Summary
卵巣癌は腹腔内全体で転移を形成します。ここで確認するためのプロトコルを提案する、使用葉酸受容体ターゲット表面増強共鳴ラマン散乱ナノプローブ レシオ イメージングによる高い特異性を持つこれらの病変を明らかにします。ナノプローブ、生きたマウスに腹腔内投与および組織学と派生画像の相関します。
Abstract
卵巣癌は、最悪の婦人科悪性腫瘍を表します。ほとんどの患者は (フィーゴ ステージ III または IV)、高度な段階で現在ローカル転移の広がりが既に発生した場合。ただし、卵巣癌は、転移の広がりのユニークなパターン腫瘍インプラント最初腹腔内に含まれています。この機能は、原則として、腫瘍インプラント治癒切除を有効に可能性があります。これらの病変の多くは顕微鏡で特定し、治療するは難しいことです。このような微小の中和再発を排除し、長期生存を達成に向けての主要な目標であると考えられます。ラマン表面増強共鳴ラマン散乱ナノプローブをイメージングを使用して、微視的腫瘍を明るいため、感度が高いと bioorthogonal スペクトル シグネチャを記述できます。ここでは、このようなナノプローブの 2 つの '味' の合成について述べる: 葉酸受容体をターゲットとする抗体修飾 1 — 多くの卵巣癌で過剰発現- と異なるスペクトルの非ターゲット コントロール ナノプローブ。ナノプローブは転移ひと卵巣癌のマウスモデルを腹腔内投与です。すべての動物の研究は、制度的動物ケアおよび使用委員会のメモリアルスローンケタ リングがんセンターによって承認されました。動物の腹腔内は外科的露出、洗浄し、ラマン microphotospectrometer でスキャンします。その後、2 つのナノプローブのラマン署名が分離された古典的な最小二乗フィッティング アルゴリズムを使用して、不特定多数に向けたプローブ上葉酸ターゲットのレシオ メトリック信号を提供するために彼らのそれぞれの得点が分かれています。このように、微小転移に高い特異性を持つ視覚化されます。このアプローチの主な利点は、腹腔内にローカル アプリケーション — 外科プロシージャの間に便利に行うことができます-全身ナノ粒子の曝露に患者を施すことがなく腫瘍をタグすることができます。偽陽性は、レシオ メトリック方式次の混合物として異なるラマン シグネチャを持つ非ターゲットに目標とされナノプローブを適用する場所により内臓の表面にナノプローブの非特異的結合に起因を除去できる信号します。プロシージャは現在はまだイメージング カメラ システムを一度使用可能な手術室でこの技術のアプリケーションを可能にする商業広視野ラマンの不足によって制限されます。
Introduction
ラマン イメージング '表面強化ラマン散乱' (SERS) ナノ粒子の設定の様々 な病変を区切るために偉大な約束を示しているし、多くの異なる腫瘍のタイプ1,2,3,4.ナノ粒子表面増強ラマン散乱の主な利点は、それらの生物学的背景信号5によって混乱はない疑う余地のない検出を affording の指紋のような分光署名です。さらに、出力信号の強度はさらに '表面増強共鳴ラマン散乱' に上昇を与える励起レーザーに沿って吸光度マキシマとレポーター分子 (染料) を使って増幅 (serr が示すバス)さらに大きな感度6,7,8,9,10、11,12ナノ粒子。
静脈内注射により全身は管理の彼らのモードの SE(R)RS ナノ粒子13の採用のために対処する必要がある 1 つの障壁と多く他ナノ粒子構造14,15臨床使用のためエージェントの露出、悪影響の可能性を除外する広範なテストを必要とします。この記事でのナノ粒子の応用に基づく別のパラダイムを提案するローカル生体内で手術中腹腔内に直接の後に、バインドされていないナノ粒子1を削除する洗浄工程。このアプローチは新しい治療法捜査されてもするに伴い、温熱腹腔内化学療法 (HIPEC) と呼ばれる、腹腔内にエージェントのローカル注入の使用します。したがって、原理自体は、臨床医療のワークフローに統合する比較的簡単なはずです。我々 は腹腔内のアプリケーション後のナノ粒子の生体内分布を研究しているし、全身循環1に任意の検出可能な吸収みいません。また、ローカル アプリケーションのアプローチは、必要なナノ粒子の数が著しく減少しているので、細網内皮系でナノ粒子の隔離を回避できます。ただし、局所的に適用するとき抗体修飾ナノ粒子をそのターゲットの不在でも内臓の表面に付着する傾向があります。非特異的ナノ粒子付着による偽の肯定的な信号を最小限にするため追求レシオ メトリック方式分子標的ナノプローブが特定の信号と異なるラマン スペクトルの非ターゲット コントロール ナノプローブを提供します非固有バック グラウンド16,17を占めています。我々 は、局所的に適用される表面増強共鳴ラマン レシオ メトリックびまん性卵巣がん1マウス モデルにおける最近のこの方法を実証しました。
2 つの serr が示すバス ナノプローブを対象とした 1 つを開発するこのメソッドの全体的な目標があり、マウス モデルにおける癌の有病率/過剰発現をイメージするためにローカルで適用される 1 つの非-特定、2 つのプローブのレシオ メトリック検出によるバイオ マーカーの関連経由でラマン イメージングします。この作品は、多く卵巣癌18,19でマーカーの亢進、葉酸受容体 (FR) はターゲットとして選ばれました。ナノ粒子の表面増強ラマン散乱を用いたラマン マイクロ イメージングは、癌細胞識別20で実証されています。ラマンのナノ粒子の 2 つの異なる「フレーバー」が合成される、それぞれ異なる有機色素由来の指紋。ナノ粒子のシリカ シェルに囲まれた星の形の金コアから成り、約 710 で表面プラズモン共鳴を示す nm。ラマン記者 (有機色素) は、シリカの殻の形成と並行して堆積されています。最後に、FR 向けナノプローブ (αFR-NPs) のポリエチレング リコール (PEG) の単分子膜をターゲットとしたナノプローブ (nt NPs) がパッシベーションされるに対し、シリカ シェルは抗体の共役は。
この技術は、びまん性転移性卵巣がん (skov 氏-3)、生体内で使用するための適用可能性を示すマウス異種移植モデルにおける微視的腫瘍をマップする正常に使用されました。それは腫瘍の表現やマージン測定同種研究21に示すように、減量後に摘出組織で使用するため拡張もできます。
Serr が示すバス ナノプローブは、模式図 1で説明したように単純な化学反応と合成、バイオ マーカーの複数対象タグの作成のための堅牢なプラットフォームを提供します。ここでは、serr が示すバス ナノプローブ (セクション 1-3) の 2 つのタイプの合成のためのプロトコル、適切な卵巣癌マウス モデル (セクション 4) の開発、ナノプローブとイメージング (セクション 5) の管理、最後にデータの分析を提案し、可視化 (セクション 6)。
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Protocol
すべての動物の研究は、制度的動物ケアおよび使用委員会のメモリアルスローンケタ リングがんセンター (# 11/06/07) によって承認されました。
1. ゴールド ナノスター コア合成
注:金 nanostars は、この実験で使用される serr が示すバス ナノプローブの両方の味のコアとして使用されます。
- 800 mL の 60 mM アスコルビン酸 (C6H8O6) 溶液 (DI) の脱イオン水で 20 mM tetrachloroauric 酸 (HAuCl4) 水溶液の DI 水 8 mL を準備します。4 ° C に冷却します。
- この反応の手順 4 ° C で800 mL の電磁攪拌プレートにアスコルビン酸溶液を含む三角フラスコを置き、安定した渦を誘発します。すぐに渦に tetrachloroauric 酸溶液 8 mL を追加します。秒以内に nanostars を形成する、ソリューションは濃い青と仮定します。場合に、いつでも色には、ピンクや紫、ナノスフェア、懸濁液の形成を破棄する必要がありますを示す再試行ように合成になります。
- ナノスター懸濁液を注ぎ、50 mL の円錐管、(4 ° C、3,220 × g) 20 分間遠心します。各チューブのソリューションのおおよそ 200 μ L を残して上清を吸引します。チューブの下部にナノ粒子のペレットを邪魔しないように注意を払います。
注:上澄みは、残りの中断された nanostars のため青みがあるはずです。 - マイクロ ピペットを使用して、中断および各チューブからナノ粒子を収集するソリューションを揺り動かしなさい。ペレットの部分はチューブの底に圧縮可能性があり、ない再懸濁します積極的なピペッティング破棄してもこの部分。
- ナノ粒子懸濁液を透析カセット (MWCO 3.5 kDa) に転送、毎日水を変更する・ ディ ・水 2 L に対して少なくとも 3 日間を dialyze します。水の変化で月最大 4 ° C で透析ごとに 3-4 日間で nanostars を格納します。
注:Nanostars には、セクション 2 の説明に従って、透析 silication 反応を必要になるまでとしなければなりません。
2. シリカ シェルの形成
注:ラマン ナノプローブの 2 つのフレーバーが合成されます。合成手順は、唯一の違いは使用されるラマン レポーター分子 (染料) で両者とも同じです。この実験では、IR780 過塩素酸と IR140 が使用されます。反応は、プラスチック容器で常に実行してください。合成は、拡張性の高い目的必要な注入液量の調節が可能します。ここでは、同じ濃度と反応時間、必要に応じて低い、または高いボリュームに比例して増減することができます媒体バッチ合成は説明です。Serr が示すバス ナノプローブの 2 種類の反応は、並列に実行できます。クロス汚染を避けるために注意を払います。ナノ粒子ペレット洗浄手順は中、またはナノ粒子 1 時間よりも長く保持した後、遠心分離後の吹出しの超音波処理を行わなければなりません。ナノ粒子は、明らかに 1 の通常のソリューションに中断されるまで超音波処理を実行する必要があります s。
- 管内 A (50 mL コニカル管)、色素 (IR780 過塩素酸塩または IR140、DMF (ジメチルホルムアミド) 20 mM) 60 μ L、500 μ L TEOS、DI 水の 200 μ L のイソプロパノール 10 mL を混ぜます。
- チューブ B (15 mL コニカル チューブ)、エタノールの 3 mL、水酸化アンモニウムの 200 μ L をミックスします。ソリューションの任意のクラスターを分散しチューブに nanostars の 1.2 mL を追加手順 1.4 から nanostars を超音波照射します。
注:水酸化アンモニウムは非常に揮発性でピペットの正確にするは難しい。ピペッティングを容易にするため、必要になるまで 4 ° C で保管してください。 - 渦のミキサーにチューブ A を置き、安定した渦を誘発します。急速に渦にチューブ B の内容を追加し、約 5 のための混合を維持米 300 rpm、室温で振りながら 15 分間シェーカーと反応にすぐに転送します。
- 15 分間インキュベーション後エタノール 50 mL のチューブを入力するを追加することによって反応を消します。3,220 × gと 4 ° C で 20 分間遠心
- ペレットの邪魔にならないように注意しながら、ソリューションの約 0.5 mL を残して上清を吸引します。エタノール 1 mL を追加し、ナノ粒子を再懸濁しますピペットを揺り動かします。1.5 mL 遠心管に移し、4 分 11,000 × gで遠心分離し、上清を吸引、約 1 の超音波処理によるペレットを再してエタノールで 4 回を洗って s。
注:この段階で珪ナノ粒子する機能、セクション 3 で説明したようか、4 ° c で最大 1 週間貯蔵のための余分な洗浄ステップの DI 水で再停止されます。
3. 表面機能化
注:IR780 serr が示すバス ナノプローブはフォーム αFR-NPs; にペグ架橋剤を介して葉酸受容体標的抗体の共役はIR140 serr が示すバス制御ナノプローブは、パッシベーションにペグの単膜 nt NPs の共役が。両方の味が独立したが、並列の反応におけるチオール マレイミド反応を介して形成されます。
- 4 分 11,000 × gで遠心、上清を吸引、超音波処理によるエタノール 1 mL にペレットを再によって 2 回ナノ粒子を洗います。洗濯の手順をもう一度繰り返すが、redisperse 5%、10 %3 MPTMS (メルカプトシラン) 85% エタノール 1 mL の純水。粒子表面にチオール基を導入する 1-2 時間室温で孵化させなさい。
- 4 分 11,000 × gで遠心分離し、上清を吸引、エタノール、DI、2 回で 2 回の超音波でペレットを再チオール修飾ナノ粒子を洗って、最後に HEPES に (4-(2-ヒドロキシエチル)-1-piperazineethanesulfonic 酸) バッファー (10 mM、pH 7.1)、脇を設定します。
注:MES (2-(Nmorpholino) ethanesulfonic 酸) バッファーまたは HEPES を使用する必要があります。PBS (リン酸緩衝生理食塩水) など、塩分濃度が高いとバッファーは、ナノ粒子凝集を引き起こす可能性があります。 - ペグ架橋剤 (poly(ethylene glycol) (n-5-pentanoate) エーテル n ′-(3-10 倍モル過剰な修飾抗体 αFR NPs の反応抗体 (抗葉酸結合タンパク質抗体クローン [LK26]) の 200 μ gmaleimidopropionyl) — ジアルキルアミノエタン (CA: 851040-94-3)、ジメチルスルホキシド (DMSO) で) 30 分の MES バッファー (10 mM、pH 7.1) の 500 μ L に。
- 過剰な架橋剤を削除し、遠心フィルター (MWCO 100 kDa) 抗体 PEG 溶液を遠心分離によって抗体を集中します。本研究で使用される遠心フィルター、23 ° c. の 14,000 x gで 10 分間遠心分離を実行します。フィルターを反転し、2 分間 1,000 × gで遠心分離によって新鮮な管内に活用された抗体を回復します。
- ピペットの抗体とチューブにステップ 3.2 から IR780 ナノ粒子と混合するピペットを扇動します。少なくとも 30 分のための混合物を孵化させなさい室温、または、代わりに 4 ° C でフォーム αFR NPs に一晩します。
- 1 w/v メトキシ終了 (m) PEG5000 マレイミドを追加 nt NPs を形成する (CAS: 99126-64-4) ステップ 3.2、室温で少なくとも 30 分 500 μ L MES バッファー (10 mM、pH 7.1) で let 反応から IR140 serr が示すバス ナノ粒子に DMSO に溶解、あるいは 4 ° C で一晩。
- マウス (セクション 5) 4 分 11,000 x gで両方のナノプローブ味スピンダウンする管理用ソリューションを無料の未反応抗体/PEG を削除する上清を吸引し、MES バッファー (10 mM、pH 7.1) 600 pM 濃度のそれぞれの味を redisperse.ナノ粒子を再するとき抗体の変性を防ぐために、超音波に不必要な被ばくを最小限に抑えます。
4. マウス モデルの開発
- ひと卵巣癌 (skov 氏-3) 細胞の安定した文化を確立します。必要に応じて、生物発光/蛍光による監視を有効にする、transfected skov 氏 3 リュック+/GFP+セルを使用します。培養細胞 RPMI (ロズウェル パーク記念研究所) 中 10% 牛胎児血清と週 2 回の通路。インジェクション、0.25% trypsin/0.05% 3 分のため、デタッチをその後洗浄し、2 x 106セル/100 μ L の PBS に再懸濁します EDTA とセルを孵化させなさい。
- 卵巣微小転移モデルの確立、無胸腺雌マウス (FOXn1nu/FOXn1nu マウス、6-8 週齢) に浮遊 skov 氏 3 細胞の 200 μ L を腹腔内注入します。腹膜播種の普及は、約 4 週間で発生します。Skov 氏 3 リュック+セルを使用して、腫瘍の増殖が生物発光と retroorbital 注入を介して 50 μ L の PBS でカブトムシ ルシフェリンの 2 mg を投与することによって監視できます。
5. ナノプローブ注入とイメージング
- セクション 1-3 および 300 の最終的な集中のための 1:1 の比率でミックスの説明に従ってナノプローブ (αFR NPs と nt NPs) を準備 (10 mM、pH 7.1) MES バッファー内の各種類の午後。必要に応じて、30 の基準を準備 (100 μ L) 円錐形の小さなチューブでナノプローブ味のそれぞれの午後。
- 各マウスにおけるナノ粒子懸濁液の 1 mL 腹腔内を挿入して腹腔内にナノ粒子を分散する腹を優しくマッサージします。マウスをその住宅に戻ります。25 以上の分後、CO2窒息を介してマウスを安楽死させます。
-
(イメージング、正立顕微鏡ステージ上にマウントするプラットフォームのニーズ全体腹部) の仰臥位での手術のプラットフォームにマウスを固定します。
- 鋸歯鉗子と解剖はさみを使って、腹部全体を公開する (長さ 2 ~ 3 cm) の大型の矢状切開を行い腹膜を公開する皮膚を削除します。プラットフォームに腹膜のフラップを取り付けます。少なくとも 60 ml のプラスチック製のホヤの瓶を使用して PBS の腹膜腔の内側を洗います。
注:腹部全体の遮るもののないイメージングを有効にするには、腸が動員されたり、摘出する必要があります。切除、腹腔内に出血を減らすために腸間膜の血管の結紮術で切除します。 - また、特定の臓器を画像、PBS 洗浄後それらを切除し顕微鏡スライド上に配置します。
- 鋸歯鉗子と解剖はさみを使って、腹部全体を公開する (長さ 2 ~ 3 cm) の大型の矢状切開を行い腹膜を公開する皮膚を削除します。プラットフォームに腹膜のフラップを取り付けます。少なくとも 60 ml のプラスチック製のホヤの瓶を使用して PBS の腹膜腔の内側を洗います。
-
プラットフォームまたはスライドを直立の光学構成とイメージ投射; ためのモーターを備えられた段階ラマン顕に転送します。300 mW 785 nm ダイオード レーザー、ミリメートル、1,115 cm-1を中心としたあたりの 1,200 の溝の格子と商用システムを使用します。
- 白い光の光学・ ラマン レーザーと同焦点を使用して関心のある分野に焦点を当てます。イメージを作成する領域と目的の解像度を選択します。本報告では、高速アクイジション ・ モードが使用された (連続レーザー照射下で常に動いて、効果的な空間分解能 14.2 μ m で 200 μ m; 5 倍の倍率で目的で 100 mW の発電顕微鏡ステージで取得したスペクトルと <100 ms 当たりの露出ポイント)。
注:ステップ 5.1 から参照ナノプローブを持つチューブは、その後の分析のための内部基準を提供するために必要な場合のイメージ領域内配置できます。目的を達成する、レーザー以外の余分な光がないことを確認します。
- 白い光の光学・ ラマン レーザーと同焦点を使用して関心のある分野に焦点を当てます。イメージを作成する領域と目的の解像度を選択します。本報告では、高速アクイジション ・ モードが使用された (連続レーザー照射下で常に動いて、効果的な空間分解能 14.2 μ m で 200 μ m; 5 倍の倍率で目的で 100 mW の発電顕微鏡ステージで取得したスペクトルと <100 ms 当たりの露出ポイント)。
- 必要に応じて、4 ° C で一晩 PBS で 4% パラホルムアルデヒドの固定によって組織学的処理と検証のサンプルを準備します。少なくとも二度 4 ° C 15 分で PBS で洗い。標準組織学的処理とパラフィン包埋まで 70% エタノール水のサンプルを保ちます。腫瘍の組織学的検証は、ヘマトキシリンとエオシン (H & E) パラフィン ブロックのさまざまな深さからのセクション (厚み 5 μ m) を汚すことができます。
6. データ処理と可視化
注:グラフィカル ユーザー インターフェイスが自社開発した商用ソフトウェアを使用して、すべてのデータ処理を行った。すべての機能の使用が一般的な同等の他の環境で利用可能なあります。
- それぞれの純粋な懸濁液を尋問することによって 2 つのフレーバーの参照スペクトルを取得します。参照スペクトル、ナノプローブのポイント スキャンに由来することができます (手順 5.1 参照) 標準管の実験的スキャンで内部参照を含む、ウェル プレート、ナノプローブのイメージングします。
- 基線の減算を使用して参照スペクトルを前処理 (Whittaker フィルター、λ = 200)、曲線、サビツキー ・ ゴーレイ誘導体フィルターの下の領域に正規化 (第二度房多項式フィット、一階微分、幅 = 15 のステップ)。これらの前処理されたスペクトルは、古典的な最小二乗 (CLS) モデルのための参照として機能します。
- 参照スペクトルと同じように、画像からサンプル データを前処理します。使用可能な CLS アルゴリズムを使用して、各サンプル ポイントの CLS のスコアを取得します。直接 CLS (DCL) スコアは、単に参照スペクトルの一般逆行列 (ムーア ・ ペンローズ逆行列) によって定義される線形空間上にサンプル スペクトルの射影座標です。アルゴリズムをすることができます他の継ぎ手は、(非負の二乗、部分的最小二乗法、またはその他) を使用します。
注:いくつかの近似アルゴリズムは、このコンテキストでは物理的ではなく否定的なスコアに上昇を与えることができます。場合、しきい値を設定すると、負のスコアを除外でしたまたは非負二乗アルゴリズムである場合は代わりに採用されています。 - 得点対象となるナノ粒子への参照の pointwise の比率を計算する (αFRスコア) をターゲットとしたナノ粒子 (スコアnt) の参照にスコア以上。スコアは非負である場合は、対数の形式で比率を表現できます。
R = ログ10(αFRのスコア/ntのスコア)。
比 R が最高桁違いにプローブの相対的な豊かさを表現するためのゼロを中心とした音階の色で表示されます。結果のイメージは、葉酸受容体過剰発現の領域を明らかにするため、サンプルの白い光の画像の上に重ねることができます。
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Representative Results
品質管理のために、図 2に示すように、TEM、DLS、ナノ粒子追跡分析、紫外・可視吸光分光法を含む合成プロセス中にさまざまな方法を使用してナノ粒子を特徴づけることが。
このように、金ナノスター コア (セクション 1) のサイズ、シリカ シェル (セクション 2) の形成とその後表面機能化 (セクション 3) することができます (図 2) を確認します。通常、ゴールド ナノスター コアのサイズ (流体力学的直径) が期待される約 80 nm、およびシリカ シェルが約 20 nm 厚、合計珪ナノ粒子サイズ約 120 nm と約 140 αFR 抗体を用いた後 nm。紫外・可視吸光度は、ナノ粒子の形態を確認する使用できます。水ナノスター コア通常ある吸光度最大 670 nm、silication 後最大約 710 に移るに対し nm。以下の波長で吸光度の最大値は、球状形態または集計のサインです。典型的な反応収率と濃度表 1に示すが、洗浄手順中にピペッティング テクニックによって強く決まります。
ラマン スキャンから得られた各ポイントには、interrogated の場所のためのスペクトルが含まれています。これらのスペクトルは、任意のバック グラウンド蛍光ナノプローブの serr が示すバス信号の線形重ね合わせです。スペクトルを蛍光を削除する処理し、図 3に示すように、CLS モデル (セクション 6 で説明されている) を適用する前に、信号の強度を補うために単位面積に正規化することができます。ナノプローブ参照スペクトルとその pointwise 率の各スコアの代表的なイメージは、図 4のとおりです。各スコアは、個別に腫瘍の特定のローカリゼーションを提供していませんが比率は、播種の微視的拡散の存在を明らかにします。
| ステップ | 最初のボリューム | 初期濃度 | 最終巻 | 最終濃度 |
| 1. ナノスター コア | 8 mL HAuCl4 | 20 mM HAuCl4 | 5 mL | 1.3 nM |
| 2. Silication | 1.2 mL | 1.3 nM | 1.2 mL | 0.5 nM |
| 3.1 なチオール化 | 1 mL | 0.5 nM | 1 mL | 0.43 nM |
| 3.5 活用 | 1 mL | 0.43 nM | 1 mL | 0.39 nM |
表 1: 各反応段階後のナノ粒子収量。濃度は目安です。収量は、ナノ粒子の分析、2 つの独立した合成とそれぞれから 5 独立した測定を追跡によって決定されました。
図 1: レシオ メトリック serr が示すバス ナノプローブ イメージングの合成と応用のスケマティック。(1) 金 nanostars は、セクション 1 で説明したように合成されます。(2) シリカ シェルは、セクション 2 の説明に従って分子 (赤外線染料 IR 780 過塩素酸塩および IR 140) を使用し、2 つの異なるナノ粒子味金ナノスター コアとラマン記者の周り形成されます。(3) ナノ粒子の表面はコーティング チオール、表面機能化をさらに有効にするのには、セクション 3.1 で説明されているようです。セクション 3.3 から 3.6 に示すようものは層の PEG-5 k でパッシベーションが IR 140 中の抗葉酸受容体抗体と結合して IR 780 味ナノ粒子。(セクション 4 で説明したようにびまん性腹腔内卵巣転移拡大の 4) のマウスのモデルを開発し、serr が示すバス ナノプローブを腹腔内投与、準備ができたら。(5) のマウスが安楽死させたし、ラマンとしてイメージングを有効にする公開手術腹部はセクション 5 で説明。(6) のラマン スペクトルは、2 つのプローブの相対量を決定し、セクション 6 で説明した葉酸受容体の過剰発現のレシオ メトリック マップを生成する pointwise 分析されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: Serr が示すバス ナノプローブの物理的キャラクタリゼーション。ナノ粒子は、合成の各部分の後品質管理を受けることが。透過型電子顕微鏡 (TEM) 金コアの形状とナノ粒子凝集; せずシリカ シェルが正常に形成を明らかにします。スケールバー = 100 nm。動的光散乱法 (DLS) は、サイズと成功した silication と高機能化を確認するナノ粒子の ζ 電位を測定できます。紫外・可視吸光度は、プラズモン ピーク約 670 の存在を確認する使用ことができます 710 へのシフト、nanostars の nm nm silication 後。ラマン測定では、各味合成を通してのユニークなスペクトルの存在を明らかにします。ナノスター スペクトラム、ない特性のピークの強度は、強調のための 100 倍で増幅されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ラマン スペクトルの処理します。生スペクトルは、蛍光の線幅のバンドの上に重ね、ナノプローブの serr が示すバス署名で構成されます。基線の減算で蛍光バンドは削除されますとラマン散乱ピークが顕著になります。強度に関係なくナノ粒子の分光署名を検出するために各スペクトル (参照と同様のサンプル) は、単位面積に正規化されます。最後に、スムージング微分フィルターは、ノイズを削減しながら、ラマンピークを高めるに適用されます。比 r. に基づく加工サンプル スペクトルを分類するために、CLS モデルの開発に使用する参照スペクトルこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 腹部の卵巣癌微小のレシオ メトリック イメージングします。生物発光イメージングによって明らかにされたマウスの露出した腹部のイメージング、卵巣転移のラマン。スキャンの各ポイントの特徴である周波数 (セクション 6、図 3) を処理し、CLS モデルでは、2 つの参照のスコアを取得するに基づく得点: αFR NP 赤と青で nt NP に示します。スコア、分かれて pointwise、比率として 2 つのプローブの相対的な豊かさを明らかにします。必要に応じて、しきい値比率、「肯定的」エリアは腹部の光の画像上にスーパーイン ポーズすることができます、切除または他を許可する集中トリートメント。図 4は、仕訳帳からの許可を参照1、適応バージョンです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明したプロトコル ラマンの serr が示すバス ナノプローブの 2 つの「フレーバー」の合成とマウスの雇用のための命令を提供します卵巣腫瘍のレシオ メトリック アルゴリズムを使用して、葉酸受容体を過剰発現のイメージングします。ラマン イメージング (蛍光) など他の光イメージング技術上の主な利点は、生物学的起源の任意の信号と混同することはできませんナノプローブ信号の高特異性です。ラマン イメージングのこの実施例では、ナノ粒子管理されていないローカルでは、静脈内で続き、単一の洗浄ステップの腹腔内注射を介して。この手法は、臨床の場に一度翻訳を視覚化し、したがってすべての卵巣がんインプラントをであって、小さすぎて、肉眼で検出する対象にはできませんを切除する外科医を可能にするエレガントなソリューションとなります。栄養血管の不足のための挿入された全身撮像剤全身循環に接続。同時に私たちの serr が示すバスのナノ粒子が全身循環に吸収しないと、副作用のための潜在的な問題が最小化されます。本研究は nanoconstructs を慎重に設計された成長の証拠の 1 つの例は、従来の画像化と治療技術22,23,24,25、ユニークな利点を提供できます。 26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35,36,37,38。
ここで説明した serr が示すバス ナノプローブは生物学的に不活性、いくつかのがんの種類のマウス ・ モデルにおける腫瘍の描写のために採用されています。(レポーター色素カプセル化と並行) シリカの殻の形成のための反応は以前に報告された合成1,7、8の改良版はナノ粒子凝集しにくい金コア) を除いた「遊離珪酸」ナノ粒子の形成と。ラマンの味の大規模なコレクションを生成するため、ここで紹介したものに加え、市販の赤外線有機色素の様々 な反応を使用できます。結果として得られる信号強度はただし、ゴールド、およびその他の要因への染料の親和性に依存します。さらに、特定の分子と、ポリマーが他よりより多くの金の nanostars の集計、反応染料の量を色素ごとに決定する必要があります。深刻なナノ粒子凝集の場合使用される染料の量を下げる必要があります。ゴールド コアの集計が信号強度、ラマンで深刻な変動が発生し、取得したデータを複雑に、望ましくないです。ラマン信号は用意されていませんので、遊離けい酸の形成は大部分は無害であり、ありません。ただし、機能化中に抗体、シリカ、メソッドの全体的なターゲット効果を減少しているに従います。シリカ シェルの厚みは、反応時間、温度、および水の追加 (手順 2.1) の量に依存します。結果として得られるシリカの殻が薄すぎる (図 1、右上) 場合、1 つ以上これらのパラメーターの適切に増やすことが。
データ集録、に関してその品質は大きく、ナノプローブの明るさに依存します。これ明らかになる特に急速なラマン買収を実行するときセクション 5 で説明されているようです。データがノイズから十分に認識できることを確認するために、スペクトルの検査が必要し、プローブの代表的なラマンピークの存在を確認します。信号が弱い場合、ポイントごとの露光時間を増やすことができます。ただし、このアプローチは法外に長いスキャンまたは非常に低空間分解能につながることができます。再現性と一貫性を確保するラマン スキャナーのキャリブレーションは製造元の推奨に従って実行する必要があり、普通される共通の標準を使用して (例, , シリコン ウエハー)。
このメソッドの主な強みの 1 つは、その汎用性です。異なる腫瘍のタイプさまざまな分子マーカーをターゲット特定の抗体を使用してイメージを作成できます。動物モデルにさらに、ここで説明したナノプローブを管理できます — 腹腔や静脈内-また、同じテクニックを使用して、することができますは使用固定または新鮮な摘出組織を染色します。
レシオ メトリック法顕微鏡腫瘍の検出のための特異性を提供しますが、個々 のプローブの分布は腫瘍領域に固有ではありません。つまり、光熱/光線力学療法など薬物読み込み theranostic 技術はないだろうと、理想的な治療で健康的な分野にも配信されるようです。この手法によってもたらされる 1 つの潜在的な治療上の適用は、レシオ メトリック検出後、腸壁の自動化されたアブレーションでしょう。
我々 はこの地方、願ってラマン イメージングのレシオ メトリック方式は患者における分子イメージング剤として必要な臨床試験の後 serr が示すバス ナノプローブを使用しての道を開くことができます。このメソッドは、ナノ粒子が投与され既に HIPEC の臨床使用されているデバイスを使用して腹部の空洞から、人間の潜在的な将来のアプリケーションに対応する開発されました。
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Disclosures
• M.F.K. は、この仕事に関連して発行されたいくつかのまたは特許出願発明者として表示されます。M.F.K. は、serr が示すバス ナノ粒子を診療所に翻訳をめざすイメージング株式会社リオの共同創設者です。
•著者は、彼らは他競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
次の資金源 (M.F.K.) に認められている: NIH R01 EB017748、R01 CA222836、K08 CA16396;デイモン ・ ラニアン Rachleff 技術革新賞を受賞防災-29-14、パーシング ・ スクエア孫がん研究同盟と技術開発とナノテクノロジー (CMINT) 分子イメージング センター MSKCC パーシング ・ スクエア孫賞が付与されます。受信確認は、MSKCC NIH コア付与 (P30 CA008748) によって提供される助成金サポートを拡張されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent | |||
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| 3-MPTMS | Sigma-Aldrich | 175617 | |
| Ammonium hydroxide (28%) | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| Anti-Folate Receptor antibody [LK26] | AbCam | ab3361 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Dimethyl sulfoxide (anhydrous) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| IR140 | Sigma-Aldrich | 260932 | |
| IR780 perchlorate* | Sigma-Aldrich | 576409 | Discontinued* |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| N.N.Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| PEG crosslinker | Sigma-Aldrich | 757853 | |
| PEG-maleimide | Sigma-Aldrich | 900339 | |
| Tetrachloroauric Acid | Sigma-Aldrich | 244597 | |
| Tetraethyl Orthosilicate | Sigma-Aldrich | 86578 | |
| *IR792 | Sigma-Aldrich | 425982 | *Alternative |
| Name of Equipment | |||
| Dialysis cassette (3,500 MWCO) | ThermoFIsher | 87724 | |
| Centrifugal filters | Millipore | UFC510096 | |
| inVia confocal Raman microscope | Renishaw | ||
| MATLAB (v2014b) | Mathworks | ||
| PLS Toolbox (v8.0) | Eigenvector research |
References
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