Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Поверхность расширение резонанс комбинационного рассеяния Nanoprobe Ratiometry для обнаружения микроскопического рака яичников через рецептор фолиевой кислоты ориентации

Published: March 25, 2019 doi: 10.3791/58389
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3,4,5,6,7
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Department of Chemistry, The Graduate Center of the City University of New York, 3Molecular Pharmacology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT), Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 5Gerstner Sloan Kettering Graduate School of Biomedical Sciences, 6Department of Radiology, Weill Cornell Medical College of Cornell University, 7Dana-Farber Cancer Institute and Harvard Medical Center

Summary

Рак яичников образует метастазы всей брюшной полости. Здесь мы представляем протокол сделать и использования фолиевой кислоты рецептор целевой поверхности расширение резонанс комбинационного рассеяния nanoprobes, которые показывают эти поражения с высокой специфичности через ratiometric изображений. Nanoprobes находятся в ведении внутрибрюшинно жизни мышей, и производные изображения хорошо коррелируют с гистологии.

Abstract

Рак яичников представляет смертоносных гинекологических злокачественных новообразований. Большинство пациентов представляют на продвинутой стадии (FIGO стадии III или IV), когда местное метастатического распространения уже произошло. Однако рак яичников имеет уникальный узор метастатическим распространения, в том, что опухоль имплантатов изначально содержащиеся в брюшной полости. Эта функция может включить, в принципе, полной резекции опухоли имплантатов с лечебной целью. Многие из этих метастатического поражения являются микроскопические, что делает их трудно выявлять и лечить. Нейтрализации таких микрометастазы считается одной из основных целей на ликвидацию рецидива опухоли и достижение долгосрочного выживания. Раман изображений с поверхности расширенной резонанс комбинационного рассеяния nanoprobes может использоваться для разграничения микроскопические опухоли с высокой чувствительностью, из-за их яркие и bioorthogonal спектральные характеристики. Здесь мы описываем синтез двух «вкусов» такой nanoprobes: антитела функционализированных один, использующий рецепторов фолиевой кислоты — оверэкспрессировали в многих яичников — и не являющихся объектом управления nanoprobe, с различных спектров. Nanoprobes совместно управляемых внутрибрюшинно по модели мыши метастатическим человеческого аденокарциномы яичника. Все исследования на животных были утверждены институциональный уход животных и использование Комитета из Мемориал Слоун Kettering Рак центр. Брюшной полости животных хирургически воздействию, промывают и отсканированных с microphotospectrometer Раман. Впоследствии Раман подписи двух nanoprobes несвязанной с использованием алгоритма установку классических наименьших квадратов, и их соответствующие результаты разделены предоставлять сигнал ratiometric фолиевой кислоты ориентированных над нецелевого зондов. Таким образом микроскопические метастазы визуализируются с высокой точностью. Основное преимущество этого подхода является то, что местные приложение в брюшной полости — что может быть сделано удобно во время хирургической процедуры — можно пометить опухоли без подвергать системных наночастиц облучения пациента. Ложного срабатывания сигналов вытекающих из привязки неспецифические nanoprobes на внутренних поверхностях могут быть устранены путем после ratiometric подход, где целевые и нецелевые nanoprobes с различных Раман подписи применяются как смесь. Процедура в настоящее время по-прежнему ограничивается отсутствием коммерческих Раман поля изображений камеры системы, которая однажды доступны позволит для применения этой техники в эксплуатации театре.

Introduction

Раман изображений с «Поверхности расширенной комбинационного рассеяния» наночастиц (Серов) показал большие перспективы в определении поражений в различных настроек и для многих опухоли различных типов1,2,3,4 . Основным преимуществом наночастицы SERS является их отпечатков пальцев как спектральные подписи, предоставляя им несомненные обнаружения, которая не посрамлены биологических фона сигналов5. Кроме того, далее усиливается интенсивность излучаемого сигнала с использованием репортер молекул (красители) с максимумами поглощения соответствует лазерного возбуждения, рождая «поверхности расширенной резонанс комбинационного рассеяния» (SERRS) наночастицы с еще большей чувствительности6,,78,9,10,11,12.

Один барьер, который необходимо решить для принятия SE(R)RS наночастиц13 и многих других наночастиц конструкции14,15 для клинического применения является их режим администрации, как внутривенные инъекции вызывает системные воздействия агента и тщательное тестирование, чтобы исключить возможные побочные эффекты. В этой статье, мы представляем различные парадигмы, на основе применения наночастиц локально в естественных условиях, непосредственно в брюшной полости во время операции, следуют Стиральная шаг, чтобы удалить любые свободные наночастиц1. Этот подход соответствует роман терапевтических подходов, которые в настоящее время находятся под следствием, которые также делают использование местных инстилляции агентов в брюшной полости, под названием гипертермические внутрибрюшинной химиотерапии (многосторонних). Таким образом сам принцип должна быть относительно легко интегрировать в клинической рабочего процесса. Мы изучили накопление наночастиц после внутрибрюшинного приложения и не наблюдается любых обнаруживаемых поглощение в кровообращения1. Кроме того местного применения подхода обходит поглощение наночастиц ретикулоэндотелиальной системы, поэтому количество наночастиц требуется заметно снижаются. Однако когда применяется местно, антитела функционализированных наночастиц, как правило, придерживаются висцеральная поверхность даже в отсутствие их цели. Для того, чтобы свести к минимуму ложных положительных сигналов за счет адгезии неспецифической наночастиц, мы преследуем ratiometric подход, где молекулярно целевых nanoprobe обеспечивает характерный сигнал и не ориентированные управления nanoprobe, с различными спектр Раман, счета для неспецифической фон16,17. Мы продемонстрировали эту методологию злободневно прикладной поверхности расширенной резонансная рамановская спектроскопия ratiometric недавно в мышиной модели диффузных рака яичников1.

Общая цель этого метода заключается в разработке два SERRS nanoprobes, один целевой и один-неспецифический, чтобы быть применен локально в моделях мыши, чтобы изображение распространенности/гиперэкспрессия рака связанных биомаркеров, используя ratiometric обнаружение двух зондов через Раман изображений. В этой работе фолиевая кислота рецепторов (FR) был выбран в качестве цели, как это маркер upregulated в многих яичников18,19. Также было продемонстрировано Раман microimaging с SERS-на основе наночастиц для идентификации клеток рака20. Два отдельных «ароматизаторы» наночастиц Раман синтезируются, каждый вытекающих его отпечаток из различных органических красителей. Наночастицы состоят из звездных золото ядра, окруженный оболочке кремнезема и продемонстрировать поверхностного плазмон резонанс на приблизительно 710 Нм. Раман репортер (органический краситель) наносится параллельно с формирование кремнезема оболочки. Наконец для FR-ориентированных nanoprobes (αFR-NPs) оболочке кремнезема конъюгированных с антителами, тогда как нецелевые nanoprobes (nt-NPs) пассивируется с монослоя полиэтиленгликоля (PEG).

Этот метод был успешно используется для сопоставления микроскопические опухоли в мышиной модели ксенотрансплантата диффузных метастатического рака яичников (SKOV-3), демонстрируя свою применимость в естественных условиях использования. Она также может быть продлен для использования в подакцизным тканей, опухоли фенотипа, или определение разницы после debulking как показано в родственных исследование21.

SERRS nanoprobes обеспечивают надежную платформу для создания нескольких целевых теги для биомаркеров, синтезируются с простой химических реакций, схематически изложенные на рисунке 1. Здесь мы представляем протокол для синтеза двух типов SERRS nanoprobes (разделы 1-3), разработка модели мыши подходящий рак яичников (раздел 4), администрация nanoprobes и изображений (раздел 5) и, наконец, анализ данных и Визуализация (раздел 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все исследования на животных были утверждены институциональный уход животных и использование Комитета из Мемориал Слоун Kettering Рак центр (#06-07-011).

1. Золотая Nanostar Core синтез

Примечание: Золото nanostars используются в качестве ядра для обоих видов SERRS nanoprobes, используемый в этом эксперименте.

  1. Подготовка 800 мл раствора (C6H8O6) 60 мм аскорбиновой кислоты в деионизированной воде (DI) и 8 мл раствора 20 мм tetrachloroauric кислоты (HAuCl4) в воде ди. Охладите до 4 ° C.
  2. Выполните этот шаг реакции при 4 ° C. Место Конические колбы, содержащий 800 мл раствора аскорбиновой кислоты на Плиты магнитные перемешать и стимулировать устойчивый вихря. Быстро добавьте 8 мл раствора tetrachloroauric кислоты в водоворот. В течение нескольких секунд станут nanostars и решение будет нести темно-синий цвет. В случае, если цвет в любое время становится, розовые или фиолетовые, означающий формирования nanospheres, должны быть отброшены подвеска и синтез reattempted.
  3. Залейте подвеска nanostar в 50 мл конические трубы и центрифуги для 20 мин (4 ° C, 3220 x g). Аспирационная супернатанта, оставляя приблизительно 200 мкл раствора в каждой тюбике. Оплатить осторожность, чтобы не мешать Пелле наночастиц в нижней части трубки.
    Примечание: Супернатант должен иметь синий оттенок из-за оставшихся приостановленных nanostars.
  4. С помощью микропипеткой, агитируйте решение приостановить и собирать наночастиц из каждой трубы. Частью гранулы могут сжиматься в нижней части трубки и не Ресуспензируйте даже с энергичной дозирование отменить эту часть.
  5. Передача наночастиц подвеска диализа кассету (MWCO 3.5 кДа) и dialyze по крайней мере три дня против 2 Л воды ди, ежедневно меняя воду. Хранить nanostars диализа при 4 ° C до месяца с воды меняется каждые 3-4 дня.
    Примечание: Nanostars должны храниться в диализе до тех пор, пока требуется для Силикатизация реакции, как описано в разделе 2.

2. формирование оболочке кремнезема

Примечание: Двух вариантах Раман nanoprobes синтезированы. Синтез процедура одинакова для обоих, с той лишь разницей в молекуле репортер Раман (краска) используется. В этом эксперименте перхлорат IR780 и IR140 используются. Реакция всегда должно проводиться в пластиковых контейнерах. Синтез высоко масштабируемой и может быть скорректирована для нужное количество injectate требуется. Здесь описан синтез средних партии, которая может масштабироваться линейно выше или ниже томов при необходимости, с же концентрации и времени реакции. Реакции для двух типов nanoprobe SERRS могут выполняться параллельно. Обратите внимание, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Sonication должна выполняться для редиспергируемые наночастиц гранул после центрифугирования во время стирки шаги, или после наночастиц хранились дольше, чем один час. Sonication должны быть выполнены до тех пор, пока наночастиц явно приостановлены в решение, как правило, для 1 s.

  1. В метро A (Тюбик 50 мл конические), Смешайте 10 мл изопропиловый спирт, 500 мкл Теос, 200 мкл воды ди, и 60 мкл концентрированного красителя (перхлорат IR780 или IR140, 20 мм в DMF (диметилформамид)).
  2. В метро B (15 мл Конические трубки) Смешайте 3 мл этанола и 200 мкл рабочего раствора гидроксида аммония. Sonicate nanostars от шаг 1.4 разогнать любых кластерах в раствор и добавить 1,2 мл nanostars в трубку.
    Примечание: раствор гидроксида аммония крайне неустойчивой и трудно точно Пипетка. Храните его при температуре 4 ° C, до тех пор, пока требуется, чтобы облегчить закупорить.
  3. Трубка A на вихревой смеситель и стимулировать устойчивый вихря. Быстро добавить содержимое трубки B в водоворот и держать смешивания для около 5 s. немедленно перевести в шейкер и пусть РЕАКТ за 15 мин при встряхивании в 300 об/мин, при комнатной температуре.
  4. После инкубации 15 мин утолите реакции, добавив этанола для заполнения Тюбик 50 мл. Центрифуги для 20 минут, 3220 x g и 4 ° C.
  5. Аспирационная супернатанта, оставив около 0,5 мл раствора, стараясь не нарушить гранулы. Добавьте 1 mL этанола и агитировать с пипеткой Ресуспензируйте наночастиц. Трансфер в 1,5 мл пластиковых пробирок и мыть 4 раза с этанолом, центрифугирование в g 11000 x 4 мин, аспирационных супернатант и resuspending гранулы, ultrasonication для приблизительно 1 s.
    Примечание: На данном этапе силикатные наночастицы могут функционализированных, как описано в разделе 3, или высокомобильна в воде ди с дополнительной стирки шаг, для хранения на 4 ° C на срок до недели.

3. поверхности функционализации

Примечание: IR780 SERRS nanoprobes будет проспряганное с фолиевая кислота рецепторов таргетинг антитела через сшивателя КОЛЫШЕК в форме αFR-ЯИЭ; IR140 SERRS управления nanoprobes будет проспряганное с пассивирующего монослоя PEG, для nt NPs. Оба вкусов формируются через тиоловых maleimide реакции, в отдельных, но параллельных реакций.

  1. Вымойте наночастиц дважды, центрифугирование в 11000 x g 4 мин, аспирационных супернатант и resuspending гранулы в 1 мл этанола, ultrasonication. Еще раз повторите шаг стирки, но redisperse в 1 мл этанола 85%, 10% 3-MPTMS (3-mercaptopropyltrimethoxysilane), и 5% ди воды. Инкубации при комнатной температуре для 1-2 h ввести тиолы на поверхности частиц.
  2. Вымойте тиоловых функционализированных наночастиц, центрифугирование в g 11000 x 4 мин, аспирационных супернатант и resuspending гранулы, ultrasonication, дважды в этаноле, дважды в ди и наконец в HEPES (4-(2-гидроксиэтилкрахмала) -1- piperazineethanesulfonic кислота) буфер (10 мм, pH 7.1) и отложите.
    Примечание: MES (2-(N- Морфолино) ethanesulfonic кислота) следует использовать буфер или HEPES. Буферы с более высокой солености, например PBS (фосфат амортизированное saline), может вызвать наночастиц агрегации.
  3. Для αFR антитела функционализированных-сети реагируют 200 мкг антител (анти фолиевой кислоты привязки протеина антитела клон [LK26]) с десятикратно Молярная избыток PEG сшивателя (poly(ethylene glycol) (N-оксисукцинимидного 5-pentanoate) эфира N′-(3- maleimidopropionyl) аминоэтан (CAS: 851040-94-3), в диметилсульфоксида (ДМСО)) в 500 мкл буфера MES (10 мм, pH 7.1) за 30 мин.
  4. Удалите избыток сшивателя и сконцентрировать антитела центрифугированием антител PEG решение в центробежного фильтра (MWCO 100 кДа). Центробежные фильтры, используемые в данном исследовании выполняют центрифугирования для 10 мин в 14.000 x g и 23 ° C. Восстановите конъюгированных антител в свежий трубки, инвертирование фильтра и центрифугирование в 1000 x g на 2 мин.
  5. Пипетка наночастиц IR780 от 3.2 шаг в трубку с антителами и агитировать с пипеткой смешивать. Инкубировать смесь для по крайней мере 30 минут при комнатной температуре, или, в качестве альтернативы при температуре 4 ° C на ночь в форме αFR-NPs.
  6. Формируют nt NPs, добавить 1% w/v метокси готовая (м) PEG5000-maleimide (CAS: 99126-64-4) растворяют в ДМСО наночастиц IR140 SERRS от 3.2 шаг и пусть РЕАКТ в 500 мкл MES буфера (10 мм, pH 7.1) по крайней мере 30 минут при комнатной температуре, или же при температуре 4 ° C Ночевка.
  7. Для администрирования мышей (раздел 5), спин вниз оба nanoprobe вкусов в g 11000 x 4 мин, аспирационная супернатант для удаления решений с свободный непрореагировавшего антитела/КОЛЫШЕК и redisperse каждый аромат в буфере MES (10 мм, pH 7.1) на 600 м. концентрация . Когда resuspending наночастиц, свести к минимуму ненужного воздействия на УЗИ, чтобы избежать денатурации антитела.

4. мыши модель развития

  1. Созданию устойчивого культуры линии клеток человеческого аденокарциномы яичника (SKOV-3). Дополнительно чтобы включить мониторинг через биолюминесценции/флуоресценции, используйте transfected клеток /GFP Сков-3 Люк++ . Культура клеток в среде RPMI (Розвелл парк Мемориальный институт) с 10% плода телячьей сыворотки и проход два раза в неделю. Для инъекций инкубации клеток с trypsin/0.05% 0,25% ЭДТА на 3 мин для отсоединения и впоследствии мыть и Ресуспензируйте в PBS в 2 х 106 клеток/100 мкл.
  2. Создать модель яичника micrometastasis, придать 200 мкл взвешенных SKOV-3 клеток внутрибрюшинно Атинические самок мышей (FOXn1nu/FOXn1nu мышей, 6-8 недель). Распространены перитонеальный распространения будет происходить в течение примерно 4 недель. При использовании SKOV-3 Люк+ клеток, рост опухоли может контролироваться с биолюминесценции управляющей 2 мг Жук люциферин в 50 мкл PBS через retroorbital инъекции.

5. Nanoprobe инъекции и изображений

  1. Подготовьте nanoprobes (αFR-НПС и nt NPs), как описано в разделах 1-3 и смесь в соотношении 1:1, для окончательного концентрации 300 вечера каждого типа в буфере MES (10 мм, pH 7.1). При необходимости, подготовить эталонных стандартов 30 pM каждого из nanoprobe вкусов в небольшие конические трубы (100 мкл).
  2. Придать внутрибрюшинно 1 мл взвеси наночастиц в каждой мыши и нежно массировать живот распространить наночастиц в брюшной полости. Вернуть его корпус мыши. После 25 или более минут усыпить мыши через удушение CO2 .
  3. Закрепите мыши на хирургические платформе, в лежачем положении (для всего живота изображений, платформа должна быть монтируется на вертикальном положении микроскопа).
    1. С помощью зубчатого щипцы и Рассечение ножницами, снять кожу подвергать брюшины и выполнить большой Сагиттальный разрез (между 2 и 3 см в длину) подвергать весь живот. Прикрепите перитонеальный заслонки на платформу. Вымойте внутри брюшной полости с по крайней мере 60 мл PBS, используя пластиковый шприц бутылку.
      Примечание: Чтобы включить беспрепятственный изображений всей брюшной полости, кишечника необходимо мобилизовать или вырезана. Для обрезания иссечения с перевязкой брыжеечных сосудов для уменьшения кровотечения в брюшную полость.
    2. Кроме того изображение конкретных органов, акцизный их после стирки PBS и разместить их на слайд микроскопа.
  4. Передачи платформы или слайд Раман microspectrophotometer с вертикально оптических конфигурации и моторизованного столика для изображений; Используйте коммерческие системы с 300 МВт 785 Нм диодный лазер, с решеткой 1200 пазов на мм, сосредоточены на 1 115 см-1.
    1. Сосредоточиться на область интереса, с использованием белого света Оптика, парфокальному с лазерным Раман. Выберите область для записи образа и нужное разрешение; в настоящем докладе используется высокоскоростной режим (спектры, приобретенные в рамках непрерывной лазерной подсветки с микроскопа, постоянно движется, с эффективным разрешением 14.2 µm 200 мкм; в 5 крат, мощностью 100 МВт на цель, и < 100 мс воздействия на точку).
      Примечание: Трубы с nanoprobes ссылка от шаг 5.1 могут быть размещены в пределах области образа, при необходимости, предоставлять внутренние эталонных стандартов для последующего анализа. Убедитесь, что нет посторонних источников света, помимо лазера достичь цели.
  5. При необходимости подготовьте образец для гистологической обработки и проверки путем фиксации в параформальдегида 4% в PBS на ночь при 4 ° C. Промойте с PBS на 4 ° C на 15 минут по крайней мере дважды. Держите образец в 70% этанола в воде до стандартных гистологической обработки и встраивание парафина. Для гистологической проверки опухоли разделы (толщиной 5 мкм) с разных глубин парафин блока смогите быть запятнано с гематоксилином и эозином (H & E).

6. обработка данных и визуализация

Примечание: Все обработки данных была выполнена с графическим интерфейсом пользователя, разработанного с использованием коммерческого программного обеспечения. Все используемые функции имеют общие эквиваленты в других вычислительных средах.

  1. Получите ссылку спектры для двух ароматов, путем опрашивания чисто суспензий каждого. Спектры ссылки могут быть производными от точки сканирования nanoprobes, Визуализация nanoprobes хорошо плиты, или путем включения внутренних ссылок в экспериментальных проверок в ссылку трубы (см. шаг 5.1).
  2. Предварительная обработка спектров ссылку, с помощью вычитание (фильтр Whittaker, λ = 200), нормализации площадь под кривой и производные фильтр Савицкий-Голея (второй степени полинома ширине, первого порядка производной, = 15 шагов). Эти предварительно спектры будет служить в качестве ссылки для модели классической наименьших квадратов (CLS).
  3. Предварительной выборки данных из образа в так же, как ссылка спектров. Получите баллы CLS для каждой точки образца с помощью алгоритма доступны CLS. Прямые результаты CLS (DCLS) являются просто координаты проекции образца спектра на линейное пространство определяется обобщенных обратную матрицу (обратная Мур-Пенроуза) ссылка спектров. Другие установки, алгоритмы могут быть использованы (non отрицательного наименьших квадратов, частичное наименьших квадратов или другие).
    Примечание: Некоторые алгоритмы установки может привести к негативные оценки, которые в этом контексте не физической. Если это так, порог может быть присвоено исключить негативные оценки или ограничением отрицательным наименьших квадратов алгоритм работает вместо.
  4. Рассчитать поточечной соотношение баллов по ссылке для целевых наночастиц (нотыαFR) над баллы по ссылке для непромысловых наночастиц (ntбаллы). Если результаты не являются отрицательными, соотношение может быть выражен в логарифмической моды:
    R = журнал10(нотыαFR/ нотыnt).
    Лучше всего отношение R отображается в расходящиеся цветовой шкале центрирована на ноль, чтобы выразить относительное обилие зондов в порядков. Полученное изображение может накладывается на белый свет изображение образца, чтобы выявить области Избыточная экспрессия рецепторов фолиевой кислоты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для целей контроля качества наночастиц можно охарактеризовать с помощью различных методов в процессе синтеза, включая ТЕА, DLS, анализ отслеживания наночастиц и спектроскопии поглощения УФ-вид, как показано на рисунке 2.

Таким образом, размер ядра золото nanostar (описанных в разделе 1), формирование оболочке кремнезема (раздел 2) и последующего Функционализация поверхности (раздел 3) может быть проверено (рис. 2). Как правило, размер (гидродинамические диаметр) золото nanostar ядро, как ожидается, будет около 80 Нм и оболочке кремнезема составляет около 20 Нм, толстый, приготовления всего силикатные наночастиц размер около 120 Нм и около 140 Нм после сопряжения с αFR-антитела. УФ-вид поглощения может также использоваться для проверки морфология наночастиц. Nanostar ядер в воде, как правило, имеют максимум поглощения в 670 нм, тогда как после Силикатизация максимум смещается к около 710 Нм. Максимумы поглощения в нижнем диапазоне волн являются признаком сферических морфологии или агрегирования. Типичная реакция урожайности и концентрации приведены в таблице 1 и сильно зависит дозирования технику во время стирки шаги.

Каждой точки, полученные из Раман проверки содержит спектра для опрошенных местоположения. Эти спектры являются линейные суперпозиции nanoprobes SERRS сигнал и любой фон флуоресценции. Спектры могут быть обработаны для удаления флуоресценции и нормализуется на единицу площади для компенсации сигнала, до применения модели CLS (описано в разделе 6), как показано на рисунке 3. Представитель изображений для оценки по каждому из спектров ссылку nanoprobe и их поточечной соотношения показаны на рисунке 4. Хотя каждая оценка индивидуально не предоставляет конкретных локализации опухоли, соотношение показывает наличие распространены микроскопические распространения.

Шаг Первоначальный объем Начальной концентрации Окончательный объем Конечная концентрация
1. Nanostar ядро 8 мл HAuCl4 20 мм HAuCl4 5 мл 1.3 Нм
2. Силикатизация 1,2 мл 1.3 Нм 1,2 мл 0.5 Нм
3.1. Thiolation 1 мл 0.5 Нм 1 мл 0,43 Нм
3.5. спряжение 1 мл 0,43 Нм 1 мл 0,39 Нм

Таблица 1: доходность наночастиц после каждого шага реакции. Концентрации, являются приблизительными. Доходность определяется наночастиц, отслеживания анализа, с двумя независимыми синтезы и 5 независимых измерений от каждого.

Figure 1
Рисунок 1 : Схема синтеза и применения изображений nanoprobe SERRS ratiometric. (1) золото nanostars синтезированы как описано в разделе 1. (2) кремнезема оболочки формируется вокруг золотых nanostar ядер и Раман репортер молекул (красители инфракрасного ИК-780 перхлората и ИК-140) используются для создания двух различных наночастиц вкусов, как описано в разделе 2. (3) на поверхности наночастиц покрына с тиолами, как описано в разделе 3.1, позволяющие далее Функционализация поверхности. ИК-780 вкус наночастиц проспряганное с анти фолиевой кислоты рецептор антитела, а ИК-140, те пассивируется слоем PEG - 5 k, как описано в разделах 3.3-3.6. (4) мыши модель распространения диффузных внутрибрюшинного яичников метастатическим разрабатывается, как описано в разделе 4, и когда будете готовы, SERRS nanoprobes управляются внутрибрюшинно. (5 мышах умерщвлены, и живот, хирургически подвергается включить Раман изображений как описано в разделе 5. (6 спектры комбинационного точечно анализируются, чтобы определить относительное обилие двух зондов и генерировать карту ratiometric Избыточная экспрессия рецепторов фолиевой кислоты как описано в разделе 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Физическая характеристика SERRS nanoprobes. Наночастицы могут быть подвергнуты контролю качества после каждой частью синтеза. Просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) раскрывает форму золото ядро и успешного формирования оболочке кремнезема без наночастиц агрегирования; Шкалы бар = 100 Нм. Динамическое рассеяние света (DLS) можно измерить размер и Дзета-потенциал для проверки успешного силикатизация и функционализации наночастиц. УФ-вид поглощения может использоваться для подтверждения наличия плазмонных пик около 670 нм для nanostars, переход на 710 Нм после Силикатизация. Раман измерения показывают присутствие уникальной спектры каждого аромата во всем синтеза. Интенсивность nanostar спектра, с не характерным пиков, был усиливается 100 x для акцент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Обработка спектров комбинационного. Сырые спектры состоят из nanoprobes SERRS подписи, накладывается поверх группы широкого флуоресценции. С вычитание флуоресценции группа удаляется, и вершины Раман станет заметным. Чтобы обнаруживать спектральных подпись наночастиц независимо от интенсивности, каждый спектра (ссылки и образцы так) нормируется на единицу площади. Наконец фильтр сглаживания производное применяется увеличить Раман пиков, при одновременном снижении шума. Спектры обработанные ссылки используются для разработки модели CLS, для того, чтобы классифицировать спектры обработанный образец, основанный на соотношении р. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Ratiometric томография микрометастазы рака яичников в живот. Раман изображений подвергается живота мыши, показывая обширные метастазы яичников, как свидетельствуют биолюминесценции изображений. Каждой точке сканирования имеет спектр, который обрабатывается (раздел 6, рис. 3) и забил основаны на модели CLS, чтобы получить баллы на две ссылки: αFR-NP, показано в красном и nt-NP синим цветом. Результаты затем разделены точечно, раскрыть относительное обилие двух зондов как отношение. Дополнительно ограничивание отношение, «позитивные» районах может быть накладывается на изображение оптически живота, чтобы позволить резекции или другой сосредоточены лечения. Рисунок 4 -это адаптированная версия от ссылка1, с разрешения из журнала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол, описанные здесь предоставляет инструкции для синтеза двух «вкусами» SERRS nanoprobes и их занятость в мышей Раман изображений опухолей яичников, экспрессирующих рецепторов фолиевой кислоты, с помощью алгоритма ratiometric. Основным преимуществом комбинационного изображений над другими оптические методы визуализации (например флуоресценции) является высокая специфичность nanoprobe сигнал, который не может быть confounded с любых сигналов биологического происхождения. В этом воплощении комбинационного изображений наночастиц не вводят внутривенно, но локально, через внутрибрюшинной инъекции последовал шаг одной стирки. Эта методология, раз переведены на клинических Арена, будет представлять элегантное решение для включения хирургов для визуализации и поэтому полное все имплантаты рака яичников, даже те, которые слишком малы, чтобы обнаружить невооруженным глазом, и которые не могут быть направлены с агентом системно вводят изображений из-за их отсутствия кормления судов к кровообращения. В то же время как наши SERRS наночастицы не резорбируется в системный кровоток, минимизируются потенциальные проблемы для побочных эффектов. Наше исследование является одним из примеров растущего доказательства того, что тщательно разработанные наноконструкции может обеспечить уникальные преимущества перед обычными изображений и терапии технологий22,23,24,25, 26,27,28,,2930,,3132,33,34, 35,36,,3738.

SERRS nanoprobes, описанный здесь биологически инертным и использовались для разграничения опухоли в мыши модели нескольких типов рака. Реакция для формирования оболочке кремнезема (одновременно с репортер краситель инкапсуляция) является улучшенной версией нашей сообщалось ранее синтез1,7,8, который является менее склонны к агрегации наночастиц и формирование наночастиц «свободный кремнезема» (без золота сердечника). Реакция может использоваться с различными коммерчески доступных инфракрасный органических красителей, помимо тех, которые здесь представлены, приносить большую коллекцию ароматов Раман. Результате интенсивности сигнала, однако, зависит от краска близость золота и другие факторы. Кроме того количество красителя, добавлены к реакции должны определяться на основе-краска, как отдельных молекул и их counterions привести к агрегации Золотой nanostars, больше, чем другие. В случае тяжелой наночастиц агрегации необходимо уменьшить количество красителя используется. Агрегирование золото ядер нежелательно, как это может вызвать серьезные изменчивости в Раман интенсивности сигнала и осложнить полученные данные. Формирование свободного кремнезема в основном безобидный, как она обеспечивает сигнал не Раман. Однако во время функционализации антитела будут придерживаться кремния наночастиц, уменьшение общей ориентации эффективности метода. Толщина корпуса кремнезема, зависит от времени реакции, температура и количество воды, добавить (шаг 2.1). Если результирующий оболочке кремнезема считается слишком тонкий (рис. 1, сверху справа), один или более из этих параметров может быть увеличен соответствующим образом.

Что касается сбора данных его качество во многом зависит от яркости nanoprobes. Это становится особенно очевидной при выполнении быстрого приобретения Раман, как описано в разделе 5. Чтобы убедиться, что данные достаточно заметные от шума, спектры должны быть проверены, и проверить присутствие представителя Раман пиков зондов. Если сигнал слишком слабый, можно увеличить время экспозиции на точку. Однако этот подход может привести к чрезмерно длинные сканирование или очень низким пространственным разрешением. Для обеспечения согласованности и повторяемость, калибровка сканера Раман должны выполняться согласно рекомендации изготовителя и обычно делается с помощью общего стандарта (например, кремниевых пластин).

Одним из основных преимуществ этого метода является его универсальность. Типов различных опухолей могут отражаться с использованием специфических антител против различных молекулярных маркеров. Кроме того, можно применять nanoprobes, описанные здесь Животные модели — внутрибрюшинно или внутривенно — но также, с использованием тех же методов, они могут использоваться пятно тканей, фиксированной либо свежезаваренным подакцизным.

Хотя метод ratiometric обеспечивает специфичность обнаружения микроскопические опухоли, распределение отдельных зонды не конкретные районы опухоли. Это означает, что theranostic методы, такие как яркостной/фотодинамической терапии или наркотиков загрузки не будет идеальным, как терапия будет доставлен здорового областях, а также. Один из потенциальных терапевтического применения, обеспечиваемой этой техники бы автоматизированных абляция microtumors после обнаружения ratiometric.

Мы надеемся, что это местные, ratiometric подход комбинационного изображений может проложить путь для использования SERRS nanoprobes, после необходимых клинических испытаний, как молекулярной визуализации агента в больных. Этот метод был разработан для обеспечения совместимости с потенциальных будущих приложений в организме человека, как наночастицы могут быть вводят и удалены из брюшной полости с помощью устройств, которые уже находятся в клиническое применение для многосторонних.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

• МФК отображается как изобретатель на нескольких выдан или патентных заявок, относящиеся к этой работе. МФК является соучредителем Рио изображений, Inc., которая направлена на перевод SERRS наночастиц в клиниках.

• Авторы заявляют, что они имеют без других конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Следующие источники финансирования (для МФК) признаются: низ R01 EB017748, R01 CA222836 и K08 CA16396; Дэймон Раньон Rachleff инновации премии УОБ-29-14, Першинг Сквер Sohn приз Першинг Сквер Sohn рак исследований Альянса, и центр MSKCC Молекулярное воображение и нанотехнологий (CMINT) и гранты для развития техники. Благодарности распространяются также на грантовое финансирование поддержки, оказываемой MSKCC гранта NIH Core (P30-CA008748).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Reagent
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960
3-MPTMS Sigma-Aldrich 175617
Ammonium hydroxide (28%) Sigma-Aldrich 338818
Anti-Folate Receptor antibody [LK26]  AbCam ab3361
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 276855
Dimethyl sulfoxide (anhydrous) Sigma-Aldrich 276855
Ethanol Sigma-Aldrich 792780
IR140 Sigma-Aldrich 260932
IR780 perchlorate* Sigma-Aldrich 576409 Discontinued*
Isopropanol Sigma-Aldrich 650447
N.N.Dimethylformamide Sigma-Aldrich 227056
PEG crosslinker Sigma-Aldrich 757853
PEG-maleimide Sigma-Aldrich 900339
Tetrachloroauric Acid Sigma-Aldrich 244597
Tetraethyl Orthosilicate Sigma-Aldrich 86578
*IR792 Sigma-Aldrich 425982 *Alternative
Name of Equipment
Dialysis cassette (3,500 MWCO) ThermoFIsher 87724
Centrifugal filters Millipore UFC510096
inVia confocal Raman microscope Renishaw
MATLAB (v2014b) Mathworks
PLS Toolbox (v8.0) Eigenvector research

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oseledchyk, A., Andreou, C., Wall, M. A., Kircher, M. F. Folate-Targeted Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detection of Microscopic Ovarian Cancer. ACS Nano. 11 (2), 1488-1497 (2017).
  2. Andreou, C., et al. Imaging of Liver Tumors Using Surface-Enhanced Raman Scattering Nanoparticles. ACS Nano. 10 (5), 5015-5026 (2016).
  3. Karabeber, H., et al. Guiding brain tumor resection using surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and a hand-held Raman scanner. ACS Nano. 8 (10), 9755-9766 (2014).
  4. Kircher, M. F., et al. A brain tumor molecular imaging strategy using a new triple-modality MRI-photoacoustic-Raman nanoparticle. Nature Medicine. 18 (5), 829-834 (2012).
  5. Andreou, C., Kishore, S. A., Kircher, M. F. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy: A New Modality for Cancer Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1295-1299 (2015).
  6. Harmsen, S., et al. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nature Communications. 6, 6570 (2015).
  7. Harmsen, S., et al. Surface-enhanced resonance Raman scattering nanostars for high-precision cancer imaging. Science Translational Medicine. 7 (271), 271ra277 (2015).
  8. Harmsen, S., Wall, M. A., Huang, R., Kircher, M. F. Cancer imaging using surface-enhanced resonance Raman scattering nanoparticles. Nature Protocols. 12 (7), 1400-1414 (2017).
  9. Huang, R., et al. High Precision Imaging of Microscopic Spread of Glioblastoma with a Targeted Ultrasensitive SERRS Molecular Imaging Probe. Theranostics. 6 (8), 1075-1084 (2016).
  10. Iacono, P., Karabeber, H., Kircher, M. F. A "schizophotonic" all-in-one nanoparticle coating for multiplexed SE(R)RS biomedical imaging. Angewandte Chemie, International Edition in English. 53 (44), 11756-11761 (2014).
  11. Spaliviero, M., et al. Detection of Lymph Node Metastases with SERRS Nanoparticles. Molecular Imaging and Biology. 18 (5), 677-685 (2016).
  12. Nayak, T. R., et al. Tissue factor-specific ultra-bright SERRS nanostars for Raman detection of pulmonary micrometastases. Nanoscale. 9 (3), 1110-1119 (2017).
  13. Thakor, A. S., et al. The fate and toxicity of Raman-active silica-gold nanoparticles in mice. Science Translational Medicine. 3 (79), 79ra33 (2011).
  14. Liu, J., et al. Effects of Cd-based Quantum Dot Exposure on the Reproduction and Offspring of Kunming Mice over Multiple Generations. Nanotheranostics. 1 (1), 23-37 (2017).
  15. Wu, N., et al. The biocompatibility studies of polymer dots on pregnant mice and fetuses. Nanotheranostics. 1 (3), 261-271 (2017).
  16. Garai, E., et al. High-sensitivity real-time, ratiometric imaging of surface-enhanced Raman scattering nanoparticles with a clinically translatable Raman endoscope device. Journal of Biomedical Optics. 18 (9), 096008 (2013).
  17. Wang, Y. W., et al. Rapid ratiometric biomarker detection with topically applied SERS nanoparticles. Technology (Singap World Sci). 2 (2), 118-132 (2014).
  18. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
  19. Vergote, I. B., Marth, C., Coleman, R. L. Role of the folate receptor in ovarian cancer treatment: evidence, mechanism, and clinical implications. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 41-52 (2015).
  20. Fasolato, C., et al. Folate-based single cell screening using surface enhanced Raman microimaging. Nanoscale. 8 (39), 17304-17313 (2016).
  21. Wang, Y. W., et al. Raman-Encoded Molecular Imaging with Topically Applied SERS Nanoparticles for Intraoperative Guidance of Lumpectomy. Cancer Research. 77 (16), 4506-4516 (2017).
  22. Andreou, C., Pal, S., Rotter, L., Yang, J., Kircher, M. F. Molecular Imaging in Nanotechnology and Theranostics. Molecular Imaging and Biology. 19 (3), 363-372 (2017).
  23. Chitgupi, U., Qin, Y., Lovell, J. F. Targeted Nanomaterials for Phototherapy. Nanotheranostics. 1 (1), 38-58 (2017).
  24. Choi, D., et al. Iodinated Echogenic Glycol Chitosan Nanoparticles for X-ray CT/US Dual Imaging of Tumor. Nanotheranostics. 2 (2), 117-127 (2018).
  25. Dubey, R. D., et al. Novel Hyaluronic Acid Conjugates for Dual Nuclear Imaging and Therapy in CD44-Expressing Tumors in Mice In Vivo. Nanotheranostics. 1 (1), 59-79 (2017).
  26. Gupta, M. K., et al. Recent strategies to design vascular theranostic nanoparticles. Nanotheranostics. 1 (2), 166-177 (2017).
  27. Huang, Y. J., Hsu, S. H. TRAIL-functionalized gold nanoparticles selectively trigger apoptosis in polarized macrophages. Nanotheranostics. 1 (3), 326-337 (2017).
  28. Pal, S., Harmsen, S., Oseledchyk, A., Hsu, H. T., Kircher, M. F. MUC1 Aptamer Targeted SERS Nanoprobes. Advanced Functional Materials. 27 (32), (2017).
  29. Zanganeh, S., et al. Iron oxide nanoparticles inhibit tumour growth by inducing pro-inflammatory macrophage polarization in tumour tissues. Nat Nanotechnol. 11 (11), 986-994 (2016).
  30. Lee, J., Lee, Y. M., Kim, J., Kim, W. J. Doxorubicin/Ce6-Loaded Nanoparticle Coated with Polymer via Singlet Oxygen-Sensitive Linker for Photodynamically Assisted Chemotherapy. Nanotheranostics. 1 (2), 196-207 (2017).
  31. Li, R., Zheng, K., Yuan, C., Chen, Z., Huang, M. Be Active or Not: the Relative Contribution of Active and Passive Tumor Targeting of Nanomaterials. Nanotheranostics. 1 (4), 346-357 (2017).
  32. Lin, S. Y., Huang, R. Y., Liao, W. C., Chuang, C. C., Chang, C. W. Multifunctional PEGylated Albumin/IR780/Iron Oxide Nanocomplexes for Cancer Photothermal Therapy and MR Imaging. Nanotheranostics. 2 (2), 106-116 (2018).
  33. Roberts, S., et al. Sonophore-enhanced nanoemulsions for optoacoustic imaging of cancer. Chemical Science (Royal Society of Chemistry: 2010). 9 (25), 5646-5657 (2018).
  34. Liu, L., Ruan, Z., Yuan, P., Li, T., Yan, L. Oxygen Self-Sufficient Amphiphilic Polypeptide Nanoparticles Encapsulating BODIPY for Potential Near Infrared Imaging-guided Photodynamic Therapy at Low Energy. Nanotheranostics. 2 (1), 59-69 (2018).
  35. Liu, R., Tang, J., Xu, Y., Zhou, Y., Dai, Z. Nano-sized Indocyanine Green J-aggregate as a One-component Theranostic Agent. Nanotheranostics. 1 (4), 430-439 (2017).
  36. Sneider, A., VanDyke, D., Paliwal, S., Rai, P. Remotely Triggered Nano-Theranostics For Cancer Applications. Nanotheranostics. 1 (1), 1-22 (2017).
  37. Wall, M. A., et al. Surfactant-Free Shape Control of Gold Nanoparticles Enabled by Unified Theoretical Framework of Nanocrystal Synthesis. Advanced Materials. 29 (21), (2017).
  38. Sonali,, et al. Nanotheranostics: Emerging Strategies for Early Diagnosis and Therapy of Brain Cancer. Nanotheranostics. 2 (1), 70-86 (2018).

Tags

Исследования рака выпуск 145 Раман SERS наночастиц Молекулярное воображение рак яичников фолиевая кислота рецепторов ratiometry
Поверхность расширение резонанс комбинационного рассеяния Nanoprobe Ratiometry для обнаружения микроскопического рака яичников через рецептор фолиевой кислоты ориентации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Andreou, C., Oseledchyk, A.,… More

Andreou, C., Oseledchyk, A., Nicolson, F., Berisha, N., Pal, S., Kircher, M. F. Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting. J. Vis. Exp. (145), e58389, doi:10.3791/58389 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter