Kræft i æggestokkene danner metastaser i hele bughulen. Her præsenterer vi en protokol til at foretage og brug folat-receptor målrettet overflade-forstærket resonans Raman spredning nanoprobes, der afslører disse læsioner med høj specificitet via ratiometric imaging. Nanoprobes er blevet administreret intraperitoneal til levende mus, og de afledte billeder korrelere godt med histologi.
Kræft i æggestokkene repræsenterer den dødeligste gynækologisk malignitet. De fleste patienter til stede på et fremskredent stadium (FIGO stadie III eller IV), når lokale metastatisk sprede allerede er indtruffet. Kræft i æggestokkene har imidlertid et entydigt mønster af metastatisk spredning, idet tumor implantater er oprindeligt indeholdt i bughulen. Denne funktion kunne aktivere, i princippet, det komplette resektion af tumor implantater med helbredende hensigt. Mange af disse metastatisk læsioner er mikroskopiske, hvilket gør dem svære at identificere og behandle. Neutralisere sådanne micrometastases menes at være et vigtigt mål mod at fjerne tumor recidiv og opnå langsigtet overlevelse. Raman imaging med overflade forbedret resonans Raman spredning nanoprobes kan bruges til at afgrænse mikroskopiske tumorer med høj følsomhed, på grund af deres lyse og bioorthogonal spektrale signaturer. Her, vi beskrive syntesen af to varianter af sådanne nanoprobes: et antistof-functionalized, der henvender sig til folat receptor — overexpressed i mange ovariecancer — og en ikke-målrettet kontrol nanoprobe, med forskellige spektre. Nanoprobes er co-administreret intraperitoneal til musemodeller af metastatisk menneskelige æggestokkene adenocarcinom. Alle dyreforsøg blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Bughulen i dyr er kirurgisk udsat, vasket og scannet med en Raman microphotospectrometer. Efterfølgende Raman underskrifter fra de to nanoprobes er afkoblet, ved hjælp af en klassisk mindste kvadraters montering algoritme, og deres respektive scores opdelt til at give et ratiometric signal af folat-målrettet over ikke-målrettede sonder. På denne måde, er mikroskopiske metastaser visualiseret med høj specificitet. Den største fordel ved denne tilgang er, at den lokale ansøgning ind i bughulen — som kan gøres praktisk under den kirurgiske procedure – kan mærke tumorer uden at udsætte patienten for systemisk nanopartikel eksponering. Falsk positive signaler, som stammer fra ikke-specifik binding af nanoprobes på visceral overflader kan elimineres ved at følge en ratiometric tilgang, hvor målrettet og ikke-målrettet nanoprobes med særskilte Raman signaturer er anvendt som en blanding. Proceduren, der er i øjeblikket stadig begrænset af manglen på en kommerciel wide-felt Raman imaging kamerasystem, som engang tilgængelige vil give mulighed for anvendelse af denne teknik i teatret drift.
Raman imaging med overflade forbedret Raman spredning (SERS) nanopartikler har vist lovende i skildrer læsioner i en række indstillinger og for mange forskellige tumor typer1,2,3,4 . Den største fordel ved SERS nanopartikler er deres fingeraftryk-lignende spektrale signatur, giver dem ubestridelige registrering, der ikke er forvirret af biologiske baggrund signaler5. Derudover intensiteten af det udsendte signal forstærkes yderligere med brug af reporter molekyler (farvestoffer) med absorbans maxima i overensstemmelse med excitation laser, giver anledning til overflade forbedret resonans Raman spredning (SERRS) nanopartikler med endnu større følsomhed6,7,8,9,10,11,12.
En barriere, der skal løses for vedtagelse af SE(R)RS nanopartikler13 og mange andre nanopartikel konstruktioner14,15 til klinisk brug er deres tilstand af administration, som intravenøs injektion forårsager systemisk eksponering af agent, og nødvendiggør omfattende test for at udelukke potentielle skadevirkninger. I denne artikel, vi præsenterer en anden paradigme baseret på anvendelsen af nanopartikler lokalt i vivo, direkte ind i bughulen under operationen, efterfulgt af en vask skridt til at fjerne enhver ubundne nanopartikler1. Denne tilgang er i overensstemmelse med roman terapeutiske tilgange, der er i øjeblikket under efterforskning, der også gør brug af lokale instillation af agenter ind i bughulen, kaldet hyperthermic intraperitoneal kemoterapi (HIPEC). Derfor, selve princippet bør være relativt let at integrere i en klinisk arbejdsproces. Vi har studeret biodistribution af nanopartikler efter intraperitoneal ansøgningen, og har ikke observeret nogen påviselig absorption i systemisk cirkulation1. Derudover omgår lokale ansøgning tilgang binding af nanopartikler af Retikuloendoteliale system, så antallet af nanopartikler kræves reduceres markant. Men, når det påføres topisk, antistof-functionalized nanopartikler tendens til at holde sig på de viscerale overflader selv i mangel af deres mål. For at minimere falske positive signaler på grund af ikke-specifik nanopartikel vedhæftning, forfølger vi en ratiometric tilgang, hvor et molekylært målrettet nanoprobe giver den specifikke signal og en ikke-målrettet kontrol nanoprobe, med forskellige Raman spektrum, regnskaber for ikke-specifikke baggrund16,17. Vi har vist denne metode af topikalt overflade forbedret resonans Raman ratiometric spektroskopi for nylig i en musemodel af diffuse æggestokkræft1.
Det overordnede mål med denne metode er at udvikle to SERRS nanoprobes, en målrettet og en ikke-specifik, skal anvendes lokalt i musemodeller, for at billede prævalens/overekspression af en cancer-relaterede biomarkør ved hjælp af ratiometric påvisning af de to sonder via Raman imaging. I dette arbejde, blev folat receptor (FR) valgt som mål, da dette er en markør upregulated i mange ovariecancer18,19. Raman microimaging med SERS-baserede nanopartikler er også blevet påvist for kræft celle identifikation20. To forskellige “varianter” af Raman nanopartikler er syntetiseret, hver der følger sit fingeraftryk fra en forskellige økologiske farvestof. Nanopartikler består af en stjerne-formet guld kerne omgivet af en silica shell og demonstrere overflade plasmon resonans på ca 710 nm. Raman reporter (økologisk farvestof) deponeres samtidig med dannelsen af silica shell. Endelig til den FR-målrettet nanoprobes (αFR-NPs) er silica shell konjugeret med antistoffer, der henviser til, at de ikke-målrettet nanoprobes (nt-NPs) er passivated med en éncellelag af polyethylenglycol (PEG).
Denne teknik var med held bruges til at knytte mikroskopiske tumorer i mus xenograft model af diffuse metastatisk kræft i æggestokkene (SKOV-3), viser sin anvendelighed til in vivo brug. Det kan også udvides til anvendelse i skåret væv, tumor fænotyper eller margin bestemmelse efter debulking som vist i en beslægtet undersøgelse21.
SERRS nanoprobes skabe en robust platform for oprettelsen af flere målrettede tags for biomarkører, syntetiseret med enkle kemiske reaktioner som skitseret skematisk i figur 1. Vi præsenterer her, protokol for syntesen af de to typer af SERRS nanoprobes (afsnit 1-3), udviklingen af en passende æggestokkræft musemodel (afsnit 4), administration af nanoprobes og billeddannelse (afsnit 5), og endelig dataanalyse og visualisering (afsnit 6).
Protokollen beskrevet her giver instruktion for syntesen af to “varianter” af SERRS nanoprobes, og deres beskæftigelse i mus for Raman imaging af æggestokkene tumor overekspression folat Receptor, bruger en ratiometric algoritme. Den største fordel af Raman imaging over andre optiske billeddannelse teknikker (såsom fluorescens) er det nanoprobe signal, som ikke kan blive forvirret med alle signaler af biologisk oprindelse høj specificitet. I dette legemliggørelse af Raman imaging, er nanopartikler ikke administrere…
The authors have nothing to disclose.
De følgende finansieringskilder (til M.F.K.) anerkendes: NIH R01 EB017748, R01 CA222836 og K08 CA16396; Damon Runyon-Rachleff Innovation Award DRR-29-14, Pershing Square Sohn præmie ved Pershing Square Sohn Cancer Research Alliance og MSKCC Center for molekylær billeddannelse & nanoteknologi (CMINT) og den teknologiske udvikling giver. Bekræftelser er også udvidet til MSKCC NIH Core Grant (P30-CA008748) tilskud støtte.
Name of Reagent | |||
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
3-MPTMS | Sigma-Aldrich | 175617 | |
Ammonium hydroxide (28%) | Sigma-Aldrich | 338818 | |
Anti-Folate Receptor antibody [LK26] | AbCam | ab3361 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Dimethyl sulfoxide (anhydrous) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | |
IR140 | Sigma-Aldrich | 260932 | |
IR780 perchlorate* | Sigma-Aldrich | 576409 | Discontinued* |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
N.N.Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
PEG crosslinker | Sigma-Aldrich | 757853 | |
PEG-maleimide | Sigma-Aldrich | 900339 | |
Tetrachloroauric Acid | Sigma-Aldrich | 244597 | |
Tetraethyl Orthosilicate | Sigma-Aldrich | 86578 | |
*IR792 | Sigma-Aldrich | 425982 | *Alternative |
Name of Equipment | |||
Dialysis cassette (3,500 MWCO) | ThermoFIsher | 87724 | |
Centrifugal filters | Millipore | UFC510096 | |
inVia confocal Raman microscope | Renishaw | ||
MATLAB (v2014b) | Mathworks | ||
PLS Toolbox (v8.0) | Eigenvector research |