Summary
Eierstokkanker vormen metastasen in de peritoneale holte. Hier presenteren we een protocol te maken en gebruik folaat-receptor gerichte oppervlak-enhanced resonantie Raman verstrooiing nanoprobes dat onthullen van deze letsels met hoge specificiteit via de beeldvorming van de ratiometric. De nanoprobes intraperitoneally zijn toegediend aan levende muizen, en de afgeleide beelden correleren goed met histologie.
Abstract
Eierstokkanker vertegenwoordigt de dodelijkste gynecologic maligniteit. De meeste patiënten presenteren in een vergevorderd stadium (FIGO fase III of IV), wanneer lokale metastatische verspreiden zich al heeft voorgedaan. Echter, ovariale kanker heeft een uniek patroon van metastatische verspreiding, tumor implantaten in eerste instantie zijn vervat in de peritoneale holte. Deze functie kan inschakelen, in principe de volledige resectie van de tumor implantaten met een curatieve intentie. Veel van deze metastatische letsels zijn microscopische, waardoor ze moeilijk te identificeren en behandelen. Neutraliseren van dergelijke micrometastasen wordt verondersteld te zijn een grote doel naar het elimineren van de herhaling van de tumor en het bereiken van voortbestaan op lange termijn. Raman imaging met oppervlakte verbeterde resonantie Raman verstrooiing nanoprobes kan worden gebruikt om af te bakenen microscopische tumoren met hoge gevoeligheid, als gevolg van hun heldere en bioorthogonal spectrale signatuur. Hier beschrijven we de synthese van twee 'smaken' van zo'n nanoprobes: antilichaam-matiemaatschappij een die zich richt op de receptor folaat — overexpressie in veel kanker van de eierstokken — en een niet-gerichte controle-nanosonde, met verschillende spectra. De nanoprobes zijn mede door de overheid gereguleerde intraperitoneally aan Muismodellen van metastatische menselijke ovariële adenocarcinoom. Alle dierlijke studies werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Memorial Sloan Kettering Cancer Center. De peritoneale holte van de dieren is operatief blootgesteld gewassen en gescand met een Raman-microphotospectrometer. Vervolgens de Raman handtekeningen van de twee nanoprobes zijn ontkoppelde met behulp van een algoritme voor de montage van klassieke kleinste kwadraten, en hun respectievelijke scores verdeeld zodat een ratiometric signaal van folaat-gerichte over irrelevante sondes. Op deze manier worden de microscopische uitzaaiingen gevisualiseerd met hoge specificiteit. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is dat de lokale applicatie in de peritoneale holte — die kan gemakkelijk worden gedaan tijdens de chirurgische ingreep — tumoren kunt labelen zonder de patiënt te onderwerpen aan de systemische nanoparticle blootstelling. Valse positieve signalen die voortvloeien uit niet-specifieke binding van de nanoprobes op viscerale oppervlakken kan worden geëlimineerd door een ratiometric aanpak te volgen waarin gerichte en niet-doelgerichte nanoprobes met verschillende Raman handtekeningen worden toegepast als een mengsel. De procedure is momenteel nog beperkt door het ontbreken van een commerciële breed-gebied Raman imaging camerasysteem, waarmee één keer beschikbaar voor de toepassing van deze techniek in de operationele theater.
Introduction
Raman imaging met 'Oppervlakte verbeterde Raman verstrooiing' (SERS) nanodeeltjes heeft aangetoond grote belofte in uitgezet laesies in een verscheidenheid van instellingen en voor vele verschillende tumor type1,2,3,4 . Het belangrijkste voordeel van SERS nanodeeltjes is hun vingerafdruk-achtige spectrale signatuur, bieden ze onbetwistbaar opsporen die niet door biologische achtergrond signalen5is verward. Bovendien, de intensiteit van het uitgezonden signaal wordt verder versterkt met het gebruik van verslaggever moleculen (kleurstoffen) met absorptie maxima in overeenstemming met de excitatie-laser, die aanleiding geven tot het 'oppervlakte verbeterde resonantie Raman verstrooiing' (SERRS) nanodeeltjes met nog grotere gevoeligheid6,7,8,9,10,11,12.
Een barrière die moet worden aangepakt voor de aanneming van SE(R)RS nanodeeltjes13 en vele andere nanoparticle constructies14,15 voor klinisch gebruik is hun wijze van toediening, zoals intraveneuze injectie systemische veroorzaakt blootstelling van de agent, en vereist uitgebreide testen als u wilt uitsluiten van mogelijke bijwerkingen. In dit artikel presenteren wij een ander paradigma gebaseerd op de toepassing van nanodeeltjes lokaal in vivo, direct in de peritoneale holte tijdens chirurgie, gevolgd door een wassen stap voor verwijderen van een niet-afhankelijke nanodeeltjes1. Deze aanpak is in overeenstemming met de nieuwe therapeutische benaderingen die momenteel onderzochte waardoor ook gebruik van een lokale toediening van agenten in de peritoneale Holte, genaamd hyperthermic intraperitoneaal chemotherapie (HIPEC). Aldus, het principe zelf moet zijn relatief eenvoudig te integreren in een klinische werkstroom. We hebben het ook van de nanodeeltjes onderzocht na intraperitoneale toediening, en eventuele detecteerbare absorptie in de systemische circulatie1niet in acht genomen. Daarnaast omzeilt de lokale toepassing aanpak de inbeslagneming van nanodeeltjes door het reticuloendotheliaal-systeem, dus de nummers van nanodeeltjes vereist zijn aanzienlijk verminderd. Echter, wanneer toegepast topicaal, antilichaam-matiemaatschappij nanodeeltjes neiging te houden op de viscerale oppervlakken zelfs in de afwezigheid van hun doel. Oog op het minimaliseren van valse positieve signalen als gevolg van niet-specifieke nanoparticle hechting, wij streven naar een benadering van de ratiometric, waar een moleculair gerichte nanosonde zorgt voor het specifieke signaal en een niet-gerichte controle-nanosonde, met verschillende Raman spectrum, accounts voor niet-specifieke achtergrond16,17. We hebben aangetoond dat deze methode van topisch toegepast oppervlakte verbeterde resonantie ratiometric Ramanspectroscopie onlangs in een muismodel van diffuse eierstokkanker1.
Het algemene doel van deze methode is het ontwikkelen van twee SERRS nanoprobes, een gerichte en één niet-specifieke, moeten lokaal worden toegepast in muismodellen, om het beeld van de prevalentie/overexpressie van kanker gerelateerde biomerker met behulp van ratiometric detectie van de twee sondes via Raman imaging. In dit werk, werd de folaat receptor (FR) gekozen als de doelgroep, zoals dit een upregulated van de markering in vele ovariële kanker18,19 is. Raman microimaging met nanodeeltjes SERS gebaseerde is ook aangetoond voor kanker cel identificatie20. Twee verschillende "flavors" van Raman nanodeeltjes worden gesynthetiseerd, elk die haar vingerafdruk voortvloeien uit een verschillende organische kleurstof. De nanodeeltjes bestaan uit een ster-vormig gouden kern omgeven door een silica omhulsel en tonen oppervlakte plasmon resonantie op ongeveer 710 nm. De verslaggever Raman (organische kleurstof) wordt gelijktijdig met de vorming van silica shell gestort. Ten slotte is de silica shell voor de FR-gerichte nanoprobes (αFR-NPs) geconjugeerd met antilichamen, overwegende dat de niet-gerichte nanoprobes (nt-NPs) zijn gepassiveerd met een enkelgelaagde van polyethyleenglycol (PEG).
Deze techniek werd met succes gebruikt om de kaart van microscopische tumoren in een muismodel van xenograft van diffuse metastatische ovariale kanker (SKOV-3), demonstreren de toepasbaarheid ervan voor in vivo gebruik. Het kan ook worden uitgebreid voor gebruik in het verwijderde weefsel, voor tumor fenotypering of marge vaststelling na debulking zoals in een cognaat studie21.
SERRS nanoprobes zorgen voor een robuust platform voor het creëren van meerdere gerichte labels voor biomarkers, gesynthetiseerd met eenvoudige chemische reacties, zoals schematisch aangegeven in Figuur 1. Hier presenteren we het protocol voor de synthese van de twee soorten SERRS nanoprobes (secties 1-3), de ontwikkeling van een geschikt eierstokkanker muismodel (punt 4), het beheer van nanoprobes en beeldvorming (sectie 5) en ten slotte de data-analyse en Visualisatie (punt 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke studies werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Memorial Sloan Kettering Cancer Center (#06-07-011).
1. gouden Nanostar Core synthese
Opmerking: Gouden nanostars worden gebruikt als kernen voor beide smaken van de SERRS nanoprobes gebruikt in dit experiment.
- 800 mL van 60 mM ascorbinezuur (C6H8O6) oplossing in gedeïoniseerd water (DI) en 8 mL van 20 mM tetrachloroauric (HAuCl4) zuuroplossing in DI water voor te bereiden. Koelen tot 4 ° C.
- Voer deze reactiestap bij 4 ° C. Plaats een conische kolf met 800 mL van de oplossing van de ascorbinezuur op een magnetische roer plaat en veroorzaken een gestage vortex. Snel toevoegen 8 mL van de tetrachloroauric zure oplossing in de draaikolk. Binnen seconden, nanostars zal vormen en de oplossing krijgt een donker blauwe kleur. In het geval dat de kleur op elk gewenst moment wordt roze of paars, betekenende de vorming van nanospheres, de opschorting moet worden weggegooid en de synthese geprobeerd.
- Giet de opschorting van nanostar in 50 mL conische buizen en Centrifugeer gedurende 20 min (4 ° C, 3220 x g). De bovendrijvende substantie verlaten ongeveer 200 µL van de oplossing in elk buisje gecombineerd. Betalen voorzichtig niet te verstoren de pellet van nanodeeltjes op de onderkant van de buis.
Opmerking: Het supernatant moet een blauwe tint vanwege resterende zwevende nanostars. - De oplossing om te schorten en nanoparticles verzamelen van elke buis met behulp van een micropipet, doorroeren. Deel van de pellet op de onderkant van de buis kan worden gecomprimeerd en zal niet resuspendeer zelfs met krachtig pipetteren-negeren dit deel.
- Spoel de suspensie van de nanoparticle op een cassette dialyse (MWCO 3.5 kDa) en dialyze van ten minste drie dagen tegen 2 L DI water, veranderen het water dagelijks. Elke 3-4 dagen nanostars in dialyse bij 4 ° C voor maximaal een maand met water wijzigingen opslaan.
Opmerking: De nanostars moeten worden gehouden in dialyse totdat vereist voor de reactie van de silication, zoals beschreven in sectie 2.
2. vorming van de Silica-Shell
Opmerking: Twee smaken van Raman nanoprobes worden gesynthetiseerd. De synthese-procedure is hetzelfde voor beide, met het enige verschil is de Raman verslaggever molecule (kleurstof) gebruikt. In dit experiment, worden IR780 perchloraat en IR140 gebruikt. De reactie moet altijd worden uitgevoerd in plastic bakjes. De synthese is zeer schaalbaar en kan worden aangepast voor de gewenste hoeveelheid injectate nodig. Hier, wordt de synthese van een middelgrote partij beschreven, die kunnen worden geschaald lineair naar lagere of hogere volumes zo nodig, met de dezelfde concentratie en de reactiesnelheid. De reacties voor de twee SERRS nanosonde typen kunnen parallel worden uitgevoerd. Aandacht besteden aan het voorkomen van kruisbesmetting. Ultrasoonapparaat moet worden uitgevoerd voor de redispersion nanoparticle pellets na het centrifugeren tijdens het wassen stappen, of nadat de nanodeeltjes werden opgeslagen voor langer dan een uur. Ultrasoonapparaat dient te worden uitgevoerd totdat de nanodeeltjes duidelijk worden opgeschort in de oplossing, meestal voor 1 s.
- In buis A (een 50 mL conische buis), meng 10 mL isopropanol, 500 µL van TEOS, 200 µL van DI water, en 60 µL van kleurstof (perchloraat IR780 of IR140, 20 mM in DMF (dimethylformamide)).
- Meng 3 mL ethanol en 200 µL van ammoniumhydroxide in buis B (conische tube van 15 mL). Bewerk ultrasone trillingen ten de nanostars van stap 1.4 1.2 mL nanostars toevoegen aan de buis te verspreiden clusters in oplossing.
Opmerking: de ammoniumhydroxide-oplossing is zeer volatiel en moeilijk te Pipetteer nauwkeurig. Bewaar het bij 4 ° C, totdat het nodig is, om pipetteren. - Buis A plaats op een vortex-mixer en een gestage vortex veroorzaken. Snel de inhoud van de Tube B in de draaikolk toevoegen en blijven mengen voor ongeveer 5 s. onmiddellijk overbrengen in een pepermolens en laat reageren gedurende 15 minuten terwijl het schudden bij 300 omwentelingen per minuut, bij kamertemperatuur.
- Na de incubatie 15 min doven de reactie door toevoeging van ethanol te vullen van de tube van 50 mL. Centrifugeer gedurende 20 min op 3,220 x g - en 4 ° C.
- Gecombineerd het supernatant, verlaten ongeveer 0,5 mL van de oplossing, dat evenwel niet tot de pellet te verstoren. Voeg 1 mL ethanol en doorroeren met een pipet aan resuspendeer de nanodeeltjes. Overbrengen in een centrifugebuis 1,5 mL en 4 keer wassen met ethanol door centrifugatie bij 11.000 x g gedurende 4 min, aspirating het supernatant en resuspending van de pellet door met ultrasone trillingen voor ongeveer 1 s.
Opmerking: In dit stadium kan de silicated nanodeeltjes matiemaatschappij, zoals beschreven in sectie 3, of geresuspendeerde in DI water met een extra wassen stap, voor opslag bij 4 ° C voor maximaal een week.
3. oppervlakte Functionalization
Opmerking: IR780 SERRS nanoprobes zal worden vervoegd met folaat receptor-targeting antilichamen via een PEG-crosslinker naar NPs-vorm-αFR; IR140 SERRS beheer nanoprobes zal worden vervoegd met een passivating PEG enkelgelaagde, voor nt-NPs. Beide smaken worden gevormd via een thiol-maleimide-reactie in afzonderlijke, maar parallel reacties.
- Wassen nanodeeltjes tweemaal door centrifugatie bij 11.000 x g gedurende 4 min, aspirating het supernatant en resuspending van de pellet in 1 mL ethanol door met ultrasone trillingen. De wassen stap eens te meer herhalen, maar redisperse in 1 mL 85% ethanol, 10% 3-MPTMS (3-mercaptopropyltrimethoxysilane) en 5% DI-water. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur te voeren thiolen op het oppervlak van het deeltje.
- Wassen van de thiol-matiemaatschappij nanodeeltjes door centrifugatie bij 11.000 x g gedurende 4 min, aspirating het supernatant en resuspending van de pellet door met ultrasone trillingen, tweemaal in ethanol, tweemaal in DI, en ten slotte in HEPES (4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic zuur) buffer (10 mM, pH 7.1), en zet opzij.
Opmerking: MES (2-(N- morfolino) ethanesulfonic zuur) buffer of HEPES moet worden gebruikt. Buffers met hogere zoutgehalte, zoals PBS (met fosfaat gebufferde zoutoplossing), kunnen induceren nanoparticle aggregatie. - De antilichaam matiemaatschappij αFR-server met NPs, 200 µg antilichamen (anti-folaat bindende eiwit antilichaam kloon [LK26]) met reageren vertienvoudigd molaire overmaat van PEG crosslinker (poly(ethylene glycol) (N-hydroxysuccinimide 5-pentanoate) ether N′-(3- maleimidopropionyl) aminoethane (CAS: 851040-94-3), in dimethylsulfoxide (DMSO)) in 500 µL van MES buffer (10 mM, pH 7.1) voor 30 min.
- Verwijder overtollige crosslinker en concentreren van antilichaam door centrifugeren van de antilichaam-PEG-oplossing in een centrifugaal filter (MWCO 100 kDa). Voer voor de centrifugale filters die worden gebruikt in deze studie, centrifugeren voor 10 min bij 14.000 x g en 23 ° C. De geconjugeerde antilichamen in een verse buis herstellen door het omkeren van de filter en centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 2 min.
- Pipetteer IR780 nanoparticles uit stap 3.2 in de buis met de antilichamen en doorroeren met de pipet te mengen. Incubeer het mengsel gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur of, als alternatief bij 4 ° C's nachts te vormen de αFR-server met NPs.
- Vormen van nt-NPs, voeg 1% w/v methoxy-beëindigd (m) PEG5000-maleimide (CAS: 99126-64-4) in DMSO aan de IR140 SERRS-nanodeeltjes van stap 3.2 en laat reageren in 500 µL MES buffer (10 mM, pH 7.1) gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur, opgelost of anders bij 4 ° C overnachting.
- Voor toediening aan muizen (sectie 5), spin down beide smaken van de nanosonde bij 11.000 x g gedurende 4 min, gecombineerd het supernatant Schakel oplossing met gratis spoorverontreiniging antilichamen/PEG, en elke smaak in MES buffer (10 mM, pH 7.1) 600 pM concentratie redisperse . Wanneer resuspending de nanodeeltjes, minimaliseren van onnodige blootstelling aan de echografie, om te voorkomen dat denaturatie van het antilichaam.
4. muis Model ontwikkeling
- Vast een gestage cultuur van cellijn van menselijke ovariële adenocarcinoom (SKOV-3). Gebruik eventueel opdat controle via bioluminescentie/fluorescentie, transfected cellen van SKOV-3 Luc+/GFP+ . De cellen van de cultuur in RPMI (Roswell Park Memorial Instituut) medium met 10% foetaal kalfsserum en passage tweemaal per week. Incubeer de cellen met 0,25% trypsin/0.05% EDTA gedurende 3 minuten te verbreken, en vervolgens wassen en resuspendeer in PBS op 2 x 106 cellen/100 µL voor injectie.
- Om vast te stellen de eierstokken micrometastasis model, injecteren 200 µL van zwevende SKOV-3 cellen intraperitoneally athymic vrouwelijke muizen (FOXn1nu/FOXn1nu muizen, 6-8 weken oud). Gedissemineerde peritoneale verspreiding zal optreden in ongeveer 4 weken. Als SKOV-3 Luc+ cuvetten, kan tumorgroei worden bewaakt met bioluminescentie door het toedienen van 2 mg kever luciferine in 50 µL PBS via retroorbital injectie.
5. nanosonde injectie en beeldvorming
- Nanoprobes (αFR-NPs en nt-NPs) bereiden zoals beschreven in de secties 1-3 en mix op een 1:1 verhouding, voor een eindconcentratie van 300 uur van elk type in MES buffer (10 mM, pH 7.1). Optioneel, bereiden referentie standaarden van 30 pM van elk van de smaken van de nanosonde in kleine (100 µL) conische buisjes.
- Injecteer intraperitoneally 1 mL van de ophanging van de nanoparticle in elke muis en zachtjes masseren de buik om te distribueren nanoparticles binnen de peritoneale holte. De muis terugkomen in de behuizing. Na 25 of meer minuten, euthanaseren de muis via CO2 verstikking.
-
Zet de muis vast op een chirurgische platform, op de liggende positie (voor hele buik imaging, het platform moet "mountable" op het podium rechtop Microscoop).
- Getande pincet en dissectie schaar gebruikt, verwijder de huid om te bloot het buikvlies en een grote Sagittaal insnijding (tussen 2 en 3 cm lengte) uit te voeren om de hele buik bloot te stellen. Bevestig de peritoneale kleppen op het platform. Wassen van de binnenkant van de peritoneale holte met ten minste 60 mL PBS met behulp van een kunststof spuit fles.
Opmerking: Opdat de onbelemmerde beeldvorming van de hele buik, de ingewanden moeten worden gemobiliseerd of weggesneden. Voor excisie, resect met een Afbinding van de mesenterische vaartuigen ter vermindering van de bloeding in de buikholte. - U kunt ook specifieke organen van het beeld, accijnzen hen na het wassen met PBS en plaats ze op een microscoopglaasje.
- Getande pincet en dissectie schaar gebruikt, verwijder de huid om te bloot het buikvlies en een grote Sagittaal insnijding (tussen 2 en 3 cm lengte) uit te voeren om de hele buik bloot te stellen. Bevestig de peritoneale kleppen op het platform. Wassen van de binnenkant van de peritoneale holte met ten minste 60 mL PBS met behulp van een kunststof spuit fles.
-
Het platform of dia overbrengen in een Raman microspectrophotometer met rechtop optische configuratie en een gemotoriseerde podium voor imaging; Gebruik een commercieel systeem met een 300 mW 785 nm diodelaser, met een rooster van 1.200 groeven per mm, gecentreerd op 1,115 cm-1.
- Focus op het gebied van belang met behulp van wit licht optica, parfocal met de Raman-laser. Selecteer het gebied dat moet worden beeld en de gewenste resolutie; in dit verslag een snelle overname modus werd gebruikt (spectra continu laser verlichting met het stadium van de Microscoop voortdurend in beweging, met effectieve ruimtelijke resolutie 14.2 µm door 200 µm; op 5 x vergroting, 100 mW vermogen bij doelstelling, te ontlenen en < 100 ms blootstelling per punt).
Opmerking: De buizen met de nanoprobes van de verwijzing van stap 5.1 kunnen worden geplaatst binnen het verbeelde gebied indien gewenst, ernaar de interne referentie standaarden voor de daaropvolgende analyse. Ervoor te zorgen dat geen vreemde lichtbronnen dan de laser bereikt de doelstelling.
- Focus op het gebied van belang met behulp van wit licht optica, parfocal met de Raman-laser. Selecteer het gebied dat moet worden beeld en de gewenste resolutie; in dit verslag een snelle overname modus werd gebruikt (spectra continu laser verlichting met het stadium van de Microscoop voortdurend in beweging, met effectieve ruimtelijke resolutie 14.2 µm door 200 µm; op 5 x vergroting, 100 mW vermogen bij doelstelling, te ontlenen en < 100 ms blootstelling per punt).
- Optioneel, voorbereiden op het monster histologische verwerking en validering door fixatie in 4% paraformaldehyde in PBS's nachts bij 4 ° C. Spoel met PBS bij 4 ° C gedurende 15 minuten ten minste tweemaal. Houd het monster in 70% ethanol in water tot standaard histologische verwerking en paraffine insluiten. Voor histologisch validatie van de tumoren, kunnen secties (5 µm dik) uit verschillende diepten van het blok van paraffine worden gekleurd met haematoxyline en eosine (H & E).
6. verwerking van de gegevens en visualisatie
Opmerking: Alle verwerking van de gegevens is uitgevoerd met een grafische gebruikersinterface intern, ontwikkeld met behulp van commerciële software. De gebruikte functies allemaal generieke equivalenten beschikbaar in andere computeromgevingen.
- Spectra van de referentie voor de twee smaken, verkrijgen door het ondervragen van pure schorsingen van elk. De referentie-spectra kunnen worden afgeleid uit punt scans van de nanoprobes, beeldvorming van de nanoprobes in goed-platen of door interne verwijzingen in de experimentele scans in de buizen van de verwijzing (zie stap 5.1).
- Voorbehandelen van de referentie-spectra, met behulp van aftrekken van de basislijn (Whittaker filter, λ = 200), normalisatie door het oppervlak onder de kromme, en de afgeleide filter Savitzky-Golay (tweede graad van de polynoom past, eerste-orde afgeleide, breedte = 15 stappen). Deze voorverwerkte spectra zal dienen als verwijzingen voor de klassieke kleinste kwadraten (CLS)-model.
- Het voorbehandelen van de voorbeeldgegevens uit de afbeelding op dezelfde manier als de referentie-spectra. Verkrijgen CLS scores voor elk punt van het monster met behulp van een algoritme CLS beschikbaar. De directe CLS (DCL's) scores zijn eenvoudig de coördinaten van de projectie van een spectrum van het monster naar de lineaire ruimte gedefinieerd door de veralgemeende inverse matrix (Moore-Penrose inverse) van de referentie-spectra. Andere passende algoritmen kunnen worden gebruikt (niet-negatief kleinste kwadraten, gedeeltelijke kleinste-kwadratenmethode of anderen).
Opmerking: Enkele montage algoritmen kunnen aanleiding geven tot negatieve scores, waaronder in deze context niet fysiek zijn. Als dit het geval is, een drempel kan worden ingesteld op het uitsluiten van negatieve scores of een beperkte niet-negatieve kleinste kwadraten algoritme worden gebruikt in plaats daarvan. - Berekenen van de puntsgewijze verhouding tussen de scores op de referentie voor de gerichte nanodeeltjes (puntenαFR) over de scores op de referentie voor de niet-doelgerichte nanodeeltjes (Scoresnt). Als de scores niet-negatief zijn, kan de verhouding worden uitgedrukt in een logaritmische mode:
R = log10(scoortαFR/ntscoort).
De verhouding R is best kunnen worden weergegeven in een uiteenlopende kleurenschaal gecentreerd op nul, om uit te drukken de relatieve abundantie van de sondes in ordes van grootte. Het resulterende beeld kan worden bedekt op het witte licht beeld van het monster, tot het onthullen van de gebieden van folaat receptor overexpressie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oog op kwaliteitscontrole kan de nanodeeltjes worden gekarakteriseerd met behulp van een verscheidenheid van methoden tijdens het proces van synthese, met inbegrip van TEM, Distributielijsten, nanoparticle bijhouden analyse en UV/Vis Absorptie spectroscopie, zoals weergegeven in Figuur 2.
Op deze manier de grootte van de kern van de gouden nanostar (beschreven in sectie 1), de vorming van de silica shell (sectie 2) en de daaropvolgende oppervlakte functionalization (sectie 3) kunnen worden geverifieerd (Figuur 2). Gewoonlijk de grootte (hydrodynamische diameter) van de gouden nanostar kern zit verwachte voor zitten zowat 80 nm, en de shell silica is ongeveer 20 nm dik, waardoor de totale silicated nanoparticle grootte ongeveer 120 nm en ongeveer 140 nm na conjugatie met het αFR-antilichaam. UV/Vis-absorptie kan ook worden gebruikt om te controleren of de morfologie van de nanodeeltjes. Nanostar kernen in water hebben meestal een maximale extinctie op 670 nm, overwegende dat na silication het maximum naar ongeveer 710 verschuift nm. Absorptie maxima bij lagere golflengten zijn een teken van sferische morfologie of aggregatie. Typische reactie opbrengst en concentraties worden weergegeven in tabel 1 en zijn sterk afhankelijk van pipetting techniek tijdens de stappen wassen.
Elk punt verkregen uit de Raman-scan bevat een spectrum voor een interrogated locatie. Deze spectra zijn een lineaire superpositie van de nanoprobes' SERRS signaal en een achtergrond fluorescentie. De spectra kunnen worden verwerkt om te verwijderen van de fluorescentie en genormaliseerd naar oppervlakte-eenheid om te compenseren voor de sterkte van het signaal, alvorens het CLS-model (beschreven in hoofdstuk 6), zoals afgebeeld in Figuur 3. Representatieve beelden voor scores op elk van de nanosonde referentie spectra en hun puntsgewijze verhouding worden weergegeven in Figuur 4. Hoewel elke score individueel niet in specifieke lokalisatie van tumoren voorziet blijkt de verhouding tussen de aanwezigheid van gedissemineerde microscopische verspreiding.
| Stap | Oorspronkelijke volume | Beginconcentratie | Eindvolume | Eindconcentratie |
| 1. Nanostar-core | 8 mL HAuCl4 | 20 mM HAuCl4 | 5 mL | 1.3 nM |
| 2. Silication | 1.2 mL | 1.3 nM | 1.2 mL | 0,5 nM |
| 3.1. Thiolation | 1 mL | 0,5 nM | 1 mL | 0,43 nM |
| 3.5. Woordherkomst en-opbouw | 1 mL | 0,43 nM | 1 mL | 0,39 nM |
Tabel 1: Nanoparticle rendement na elke reactiestap. De concentraties zijn bij benadering. De opbrengst werd bepaald door nanoparticle analyse, met twee onafhankelijke syntheses en 5 onafhankelijke metingen uit elk bijhouden.
Figuur 1 : Schematische van synthese en toepassing van ratiometric SERRS nanosonde imaging. (1) goud nanostars worden gesynthetiseerd zoals beschreven in sectie 1. (2) een silica omhulsel wordt gevormd rond het gouden nanostar kernen en Raman verslaggever moleculen (infrarood kleurstoffen IR-780 perchloraat en IR-140) worden gebruikt voor het maken van twee verschillende nanoparticle smaken, zoals beschreven in sectie 2. (3) het oppervlak van de nanodeeltjes is bedekt met thiolen, zoals beschreven in sectie 3.1, om verdere oppervlakte functionalization. De IR-780 smaak nanodeeltjes zijn geconjugeerd met een anti-folaat Receptor antilichaam, terwijl de IR-140 degenen zijn met een laag van PEG - 5 k gepassiveerd zoals beschreven in de punten 3.3 tot en met 3.6. (4) een muismodel van diffuse intraperitoneaal ovariële metastatische verspreiding is ontwikkeld zoals beschreven in sectie 4, en als u klaar bent, de SERRS nanoprobes intraperitoneally worden beheerd. (5) de muizen zijn euthanized en de buik operatief blootgesteld zodat Raman imaging als beschreven in punt 5. (6) de Raman spectra worden puntsgewijs geanalyseerd om te bepalen van de relatieve abundantie van de twee sondes en genereren een ratiometric kaart van folaat receptor overexpressie zoals beschreven in sectie 6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Fysische karakterisering van SERRS nanoprobes. De nanodeeltjes kan worden onderworpen aan kwaliteitscontrole na elk onderdeel van de synthese. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) onthult de vorm van de gouden kern en de succesvolle formatie van de silica shell zonder nanoparticle aggregatie; Schaal bar = 100 nm. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) kan meten de omvang en de ζ-mogelijkheden van de nanodeeltjes om succesvolle silication en functionalization te controleren. UV/Vis-absorptie kan worden gebruikt ter bevestiging van de aanwezigheid van een Enterprise piek rond 670 nm voor de nanostars, verschuiven naar 710 nm na silication. Raman metingen onthullen de aanwezigheid van de unieke spectra van elke smaak gedurende de synthese. De intensiteit van het nanostar-spectrum, met geen karakteristieke pieken, werd versterkt door 100 x voor nadruk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Verwerking van Raman spectra. Ruwe spectra bestaan uit de nanoprobes' SERRS handtekening, gesuperponeerd op de top van een breed fluorescentie-band. Met basislijn aftrekken de fluorescentie-band is verwijderd, en de Raman pieken prominente. Oog op de opsporing van de spectrale signatuur van de nanodeeltjes ongeacht de intensiteit, is elke spectrum (verwijzingen en monsters gelijk) genormaliseerd naar oppervlakte-eenheid. Tot slot wordt een smoothing-afgeleide filter toegepast om te stimuleren de Raman pieken, terwijl het verminderen van lawaai. De verwerkte referentie spectra worden gebruikt om een CLS-model, om het classificeren van de spectra van de verwerkte monster op basis van de verhouding R. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Ratiometric beeldvorming van eierstokkanker micrometastasen in de buik. Raman beeldvorming van de blootgestelde buik van een muis, met uitgebreide ovariële metastasen zoals geopenbaard door bioluminescentie imaging. Elk punt van de scan beschikt over een spectrum, dat is verwerkt (sectie 6, Figuur 3) en scoorde gebaseerd op een model van de CLS, te verkrijgen van de scores op de twee verwijzingen wordt gemaakt: αFR-NP in rood en nt-NP in blauw weergegeven. De scores worden vervolgens puntsgewijs, gedeeld te onthullen van de relatieve abundantie van de twee sondes als een verhouding. Eventueel door drempelmethode de verhouding, de "positieve" gebieden kunnen bovenliggende op een optische beeld van de buik, resectie of andere gerichte behandelingen. Figuur 4 is een aangepaste versie van referentie1, met toestemming van het dagboek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voorziet het protocol beschreven hier instructie voor de synthese van twee "flavors" van SERRS nanoprobes, en hun werkgelegenheid in muizen Raman imaging van ovariële tumor overexpressing de Receptor van folaat, een ratiometric algoritme gebruikt. Het belangrijkste voordeel van Raman imaging over andere optische beeldvormende technieken (zoals fluorescentie) is de hoge specificiteit van het nanosonde signaal dat niet kan worden verward met alle signalen van biologische oorsprong. In deze belichaming van Raman imaging, worden de nanodeeltjes niet beheerd intraveneus, maar lokaal, via een intraperitoneale injectie, gevolgd door een enkele wassen stap. Deze methodiek, eens vertaald naar de klinische arena, zou een elegante oplossing om chirurgen om te visualiseren en daarom resect alle eierstokkanker implantaten, zelfs degenen die zijn te klein om op te sporen met het blote oog, en die niet kunnen worden gericht met een systemisch ingespoten imaging agent wegens hun gebrek aan voeding vaartuigen aangesloten op de systemische circulatie. Op hetzelfde moment, zoals onze SERRS nanodeeltjes worden niet geresorbeerd in de systemische circulatie, potentiële zorgen voor bijwerkingen minimum worden beperkt. Onze studie is een voorbeeld van de steeds meer aanwijzingen dat zorgvuldig nanoconstructs ontworpen kan bieden unieke voordelen ten opzichte van conventionele beeldvorming en therapie technologieën22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35,,36,,37,38.
De nanoprobes van de SERRS die hier worden beschreven zijn biologisch en inert voor tumor afbakening in muismodellen van verschillende soorten kanker zijn tewerkgesteld. De reactie voor de vorming van de (gelijktijdig met verslaggever kleurstof inkapseling) silica-shell is een verbeterde versie van onze eerder gemelde synthese1,7,8, die is minder vatbaar voor nanoparticle aggregatie en de vorming van "vrije silica" nanodeeltjes (zonder gouden kern). De reactie kan worden gebruikt met een scala aan verkrijgbare infrarood organische kleurstoffen, naast de gepresenteerde, zodanig dat deze een grote collectie van Raman smaken. De resulterende signaal intensiteit, is echter afhankelijk van de kleurstof van affiniteit met goud, en andere factoren. Daarnaast, moet de hoeveelheid kleurstof toegevoegd aan de reactie worden vastgesteld op basis van het per-kleurstof, zoals bepaalde moleculen en hun counterions aggregatie van de gouden nanostars meer dan anderen veroorzaken. In het geval van ernstige nanoparticle aggregatie, moet de hoeveelheid kleurstof gebruikt wordt verlaagd. Aggregatie van de gouden kernen is ongewenst, aangezien het kan leiden ernstige variabiliteit in de Raman signaalsterkte tot en de opgehaalde gegevens bemoeilijken. De vorming van vrije silica is voor het grootste deel onschuldig, omdat het geen Raman-signaal. Echter, tijdens de functionalization de antilichamen voldoet aan silica nanodeeltjes, het afnemen van de algemene targeting doeltreffendheid van de methode. De dikte van de schelp van silica, is afhankelijk van reactietijd, temperatuur en de hoeveelheid water toegevoegd (stap 2.1). Als de resulterende silica-shell wordt geacht te dun (Figuur 1, rechtsboven), kan een of meer van deze parameters verhoogd worden.
Met betrekking tot data-acquisitie, zijn de kwaliteit sterk afhankelijk van de helderheid van de nanoprobes. Dit wordt vooral duidelijk bij het uitvoeren van snelle Raman verwerving, zoals beschreven in sectie 5. Om ervoor te zorgen dat de gegevens zich voldoende te onderscheiden van het lawaai, de spectra moeten worden geïnspecteerd, en de aanwezigheid van de vertegenwoordiger Raman-pieken van de sondes geverifieerd. Als het signaal te zwak is, kan de belichtingstijd per punt worden verhoogd. Deze benadering kan echter leiden tot onbetaalbaar lange scans of zeer lage ruimtelijke resolutie. Reproduceerbaarheid en consistentie te garanderen, kalibratie van de Raman scanner moeten worden uitgevoerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant en wordt meestal gedaan met behulp van een gemeenschappelijke norm (b.v., een silicium wafer).
Een van de belangrijkste troeven van deze methode is zijn veelzijdigheid. Verschillende tumor typen kunnen worden beeld met behulp van specifieke antilichamen gericht op verschillende moleculaire merkers. Bovendien, de nanoprobes die hier beschreven kan worden toegediend aan dierlijke modellen — intraperitoneally of intraveneus — maar ook, met dezelfde technieken, ze kunnen worden gebruikt om vlekken van weefsels, vaste of vers weggesneden.
Hoewel de ratiometric techniek specificiteit voor detectie van microscopische tumoren biedt, is de verdeling van de afzonderlijke sondes niet specifiek voor de gebieden van de tumor. Dit betekent dat theranostic technieken zoals photothermal/Fotodynamische therapie of drug-laden niet zou ideaal zijn, zoals de therapie zou worden geleverd aan de gezonde gebieden zo goed. Een potentiële therapeutische toepassing die worden geboden door deze techniek zou de geautomatiseerde ablatie van microtumors na ratiometric detectie.
Wij hopen dat dit lokaal, ratiometric aanpak van Raman imaging de weg kan effenen voor het gebruik van SERRS nanoprobes, na de nodige klinische proeven, als een agent moleculaire beeldvorming bij patiënten. Deze methode werd ontwikkeld om compatibel te zijn met de mogelijke toekomstige toepassingen bij de mens, als de nanodeeltjes kon worden toegediend aan en verwijderd uit de buikholte met behulp van apparaten die al in klinische gebruik voor HIPEC zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
• MFK wordt vermeld als een uitvinder op verschillende afgegeven of in afwachting van octrooiaanvragen aan dit werk gerelateerde. MFK is een mede-oprichter van RIO Imaging, Inc, die gericht is op het vertalen van SERRS nanodeeltjes in de klinieken.
• De auteurs verklaren dat zij geen andere concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De volgende financieringsbronnen (naar MFK) zijn erkend: NIH R01 EB017748, R01 CA222836 en K08 CA16396; Damon Runyon-Rachleff innovatie Award DRR-29-14, Pershing Square Sohn prijs door de Alliantie voor energieonderzoek van Pershing Square Sohn kanker, en MSKCC centrum voor moleculaire beeldvorming & nanotechnologie (CMINT) en technologieontwikkeling verleent. Bevestigingen zijn ook uitgebreid tot de subsidiefinanciering ondersteuning die wordt geboden door de MSKCC NIH Core subsidie (P30-CA008748).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent | |||
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| 3-MPTMS | Sigma-Aldrich | 175617 | |
| Ammonium hydroxide (28%) | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| Anti-Folate Receptor antibody [LK26] | AbCam | ab3361 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Dimethyl sulfoxide (anhydrous) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| IR140 | Sigma-Aldrich | 260932 | |
| IR780 perchlorate* | Sigma-Aldrich | 576409 | Discontinued* |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| N.N.Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| PEG crosslinker | Sigma-Aldrich | 757853 | |
| PEG-maleimide | Sigma-Aldrich | 900339 | |
| Tetrachloroauric Acid | Sigma-Aldrich | 244597 | |
| Tetraethyl Orthosilicate | Sigma-Aldrich | 86578 | |
| *IR792 | Sigma-Aldrich | 425982 | *Alternative |
| Name of Equipment | |||
| Dialysis cassette (3,500 MWCO) | ThermoFIsher | 87724 | |
| Centrifugal filters | Millipore | UFC510096 | |
| inVia confocal Raman microscope | Renishaw | ||
| MATLAB (v2014b) | Mathworks | ||
| PLS Toolbox (v8.0) | Eigenvector research |
References
- Oseledchyk, A., Andreou, C., Wall, M. A., Kircher, M. F. Folate-Targeted Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detection of Microscopic Ovarian Cancer. ACS Nano. 11 (2), 1488-1497 (2017).
- Andreou, C., et al. Imaging of Liver Tumors Using Surface-Enhanced Raman Scattering Nanoparticles. ACS Nano. 10 (5), 5015-5026 (2016).
- Karabeber, H., et al. Guiding brain tumor resection using surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and a hand-held Raman scanner. ACS Nano. 8 (10), 9755-9766 (2014).
- Kircher, M. F., et al. A brain tumor molecular imaging strategy using a new triple-modality MRI-photoacoustic-Raman nanoparticle. Nature Medicine. 18 (5), 829-834 (2012).
- Andreou, C., Kishore, S. A., Kircher, M. F. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy: A New Modality for Cancer Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1295-1299 (2015).
- Harmsen, S., et al. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nature Communications. 6, 6570 (2015).
- Harmsen, S., et al. Surface-enhanced resonance Raman scattering nanostars for high-precision cancer imaging. Science Translational Medicine. 7 (271), 271ra277 (2015).
- Harmsen, S., Wall, M. A., Huang, R., Kircher, M. F. Cancer imaging using surface-enhanced resonance Raman scattering nanoparticles. Nature Protocols. 12 (7), 1400-1414 (2017).
- Huang, R., et al. High Precision Imaging of Microscopic Spread of Glioblastoma with a Targeted Ultrasensitive SERRS Molecular Imaging Probe. Theranostics. 6 (8), 1075-1084 (2016).
- Iacono, P., Karabeber, H., Kircher, M. F. A "schizophotonic" all-in-one nanoparticle coating for multiplexed SE(R)RS biomedical imaging. Angewandte Chemie, International Edition in English. 53 (44), 11756-11761 (2014).
- Spaliviero, M., et al. Detection of Lymph Node Metastases with SERRS Nanoparticles. Molecular Imaging and Biology. 18 (5), 677-685 (2016).
- Nayak, T. R., et al. Tissue factor-specific ultra-bright SERRS nanostars for Raman detection of pulmonary micrometastases. Nanoscale. 9 (3), 1110-1119 (2017).
- Thakor, A. S., et al. The fate and toxicity of Raman-active silica-gold nanoparticles in mice. Science Translational Medicine. 3 (79), 79ra33 (2011).
- Liu, J., et al. Effects of Cd-based Quantum Dot Exposure on the Reproduction and Offspring of Kunming Mice over Multiple Generations. Nanotheranostics. 1 (1), 23-37 (2017).
- Wu, N., et al. The biocompatibility studies of polymer dots on pregnant mice and fetuses. Nanotheranostics. 1 (3), 261-271 (2017).
- Garai, E., et al. High-sensitivity real-time, ratiometric imaging of surface-enhanced Raman scattering nanoparticles with a clinically translatable Raman endoscope device. Journal of Biomedical Optics. 18 (9), 096008 (2013).
- Wang, Y. W., et al. Rapid ratiometric biomarker detection with topically applied SERS nanoparticles. Technology (Singap World Sci). 2 (2), 118-132 (2014).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Vergote, I. B., Marth, C., Coleman, R. L. Role of the folate receptor in ovarian cancer treatment: evidence, mechanism, and clinical implications. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 41-52 (2015).
- Fasolato, C., et al. Folate-based single cell screening using surface enhanced Raman microimaging. Nanoscale. 8 (39), 17304-17313 (2016).
- Wang, Y. W., et al. Raman-Encoded Molecular Imaging with Topically Applied SERS Nanoparticles for Intraoperative Guidance of Lumpectomy. Cancer Research. 77 (16), 4506-4516 (2017).
- Andreou, C., Pal, S., Rotter, L., Yang, J., Kircher, M. F. Molecular Imaging in Nanotechnology and Theranostics. Molecular Imaging and Biology. 19 (3), 363-372 (2017).
- Chitgupi, U., Qin, Y., Lovell, J. F. Targeted Nanomaterials for Phototherapy. Nanotheranostics. 1 (1), 38-58 (2017).
- Choi, D., et al. Iodinated Echogenic Glycol Chitosan Nanoparticles for X-ray CT/US Dual Imaging of Tumor. Nanotheranostics. 2 (2), 117-127 (2018).
- Dubey, R. D., et al. Novel Hyaluronic Acid Conjugates for Dual Nuclear Imaging and Therapy in CD44-Expressing Tumors in Mice In Vivo. Nanotheranostics. 1 (1), 59-79 (2017).
- Gupta, M. K., et al. Recent strategies to design vascular theranostic nanoparticles. Nanotheranostics. 1 (2), 166-177 (2017).
- Huang, Y. J., Hsu, S. H. TRAIL-functionalized gold nanoparticles selectively trigger apoptosis in polarized macrophages. Nanotheranostics. 1 (3), 326-337 (2017).
- Pal, S., Harmsen, S., Oseledchyk, A., Hsu, H. T., Kircher, M. F. MUC1 Aptamer Targeted SERS Nanoprobes. Advanced Functional Materials. 27 (32), (2017).
- Zanganeh, S., et al. Iron oxide nanoparticles inhibit tumour growth by inducing pro-inflammatory macrophage polarization in tumour tissues. Nat Nanotechnol. 11 (11), 986-994 (2016).
- Lee, J., Lee, Y. M., Kim, J., Kim, W. J. Doxorubicin/Ce6-Loaded Nanoparticle Coated with Polymer via Singlet Oxygen-Sensitive Linker for Photodynamically Assisted Chemotherapy. Nanotheranostics. 1 (2), 196-207 (2017).
- Li, R., Zheng, K., Yuan, C., Chen, Z., Huang, M. Be Active or Not: the Relative Contribution of Active and Passive Tumor Targeting of Nanomaterials. Nanotheranostics. 1 (4), 346-357 (2017).
- Lin, S. Y., Huang, R. Y., Liao, W. C., Chuang, C. C., Chang, C. W. Multifunctional PEGylated Albumin/IR780/Iron Oxide Nanocomplexes for Cancer Photothermal Therapy and MR Imaging. Nanotheranostics. 2 (2), 106-116 (2018).
- Roberts, S., et al. Sonophore-enhanced nanoemulsions for optoacoustic imaging of cancer. Chemical Science (Royal Society of Chemistry: 2010). 9 (25), 5646-5657 (2018).
- Liu, L., Ruan, Z., Yuan, P., Li, T., Yan, L. Oxygen Self-Sufficient Amphiphilic Polypeptide Nanoparticles Encapsulating BODIPY for Potential Near Infrared Imaging-guided Photodynamic Therapy at Low Energy. Nanotheranostics. 2 (1), 59-69 (2018).
- Liu, R., Tang, J., Xu, Y., Zhou, Y., Dai, Z. Nano-sized Indocyanine Green J-aggregate as a One-component Theranostic Agent. Nanotheranostics. 1 (4), 430-439 (2017).
- Sneider, A., VanDyke, D., Paliwal, S., Rai, P. Remotely Triggered Nano-Theranostics For Cancer Applications. Nanotheranostics. 1 (1), 1-22 (2017).
- Wall, M. A., et al. Surfactant-Free Shape Control of Gold Nanoparticles Enabled by Unified Theoretical Framework of Nanocrystal Synthesis. Advanced Materials. 29 (21), (2017).
- Sonali,, et al. Nanotheranostics: Emerging Strategies for Early Diagnosis and Therapy of Brain Cancer. Nanotheranostics. 2 (1), 70-86 (2018).
