दूसरी ओर, यदि मां एक पिछले कूड़े नर्सिंग है, यह गर्भावधि अवधि5का एक विस्तार में परिणाम कर सकते हैं । बड़े कूड़े में पिल्ले भी pubertal शुरू होने में देरी हो जाते हैं । यह उनके विकास के कारण होता है थोड़ा देरी1,9,३४,३५। यदि एक प्रजनन अध्ययन किया जाता है और माउस समूहों में से एक (नियंत्रण या प्रयोगात्मक) बहुत बड़े कूड़े का उत्पादन, यह homogenize कूड़े के आकार के लिए सिफारिश की है, यह भी मुर्गियोंed, अध्ययन कूड़े की अनुमति के लिए तुलनीय आकार है ।

प्रजनन केवल कई अंगों प्रजनन में शामिल करने के कारण vivo में मूल्यांकन किया जा सकता है (चित्रा 1) और व्यापक प्रतिक्रिया प्रजनन अक्ष3विनियमन तंत्र. प्रजनन क्षमता के कुछ पहलुओं को तेजी से एक योनि plugging परख, जहां पुरुष की क्षमता के लिए महिला माउंट और योनि में एक भौतिक प्लग छोड़ के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है मनाया13,३६। हालांकि यह पुरुष यौन व्यवहार का आकलन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है, इस प्रकार के अध्ययन प्रजनन में मामूली समस्याओं का पता लगाने की अनुमति नहीं है, और न ही यह समय की एक लंबी अवधि या जिसके परिणामस्वरूप कूड़े का आकार और माता पिता के व्यवहार के लिए बनाए रखा प्रजननता का आकलन करता है. प्रोटोकॉल वर्णित यहां एक plugging परख पर कई लाभ प्रस्तुत करता है, प्रमुख क्षमता जा रहा है पुरुषों और महिलाओं में प्रजनन क्षमता पर दोनों छोटे और प्रमुख प्रभावों की पहचान (4 अंक) ।

प्रजनन आयु के साथ कम हो जाती है, और इसके अलावा महिला मद चक्र5,28एजिंग के दौरान अब और अनियमित हो जाता है । इसलिए यह युवा और यौन परिपक्व जानवरों में एक प्रजनन अध्ययन शुरू करने के लिए सिफारिश की है । एक आम तौर पर इस्तेमाल की आयु सीमा के लिए एक प्रजनन अध्ययन सेट उंर के 10-16 सप्ताह है । हालांकि, यह अध्ययन में इस्तेमाल किया माउस तनाव के विशिष्ट प्रजनन विशेषताओं से परिचित होना महत्वपूर्ण है, के रूप में प्रजनन और यौन परिपक्वता में प्रमुख अंतर अलग माउस या चूहे उपभेदों (चित्रा 5B) के बीच मौजूद हैं । प्रजनन विशेषताओं के बारे में अतिरिक्त जानकारी JAX माउस Phenome डेटाबेस https://phenome.jax.org/में पाया जा सकता है । एक लंबा प्रदर्शन (> 4 महीने) प्रजननता अध्ययन के लिए जल्दी प्रजनन गिरावट का पता लगाने में सक्षम होने का फायदा है, जहां चूहों प्रजनन क्षमता परख के पहले 1-2 महीने के लिए आम तौर पर नस्ल हो सकता है, लेकिन फिर शुरू प्रजनन में एक प्रारंभिक गिरावट से पहले उम्र के 6 महीने ।

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Disclosures

लेखक का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

मैं आरंभिक कार्य में योगदान करने वाले लेखकों का धन्यवाद करता हूं जो इस प्रकाशन का आधार है । पांडुलिपि तैयार करने में मदद के लिए Aitor Aguirre, Genevieve ई. रयान और एरिका एल Schoeller के लिए धंयवाद । पांडुलिपि के साथ तकनीकी सहायता के लिए जेसिका सोरा ली और ऑस्टिन चिन के लिए धंयवाद । H.M.H. Eunice कैनेडी श्राइवर नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ चाइल्ड हेल्थ एंड ह्यूमन डेवलपमेंट ऑफ हेल्थ के राष्ट्रीय संस्थानों के पुरस्कार संख्या R00HD084759 के तहत समर्थन किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile Cotton Balls Fisher 22456885
Surface protector Fisher 1420637
Light meter VWR 21800-014
Methylene blue  Sigma-Aldrich M9140
Microscope Slides Genesee Scientific 29-101
Optimouse rack with cages AnimalCare systems C89100
Water Bottle Basket  AnimalCare systems C61011
Filtered Cage Tops AnimalCare systems C78210
Optimice Standard Feeder AnimalCare systems C40100SG
Cage Card Holder AnimalCare systems C43251
Cage Cards AnimalCare systems M52010
Bottle Assambley AnimalCare systems C79122P
Bed R'Nest Nesting The Andersons BRN4WSR
1/8" Corn Cob bedding  The Andersons 8B
Standard mouse chow Teklad 7904 (7004)
Scale VWR 10205-004
Polypropylene Beaker Fisher 14-955-111F

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References

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जीव विज्ञान अंक १४० Pubertal शुरुआत प्रजनन परख प्रजनन क्षमता preputial जुदाई योनि खोलने पहली मद माउस मूषक चूहा पुरुष महिला शरीर के वजन
Pubertal शुरुआत की पुष्टि करके प्रजनन क्षमता का निर्धारण और चूहों और चूहों में एक प्रजनन परख प्रदर्शन
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Hoffmann, H. M. Determination of Reproductive Competence by Confirming Pubertal Onset and Performing a Fertility Assay in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (140), e58352, doi:10.3791/58352 (2018).

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