Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Surface-förbättrade resonans Raman spridning Nanoprobe Ratiometry för att upptäcka mikroskopisk äggstockscancer via folat Receptor inriktning

Published: March 25, 2019 doi: 10.3791/58389
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3,4,5,6,7
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Department of Chemistry, The Graduate Center of the City University of New York, 3Molecular Pharmacology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT), Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 5Gerstner Sloan Kettering Graduate School of Biomedical Sciences, 6Department of Radiology, Weill Cornell Medical College of Cornell University, 7Dana-Farber Cancer Institute and Harvard Medical Center

Summary

Äggstockscancer bildar metastaser i hela i bukhålan. Här presenterar vi ett protokoll att göra och använda folat-receptor riktade ytan-förbättrade resonans Raman scattering nanoprober som avslöjar dessa lesioner med hög specificitet via proportionerlig imaging. Nanoprober administreras intraperitonealt till levande möss, och de härledda bilderna korrelerar väl med histologi.

Abstract

Äggstockscancer representerar den dödligaste gynekologiska malignitet. De flesta patienter närvarande i ett avancerat stadium (FIGO Stadium III eller IV), när lokala metastatisk spridning redan har skett. Äggstockscancer har dock ett unikt mönster av metastasering, däri tumör implantat finns initialt inom i bukhålan. Den här funktionen kan, i princip, den komplett resektion av tumör implantat med kurativ intention. Många av dessa metastatiska lesioner är mikroskopiska, vilket gör dem svåra att identifiera och behandla. Neutralisera sådan micrometastases tros vara ett viktigt mål mot att eliminera tumören återkommer och att uppnå långsiktiga överlevnad. Raman imaging med surface förbättrade resonans Raman scattering nanoprober kan användas för att avgränsa mikroskopiska tumörer med hög känslighet, på grund av sin ljusa och bioorthogonal spektrala signaturer. Här, vi beskriver syntesen av två 'smaker' av sådana nanoprober: en antikropp-functionalized som mål den folat receptorn — i ökad utsträckning hos många äggstockscancer — och en icke-riktad kontroll nanoprobe, med distinkta spectra. Nanoprober administreras intraperitonealt till musmodeller av metastaserande mänskliga äggstockscancer adenokarcinom. Alla djurstudier godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén av Memorial Sloan Kettering Cancer Center. I bukhålan av djuren är kirurgiskt utsatt, tvättas och skannas med en Raman-microphotospectrometer. Därefter Raman signaturer av de två nanoprober är frikopplade med en klassisk minstakvadratmetoden montering algoritm, och deras respektive poäng fördelat på ger en proportionerlig signal av folat-riktade över oriktade sonder. På detta sätt visualiseras mikroskopiska metastaser med hög specificitet. Den största fördelen med denna metod är att den lokala tillämpningen in i bukhålan — som kan göras bekvämt under det kirurgiska ingreppet — kan tagga tumörer utan att utsätta patienten för systemisk nanopartiklar exponering. Falskt positiva signaler som härrör från icke-specifik bindning av nanoprober på visceral ytor kan elimineras genom att följa en proportionerlig strategi var riktade och icke öronmärkt nanoprober med distinkta Raman signaturer tillämpas som en blandning. Förfarandet begränsas fortfarande av avsaknaden av en kommersiell wide-fältet Raman imaging kamerasystem, vilken en gång tillgänglig kommer att möjliggöra tillämpningen av denna teknik i drift theater.

Introduction

Raman imaging med 'Yta förbättrade Raman spridning' (SERS) nanopartiklar har visat mycket lovande i avgränsar lesioner i en mängd olika inställningar och för många olika tumör typer1,2,3,4 . Den största fördelen med SERS nanopartiklar är deras fingeravtryck-liknande spektrala signatur, ge dem obestridliga identifiering som inte försvåras av biologiska bakgrunden signaler5. Intensiteten i den utsända signalen förstärks dessutom ytterligare med hjälp av reporter molekyler (färgämnen) med absorbansen maxima i linje med excitation laser, ger upphov till 'yta förbättrade resonans Raman spridning' (SERRS) nanopartiklar med ännu större känslighet6,7,8,9,10,11,12.

En barriär som måste tas upp för antagande av SE(R)RS nanopartiklar13 och många andra nanopartiklar konstruktioner14,15 för klinisk användning är deras administreringssätt, som intravenös injektion orsakar systemisk exponering av agent, och kräver omfattande tester för att utesluta eventuella biverkningar. I denna artikel presenterar vi ett annat paradigm baserat på tillämpningen av nanopartiklar lokalt i vivo, direkt in i bukhålan under operation, följt av en tvätt steg ta bort någon obundna nanopartiklar1. Detta tillvägagångssätt är i linje med nya terapeutiska metoder som för närvarande under utredning som också gör användning av lokala instillation av agenter i peritoneal hålighet, kallas hyperthermic intraperitoneal cytostatika (HIPEC). Således bör principen vara relativt lätt att integrera i en kliniska arbetsflödet. Vi har studerat biodistribution av nanopartiklar efter intraperitoneal applicering, och har inte observerat någon detekterbar absorption in i systemcirkulationen1. Dessutom kringgår den lokala tillämpning metoden beslagtagande av nanopartiklar av Retikuloendoteliala systemet, så numrerar av nanopartiklar krävs reduceras markant. Men när de appliceras lokalt, tenderar antikropp-functionalized nanopartiklar att följa på visceral ytor även i avsaknad av sina mål. För att minimera falska positiva signaler på grund av icke-specifika nanopartiklar vidhäftning, bedriva vi en proportionerlig strategi, där ett molekylärt riktade nanoprobe ger specifika signalen, och en icke-riktad kontroll nanoprobe, med olika Raman spektrum, konton för icke-specifik bakgrund16,17. Vi har visat denna metod av lokalt applicerad yta förbättrade resonans Ramanspektroskopi proportionerlig nyligen i en musmodell av diffusa äggstockscancer1.

Det övergripande målet med denna metod är att utveckla två SERRS nanoprober, en riktad och en icke-specifik, tillämpas lokalt i musmodeller, för bild på prevalens/överuttryck av en cancer relaterade biomarkör med proportionerlig identifiering av de två sonderna via Raman imaging. I detta arbete valdes folat receptorn (FR) som mål, eftersom detta är en markör uppreglerad i många äggstockscancer18,19. Raman microimaging med SERS-baserade nanopartiklar har också visats för cancer cell identifiering20. Två distinkta ”varianter” av Raman nanopartiklar syntetiseras, var och en som följer sitt fingeravtryck från ett annat organiskt färgämne. Nanopartiklarna består av en stjärnformad guld kärna omgiven av en kiseldioxid skal och demonstrera ytan plasmon resonans på cirka 710 nm. Raman reportern (organiskt färgämne) sätts parallellt med bildandet av kiseldioxid skal. Slutligen, för det FR-riktade nanoprober (αFR-NPs) kiseldioxid skal är konjugerat med antikroppar, medan de icke-riktade nanoprober (nt-NPs) är passiviseras med en enskiktslager av polyetylenglykol (PEG).

Denna teknik användes framgångsrikt att mappa mikroskopiska tumörer i en musmodell xenograft av diffusa metastaserad äggstockscancer (SKOV-3), visar dess tillämplighet för Invivo användning. Det kan också förlängas för användning i exciderad vävnad, för tumör fenotypning eller marginal bestämning efter möjligt som visas i en cognate studie21.

SERRS nanoprober ger en robust plattform för skapandet av flera riktade Taggar för biomarkörer, syntetiseras med enkla kemiska reaktioner som beskrivs schematiskt i figur 1. Här presenterar vi protokollet för syntes av de två typerna av SERRS nanoprober (avsnitt 1-3), utveckling av en lämplig äggstockscancer musmodell (avsnitt 4), administrationen av nanoprober och imaging (avsnitt 5) och slutligen dataanalys och visualisering (avsnitt 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurstudier godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén av Memorial Sloan Kettering Cancer Center (#06-07-011).

1. guld Nanostar Core syntes

Obs: Guld nanostars används som kärnor för båda smaker av SERRS nanoprober används i detta experiment.

  1. Bereda 800 mL 60 mM askorbinsyra (C6H8O6) lösning i avjoniserat vatten (DI) och 8 mL av 20 mM tetrachloroauric syra (HAuCl4) lösning i DI-vatten. Kyl ned till 4 ° C.
  2. Utföra denna reaktion steg vid 4 ° C. Placera en e-kolv som innehåller 800 mL askorbinsyra lösningen på en magnetisk uppståndelse tallrik och framkalla en stadig virvel. Snabbt lägga till 8 mL av tetrachloroauric syra lösningen in i virveln. Nanostars kommer att utgöra och lösningen kommer att anta en mörkblå färg inom sekunder. I fall det blir färgen helst rosa eller lila, betecknar bildandet av nanospheres, suspensionen kasseras och syntesen reattempted.
  3. Häll 50 mL koniska rör och Centrifugera i 20 min (4 ° C, 3 220 x g) nanostar suspensionen. Aspirera supernatanten lämnar ungefärliga 200 µL av lösningen i varje rör. Betala försiktighet att inte störa pelleten av nanopartiklar på botten av röret.
    Obs: Supernatanten bör ha en blå nyans på grund av återstående svävande nanostars.
  4. Med hjälp av en mikropipett, skaka lösningen för att avbryta och samla nanopartiklarna från varje rör. Del av pelleten kan komprimeras på undersidan av röret och kommer inte att resuspendera även med kraftig pipettering-kassera denna del.
  5. Överföra nanopartiklar suspensionen till en dialys kassett (MWCO 3,5 kDa) och dialyze minst tre dagar mot 2 L DI vatten, byta vattnet dagligen. Lagra nanostars i dialys vid 4 ° C i upp till en månad med vatten förändringar varje 3-4 dagar.
    Obs: Nanostars bör hållas i dialys tills krävs för den silication reaktionen, som beskrivs i avsnitt 2.

2. bildandet av kiseldioxid skal

Obs: Två smaker av Raman nanoprober syntetiseras. Syntes förfarandet är samma för båda, med den enda skillnaden är Raman reporter molekylen (färgämne) används. I detta experiment används IR780 perklorat och IR140. Reaktionen bör alltid utföras i plastbehållare. Syntesen är mycket skalbart och kan justeras för den önskade mängden injectate som krävs. Här beskrivs en medellång batch syntes, som kan skalas linjärt till lägre eller högre volymer som behövs, med samma koncentrationer och reaktionstider. Reaktionerna för två SERRS nanoprobe typer kan utföras parallellt. Uppmärksamma att undvika korskontaminering. Ultraljudsbehandling bör utföras för redispersion av nanopartiklar pellets efter centrifugering under tvätt steg eller efter nanopartiklarna har lagrats längre än en timme. Ultraljudsbehandling bör utföras tills nanopartiklarna är tydligt svävande i lösningen, typiskt för 1 s.

  1. I röret A (en 50 mL konisk slang), blanda 10 mL isopropanol, 500 µL av TEOS, 200 µL avjoniseratvatten, och 60 µL av färgämne (IR780 perklorat eller IR140, 20 mM i DMF (dimetylformamid)).
  2. I rör B (15 mL koniska rör), blanda 3 mL etanol och 200 µL ammoniumhydroxid. Sonikera i nanostars från steg 1.4 att skingra alla kluster i lösning och tillsätt 1,2 mL av nanostars till röret.
    Obs: ammoniumhydroxidlösning är mycket flyktiga och svårt att Pipettera exakt. Förvara den vid 4 ° C, tills det behövs, att underlätta pipettering.
  3. Placera röret A på en vortex mixer och framkalla en stadig virvel. Snabbt lägga till innehållet i Tube B in i virveln och hålla blandning för ca 5 s. omedelbart överföra till en shaker och låt reagera i 15 min under omskakning vid 300 rpm, vid rumstemperatur.
  4. Efter 15 min ruvning, släcka reaktionen genom att lägga till etanol för att fylla de 50 mL tub. Centrifugera under 20 minuter vid 3 220 x g och 4 ° C.
  5. Aspirera supernatanten, lämnar ca 0,5 mL lösning, vara noga med att inte störa pelleten. Tillsätt 1 mL etanol och agitera med en pipett för att resuspendera nanopartiklarna. Överföra till ett 1,5 mL centrifugrör och tvätta 4 gånger med etanol genom centrifugering vid 11 000 x g i 4 min, aspirera supernatanten och omblandning pelleten av ultraljud för cirka 1 s.
    Obs: I detta skede, kan den silicated nanopartiklar functionalized, som beskrivs i avsnitt 3 eller resuspended i avjoniseratvatten med en extra tvätt steg för lagring vid 4 ° C i upp till en vecka.

3. ytan funktionalisering

Obs: IR780 SERRS nanoprober kommer att vara konjugerat med folat receptor-targeting antikroppar via en PEG crosslinker till NPs-form αFR; IR140 SERRS kontroll nanoprober kommer vara konjugerat med ett passivt PEG enskiktslager, för nt-NPs. Båda smaker bildas via en tiol-maleimide reaktion i separata men parallell reaktioner.

  1. Tvätta nanopartiklar två gånger genom centrifugering vid 11 000 x g i 4 min, aspirera supernatanten och omblandning pelleten i 1 mL etanol av ultraljud. Upprepa steget tvätt en gång till, men redisperse i 1 mL av 85% etanol, 10% 3-MPTMS (3-mercaptopropyltrimethoxysilane) och 5% DI-vatten. Odla i rumstemperatur för 1-2 h att införa Tioler på partikeln ytbehandlar.
  2. Tvätta de thiol-functionalized nanopartiklarna genom centrifugering vid 11 000 x g i 4 min, aspirera supernatanten och omblandning pelleten av ultraljud, två gånger i etanol, två gånger i DI, och slutligen i HEPES (4-(2-hydroxietyl) -1- piperazineethanesulfonic syra) buffert (10 mM, pH 7,1), och ställ åt sidan.
    Obs: MES (2-(N- morpholino) ethanesulfonic syra) buffert eller HEPES bör användas. Buffertar med högre salthalt, såsom PBS (fosfatbuffrad koksaltlösning), kan inducera nanopartiklar aggregering.
  3. För NPs-antikropp functionalized αFR, reagera 200 µg av antikroppar (anti folat bindande protein antikropp klon [LK26]) med tiofaldig molar överskott av PEG crosslinker (poly(ethylene glycol) (N-hydroxysuccinimide 5-pentanoate) eter N′-(3- maleimidopropionyl) aminoethane (CAS: 851040-94-3), i dimetyl sulfoxid (DMSO)) i 500 µL MES buffert (10 mM, pH 7.1) i 30 min.
  4. Ta bort överflödigt crosslinker och koncentrera antikropp genom centrifugering antikropp-PEG lösningen i en centrifugal filter (MWCO 100 kDa). För de centrifugal filter som används i denna studie, utföra centrifugering i 10 min vid 14 000 x g och 23 ° C. Återställa de konjugerade antikropparna i en frisk slang genom invertering filtret och centrifugering vid 1 000 x g i 2 min.
  5. Pipettera de IR780 nanopartiklarna från steg 3,2 i röret med antikropparna och agitera med pipetten att blanda. Inkubera blandningen under minst 30 minuter vid rumstemperatur, eller, alternativt vid 4 ° C över natten att bilda αFR-NPS-servern.
  6. Att bilda nt-NPs, Lägg till 1% w/v metoxi-avslutad (m) PEG5000-maleimide (CAS: 99126-64-4) upplöst i DMSO till de IR140 SERRS nanopartiklarna från steg 3,2 och låt reagerar i 500 µL MES buffert (10 mM, pH 7.1) i minst 30 min i rumstemperatur, alternativt vid 4 ° C över natten.
  7. För administrering till möss (avsnitt 5), spinn ner båda nanoprobe smaker vid 11 000 x g i 4 min, aspirera supernatanten för att ta bort lösningen med gratis oreagerad antikroppar/PEG och redisperse varje smak i MES buffert (10 mM, pH 7.1) vid 600 pM koncentration . När omblandning av nanopartiklar, minimera onödig exponering för ultraljud, att förhindra denaturering av antikroppen.

4. mus modellutveckling

  1. Etablera en stadig kultur av mänskliga äggstockscancer adenocarcinom (SKOV-3) cellinje. Du kan också aktivera övervakning via mareld/fluorescens, Använd transfekterade SKOV-3 Luc+/GFP+ celler. Kultur celler i RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium med 10% fetalt kalvserum och passage två gånger i veckan. Injektionsvätska, Inkubera cellerna med 0,25% trypsin/0.05% EDTA för 3 min att lossa, och därefter tvätta och återsuspendera i PBS på 2 x 106 celler/100 µL.
  2. För att fastställa den ovariella micrometastasis modellen, injicera 200 µL av suspenderade SKOV-3 celler intraperitonealt i atymiska honmöss (FOXn1nu/FOXn1nu möss, 6-8 veckor gamla). Disseminerad peritoneal spridning kommer att ske i ca 4 veckor. Om du använder SKOV-3 Luc+ celler, kan tumörtillväxt övervakas med mareld genom att administrera 2 mg skalbagge luciferin i 50 µL PBS via retroorbital injektion.

5. Nanoprobe injektion och Imaging

  1. Förbereda nanoprober (αFR-NPs och nt-NPs) som beskrivs i avsnitten 1-3 och blanda i förhållandet 1:1, för en slutlig koncentration på 300 pM av varje typ i MES buffert (10 mM, pH 7.1). Du kan också förbereda referensstandarder av 30 pM av nanoprobe smaker i små (100 µL) koniska rör.
  2. Injiceras intraperitonealt 1 mL nanopartiklar suspensionen i varje mus och massera magen för att distribuera nanopartiklarna i peritoneal hålrummet. Återgå musen till sina bostäder. Efter 25 eller fler minuter, avliva musen via CO2 kvävning.
  3. Fästa musen på en kirurgisk plattform, vid ryggläge (för hela buken imaging, plattform behov att få monterbar på upprätt Mikroskop scenen).
    1. Använda tandad tång och dissektion sax, ta bort huden för att exponera bukhinnan och utföra en stor sagittal incision (mellan 2 och 3 cm i längd) för att exponera hela buken. Fäst peritoneal viftar på plattformen. Tvätta insidan av bukhålan med minst 60 mL PBS med hjälp av en plast sprutande flaska.
      Obs: För att aktivera fri avbildning av hela buken, måste tarmarna mobiliseras eller exciderad. För excision, resect med en ligering av den mesenteriala fartygen för att minska blödning i bukhålan.
    2. Alternativt att bild specifika organ, punktskatter dem efter den PBS tvättningen och placera dem på ett objektglas.
  4. Överföra plattform eller bilden till en Raman microspectrophotometer med upprätt optisk konfiguration och en motoriserad scen för imaging; använda ett kommersiellt system med en 300 mW 785 nm diodlaser, ett galler av 1.200 spår per mm, centrerad på 1 115 cm-1.
    1. Fokusera på området av intresse som använder vitt ljus optik, parfocal med Raman laser. Välj området att avbildas och önskad upplösning; i denna rapport en höghastighets förvärv läge användes (spectra förvärvade under kontinuerlig laserbestrålning med Mikroskop scenen ständigt i rörelse, med effektiv rumslig upplösning 14,2 µm av 200 µm; på 5 x förstoring, 100 mW power på mål, och < 100 ms exponering per punkt).
      Obs: Rören med referens nanoprober från steg 5.1 kan placeras inom området avbildas om så önskas, att tillhandahålla interna referensstandarder för efterföljande analys. Kontrollera att inga främmande ljuskällor än lasern når målet.
  5. Du kan också förbereda provet för histologisk bearbetning och validering av fixering i 4% paraformaldehyd i PBS över natten vid 4 ° C. Skölj med PBS vid 4 ° C i 15 min minst två gånger. Hålla provet i 70% etanol i vatten tills standard histologisk bearbetning och paraffin inbäddning. För histologiska validering av tumörer, kan sektioner (5 µm tjock) från olika djup av paraffin blocket färgas med hematoxylin och eosin (H & E).

6. databearbetning och visualisering

Obs: Alla databehandling utfördes med ett grafiskt användargränssnitt som egenutvecklade, med kommersiell programvara. Alla de funktioner som används har generiska motsvarigheter tillgängliga i andra datormiljöer.

  1. Få referens spectra för två smaker, genom förhör ren suspensioner av varje. Referens spektra kan härledas från punkt skannar av nanoprober, avbildning av nanoprober i brunn-plattor, eller genom interna referenser i experimentell skannar i referens rören (se steg 5.1).
  2. Förbearbeta referens spektra, med hjälp av baslinjen subtraktion (Whittaker filter, λ = 200), normalisering av arean under den kurvan, och Savitzky-Golay härledda filter (andra gradens polynom passar, första ordningens derivat, bredd = 15 steg). Dessa förbehandlas spectra kommer att fungera som referenser för klassiskt minstakvadratmetoden (CLS) modell.
  3. Förbearbeta exempeldata från bilden på samma sätt som referens spektra. Erhålla CLS poäng för varje prov med hjälp av en tillgänglig CLS-algoritm. Direkta CLS (Dataanslutningsbibliotek) poängen är helt enkelt koordinaterna för projektionen av ett prov spektrum på det linjära utrymme som definieras av generaliserad inverse matrix (Moore-Penrose omvänd) av referens spektra. Andra tillbehöret algoritmer kan vara används (negativt minstakvadratmetoden, partiell minstakvadratmetoden eller andra).
    Obs: Några passande algoritmer kan ge upphov till negativa poäng, som i detta sammanhang inte är fysisk. Om så är fallet, en tröskel kunde fastställas att utesluta negativa värderingar eller en begränsad icke-negativa minsta kvadrat-algoritmen vara anställd istället.
  4. Beräkna elementvis förhållandet mellan poängen på referensen för de rikta nanopartiklarna (noterαFR) över poängen på referensen för den icke-riktade nanopartiklar (noternt). Om poängen är negativt, kan förhållandet uttryckas i en logaritmisk mode:
    R = log10(noterαFR/ noternt).
    Förhållandet R visas bäst i en avvikande färgskala centrerad på noll, att uttrycka det relativa överflödet av sonderna i tiopotenser. Den resulterande bilden kan vara överlagras på den vita ljus bilden av provet, avslöja delar av folat receptor överuttryck.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För kvalitetskontroll, kan nanopartiklarna karakteriseras med hjälp av olika metoder under syntesprocessen, inklusive TEM, DLS, nanopartiklar spårning analys och UV/Vis absorbansen spektroskopi, som visas i figur 2.

På detta sätt, storleken på guld nanostar kärnan (beskrivs i avsnitt 1), bildandet av kiseldioxid skal (avsnitt 2) och efterföljande ytan funktionalisering (avsnitt 3) kan vara verifierade (figur 2). Typiskt, storlek (hydrodynamic diameter) guld nanostar kärnan förväntas bli runt 80 nm, och kiseldioxid skal är runt 20 nm tjock, vilket gör den totala silicated nanopartiklar storleken ca 120 nm och cirka 140 nm efter konjugering med αFR-antikroppen. UV/Vis absorbansen kan också användas för att verifiera morfologi av nanopartiklarna. Nanostar kärnor i vatten har normalt en absorbans maximalt vid 670 nm, medan efter silication maximalt skiftar till cirka 710 nm. Absorbansen maxima vid lägre våglängder är ett tecken på antingen sfäriska morfologi eller aggregering. Typiska reaktion avkastning och koncentrationer visas i tabell 1 och beroende starkt pipettering teknik under tvätta stegen.

Varje punkt som erhållits från Raman scan innehåller ett spektrum för en förhört läge. Dessa spectra är en linjär superposition av den nanoprober SERRS signal och någon bakgrund fluorescens. Spektra kan bearbetas för att ta bort fluorescensen och normaliserade till ytenhet att kompensera för signalstyrka, före tillämpning av CLS modellen (beskrivs i avsnitt 6), som visas i figur 3. Representativa bilder för betyg på varje nanoprobe referens spektra och deras elementvis baserat visas i figur 4. Även om varje poäng individuellt inte ger specifik lokalisering av tumörer, avslöjar förhållandet förekomsten av disseminerad mikroskopiska spridningen.

Steg Ursprunglig volym Initial koncentration Slutlig volym Slutlig koncentration
1. Nanostar kärna 8 mL HAuCl4 20 mM HAuCl4 5 mL 1.3 nM
2. Silication 1,2 mL 1.3 nM 1,2 mL 0,5 nM
3.1. Thiolation 1 mL 0,5 nM 1 mL 0,43 nM
3.5. konjugation 1 mL 0,43 nM 1 mL 0,39 nM

Tabell 1: nanopartiklar avkastning efter varje reaktion steg. Halterna är ungefärliga. Avkastningen bestämdes av nanopartiklar spårning analys, med två oberoende synteser och 5 oberoende mätningar från varje.

Figure 1
Figur 1 : Schematisk av syntes och tillämpningen av proportionerlig SERRS nanoprobe imaging. (1) guld nanostars syntetiseras som beskrivs i avsnitt 1. (2) en kiseldioxid skal bildas runt guld nanostar kärnor och Raman reporter molekyler (infraröd färgämnen IR-780 perklorat och IR-140) används för att skapa två distinkta nanopartiklar smaker, som beskrivs i avsnitt 2. (3) nanopartiklarna yta är belagd med Tioler, som beskrivs i avsnitt 3.1, att möjliggöra ytterligare ytan funktionalisering. De IR-780 smak nanopartiklarna konjugeras med en anti folat Receptor antikroppar, medan de IR-140 ettor är passiviseras med ett lager av PEG - 5 k som beskrivs i avsnitt 3.3 till 3.6. (4) en musmodell av diffusa intraperitoneal cystor metastasering är utvecklat som beskrivs i avsnitt 4, och när du är klar, de SERRS nanoprober administreras intraperitonealt. (5) möss är euthanized och buken opereras utsätts för att aktivera Raman imaging som beskrivs i avsnitt 5. (6) Raman spectra analyseras punktvis för att avgöra det relativa överflödet av de två sonderna och generera en proportionerlig karta över folat receptor överuttryck som beskrivs i avsnitt 6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Fysikaliska karakterisering av SERRS nanoprober. Nanopartiklarna kan genomgå kvalitetskontroll efter varje del av syntesen. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) avslöjar formen på guld kärnan och framgångsrika bildandet av kiseldioxid skal utan nanopartiklar aggregering; Skalstapeln = 100 nm. Dynamiska ljusspridning (DLS) kan mäta storleken och ζ-potentialen hos nanopartiklarna att verifiera framgångsrik silication och funktionalisering. UV/Vis absorbansen kan användas för att bekräfta förekomsten av en plasmoniska topp omkring 670 nm för den nanostars, skifta till 710 nm efter silication. Raman mätningar avslöja förekomsten av unika spektra av varje smak i hela syntesen. Intensiteten av nanostar spektrum, med inga karakteristiska toppar, förstärktes av 100 x för betoning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Bearbetning av Raman spectra. Råa spectra består av den nanoprober SERRS signatur, överlagras ovanpå ett brett fluorescens band. Med baslinjen subtraktion fluorescens bandet tas bort och Raman toppar bli framträdande. För att upptäcka den spektrala signaturen för nanopartiklarna oavsett intensitet, är varje spektrum (referenser och prover både) normaliserat till ytenhet. Slutligen används en utjämning-derivat filter för att öka Raman toppar, samtidigt minska buller. Bearbetade referens spektra används för att utveckla en CLS modell, för att klassificera de bearbetade prov spectra baserat på kvoten R. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Proportionerlig avbildning av äggstockscancer micrometastases i buken. Raman imaging av exponerade buken av en mus, med omfattande cystor metastaser som avslöjades av mareld imaging. Varje punkt i genomsökningen har ett spektrum, som är bearbetade (avsnitt 6, figur 3) och gjorde baserat på en modell för CLS, att erhålla poäng på två referenser: αFR-NP visas i rött och nt-NP i blått. Poängen delas sedan punktvis, för att avslöja det relativa överflödet av de två sonderna som ett förhållande. Alternativt genom tröskelvärde förhållandet, de ”positiva” områdena kan läggas ovanpå på en optisk avbildning av buken, att tillåta resektion eller andra inriktade behandlingar. Figur 4 är en anpassad version från referens1, med tillstånd från journalen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet beskrivs här ger instruktion för syntesen av två ”varianter” av SERRS nanoprober, och deras anställning hos möss för Raman imaging av cystor tumör överuttryck av folat Receptor, med en proportionerlig algoritm. Den största fördelen med Raman imaging över andra optisk imaging tekniker (såsom fluorescens) är hög specificitet för den nanoprobe signal som inte kan blandas ihop med några signaler av biologiskt ursprung. I detta förkroppsligande av Raman imaging, administreras nanopartiklarna inte intravenöst, men lokalt, via en intraperitoneal injektion följt av en enda tvätt steg. Denna metod, en gång översatt till kliniska arenan, skulle utgöra en elegant lösning för att kirurger att visualisera och därför resect alla äggstockscancer implantat, även de som är för liten för att upptäcka med blotta ögat, och som inte kan riktas med en systemiskt injicerade avbildning agent på grund av deras bristande utfodring fartyg anslutna till den systemiska cirkulationen. Samtidigt, som våra SERRS nanopartiklar inte är resorberas till systemcirkulationen, minimeras potentiella oro för biverkningar. Vår studie är ett exempel på den växande bevis för att noggrant utformade nanoconstructs kan ge unika fördelar jämfört med konventionella imaging och terapi tekniker22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35,36,37,38.

De SERRS nanoprober som beskrivs här är biologiskt inert och har varit anställd för tumör avgränsning i musmodeller av flera typer av cancer. Reaktionen för bildandet av kiseldioxid skal (samtidiga med reporter dye inkapsling) är en förbättrad version av vår tidigare rapporterade syntes1,7,8, som är mindre benägna att nanopartiklar aggregering och bildandet av ”fri kvarts” nanopartiklar (utan guld kärna). Reaktionen kan användas med en mängd olika kommersiellt tillgängliga infraröd organiska färgämnen, förutom de som presenteras här, för att ge en stor samling av Raman smaker. Den resulterande signalintensitet, beror dock på den dye affinitet till guld och andra faktorer. Mängden färgämne tillsätts reaktionen bör dessutom fastställas på basis per-dye, eftersom vissa molekyler och deras counterions orsaka aggregering av den guld nanostars mer än andra. Vid svår nanopartiklar sammanföring minskas mängden färgämne som används. Aggregering av guld kärnor är inte önskvärt, eftersom det kan orsaka svår variabilitet i Raman signalintensitet och komplicera förvärvade data. Bildandet av kisel är för det mesta ofarlig, eftersom det ger ingen Raman-signal. Dock under funktionalisering fäster antikropparna på silica nanopartiklar, minskar den övergripande inriktning effektiviteten i metoden. Tjockleken av kiseldioxid skal beror på reaktionstid, temperaturen och mängden vatten som tillsätts (steg 2.1). Om den resulterande kiseldioxid skalet bedöms för tunt (figur 1, överst till höger), kan en eller flera av dessa parametrar ökas på lämpligt sätt.

När det gäller datainsamling beror dess kvalitet kraftigt på ljusstyrkan på nanoprober. Detta blir särskilt påtagligt när du utför snabba Raman förvärv, som beskrivs i avsnitt 5. Kontrollera att data är tillräckligt urskiljbar från buller, spektra bör inspekteras och förekomsten av representativa Raman toppar i sonderna verifierade. Om signalen är för svag, kan Exponeringstid per punkt ökas. Men kan denna strategi leda till oöverkomligt lång skanningar eller mycket låg spatial upplösning. För att säkerställa reproducerbarhet och konsekvens, kalibrering av Raman skannern ska utföras enligt tillverkarens rekommendation och görs vanligtvis med hjälp av en gemensam standard (t.ex., en kisel wafer).

En av styrkorna med denna metod är dess mångsidighet. Olika tumörtyper kan avbildas med hjälp av specifika antikroppar riktade olika molekylära markörer. Dessutom de nanoprober som beskrivs här kan administreras till djurmodeller — intraperitonealt eller intravenöst — men, med samma tekniker, de kan också användas att färga vävnader, antingen fast eller nymalen exciderad.

Även om proportionerlig tekniken ger specificitet för detektion av mikroskopiska tumörer, är fördelningen av de individuella sonderna inte specifika för områdena tumör. Detta innebär att theranostic tekniker såsom photothermal/fotodynamisk terapi eller läkemedel-lastning inte skulle vara perfekt, som terapin skulle levereras till friska områden liksom. Ett potentiella terapeutiska program ges av denna teknik skulle vara automatiserade ablation av microtumors efter proportionerlig upptäckt.

Vi hoppas att denna lokal, proportionerlig strategi av Raman imaging kan bana väg för med SERRS nanoprober, efter nödvändiga kliniska prövningar, som en molekylär avbildning agent hos patienter. Denna metod utvecklades för att vara kompatibel med potentiella framtida tillämpningar i människor, som nanopartiklarna kan administreras till och tas bort från bukhålan använder enheter som redan är i klinisk användning för HIPEC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

• MFK visas som en uppfinnare på flera utfärdade eller väntande patentansökningar relaterade till detta arbete. MFK är en av grundarna av RIO Imaging, Inc., som syftar till att omsätta SERRS nanopartiklar i klinikerna.

• Författarna förklarar att de har inga andra konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

De följande finansieringskällorna (till MFK) erkänns: NIH R01 EB017748, R01 CA222836 och K08 CA16396; Damon Runyon-Rachleff Innovation Award KVR-29-14, Pershing Square Sohn priset av Pershing Square Sohn Cancer forskningsallians och MSKCC Center för molekylär Imaging & nanoteknik (CMINT) och teknikutveckling beviljar. Bekräftelser är även utvidgas till bidragsfinansiering stödet från MSKCC NIH Core bidraget (P30-CA008748).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Reagent
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960
3-MPTMS Sigma-Aldrich 175617
Ammonium hydroxide (28%) Sigma-Aldrich 338818
Anti-Folate Receptor antibody [LK26]  AbCam ab3361
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 276855
Dimethyl sulfoxide (anhydrous) Sigma-Aldrich 276855
Ethanol Sigma-Aldrich 792780
IR140 Sigma-Aldrich 260932
IR780 perchlorate* Sigma-Aldrich 576409 Discontinued*
Isopropanol Sigma-Aldrich 650447
N.N.Dimethylformamide Sigma-Aldrich 227056
PEG crosslinker Sigma-Aldrich 757853
PEG-maleimide Sigma-Aldrich 900339
Tetrachloroauric Acid Sigma-Aldrich 244597
Tetraethyl Orthosilicate Sigma-Aldrich 86578
*IR792 Sigma-Aldrich 425982 *Alternative
Name of Equipment
Dialysis cassette (3,500 MWCO) ThermoFIsher 87724
Centrifugal filters Millipore UFC510096
inVia confocal Raman microscope Renishaw
MATLAB (v2014b) Mathworks
PLS Toolbox (v8.0) Eigenvector research

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oseledchyk, A., Andreou, C., Wall, M. A., Kircher, M. F. Folate-Targeted Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detection of Microscopic Ovarian Cancer. ACS Nano. 11 (2), 1488-1497 (2017).
  2. Andreou, C., et al. Imaging of Liver Tumors Using Surface-Enhanced Raman Scattering Nanoparticles. ACS Nano. 10 (5), 5015-5026 (2016).
  3. Karabeber, H., et al. Guiding brain tumor resection using surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and a hand-held Raman scanner. ACS Nano. 8 (10), 9755-9766 (2014).
  4. Kircher, M. F., et al. A brain tumor molecular imaging strategy using a new triple-modality MRI-photoacoustic-Raman nanoparticle. Nature Medicine. 18 (5), 829-834 (2012).
  5. Andreou, C., Kishore, S. A., Kircher, M. F. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy: A New Modality for Cancer Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1295-1299 (2015).
  6. Harmsen, S., et al. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nature Communications. 6, 6570 (2015).
  7. Harmsen, S., et al. Surface-enhanced resonance Raman scattering nanostars for high-precision cancer imaging. Science Translational Medicine. 7 (271), 271ra277 (2015).
  8. Harmsen, S., Wall, M. A., Huang, R., Kircher, M. F. Cancer imaging using surface-enhanced resonance Raman scattering nanoparticles. Nature Protocols. 12 (7), 1400-1414 (2017).
  9. Huang, R., et al. High Precision Imaging of Microscopic Spread of Glioblastoma with a Targeted Ultrasensitive SERRS Molecular Imaging Probe. Theranostics. 6 (8), 1075-1084 (2016).
  10. Iacono, P., Karabeber, H., Kircher, M. F. A "schizophotonic" all-in-one nanoparticle coating for multiplexed SE(R)RS biomedical imaging. Angewandte Chemie, International Edition in English. 53 (44), 11756-11761 (2014).
  11. Spaliviero, M., et al. Detection of Lymph Node Metastases with SERRS Nanoparticles. Molecular Imaging and Biology. 18 (5), 677-685 (2016).
  12. Nayak, T. R., et al. Tissue factor-specific ultra-bright SERRS nanostars for Raman detection of pulmonary micrometastases. Nanoscale. 9 (3), 1110-1119 (2017).
  13. Thakor, A. S., et al. The fate and toxicity of Raman-active silica-gold nanoparticles in mice. Science Translational Medicine. 3 (79), 79ra33 (2011).
  14. Liu, J., et al. Effects of Cd-based Quantum Dot Exposure on the Reproduction and Offspring of Kunming Mice over Multiple Generations. Nanotheranostics. 1 (1), 23-37 (2017).
  15. Wu, N., et al. The biocompatibility studies of polymer dots on pregnant mice and fetuses. Nanotheranostics. 1 (3), 261-271 (2017).
  16. Garai, E., et al. High-sensitivity real-time, ratiometric imaging of surface-enhanced Raman scattering nanoparticles with a clinically translatable Raman endoscope device. Journal of Biomedical Optics. 18 (9), 096008 (2013).
  17. Wang, Y. W., et al. Rapid ratiometric biomarker detection with topically applied SERS nanoparticles. Technology (Singap World Sci). 2 (2), 118-132 (2014).
  18. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
  19. Vergote, I. B., Marth, C., Coleman, R. L. Role of the folate receptor in ovarian cancer treatment: evidence, mechanism, and clinical implications. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 41-52 (2015).
  20. Fasolato, C., et al. Folate-based single cell screening using surface enhanced Raman microimaging. Nanoscale. 8 (39), 17304-17313 (2016).
  21. Wang, Y. W., et al. Raman-Encoded Molecular Imaging with Topically Applied SERS Nanoparticles for Intraoperative Guidance of Lumpectomy. Cancer Research. 77 (16), 4506-4516 (2017).
  22. Andreou, C., Pal, S., Rotter, L., Yang, J., Kircher, M. F. Molecular Imaging in Nanotechnology and Theranostics. Molecular Imaging and Biology. 19 (3), 363-372 (2017).
  23. Chitgupi, U., Qin, Y., Lovell, J. F. Targeted Nanomaterials for Phototherapy. Nanotheranostics. 1 (1), 38-58 (2017).
  24. Choi, D., et al. Iodinated Echogenic Glycol Chitosan Nanoparticles for X-ray CT/US Dual Imaging of Tumor. Nanotheranostics. 2 (2), 117-127 (2018).
  25. Dubey, R. D., et al. Novel Hyaluronic Acid Conjugates for Dual Nuclear Imaging and Therapy in CD44-Expressing Tumors in Mice In Vivo. Nanotheranostics. 1 (1), 59-79 (2017).
  26. Gupta, M. K., et al. Recent strategies to design vascular theranostic nanoparticles. Nanotheranostics. 1 (2), 166-177 (2017).
  27. Huang, Y. J., Hsu, S. H. TRAIL-functionalized gold nanoparticles selectively trigger apoptosis in polarized macrophages. Nanotheranostics. 1 (3), 326-337 (2017).
  28. Pal, S., Harmsen, S., Oseledchyk, A., Hsu, H. T., Kircher, M. F. MUC1 Aptamer Targeted SERS Nanoprobes. Advanced Functional Materials. 27 (32), (2017).
  29. Zanganeh, S., et al. Iron oxide nanoparticles inhibit tumour growth by inducing pro-inflammatory macrophage polarization in tumour tissues. Nat Nanotechnol. 11 (11), 986-994 (2016).
  30. Lee, J., Lee, Y. M., Kim, J., Kim, W. J. Doxorubicin/Ce6-Loaded Nanoparticle Coated with Polymer via Singlet Oxygen-Sensitive Linker for Photodynamically Assisted Chemotherapy. Nanotheranostics. 1 (2), 196-207 (2017).
  31. Li, R., Zheng, K., Yuan, C., Chen, Z., Huang, M. Be Active or Not: the Relative Contribution of Active and Passive Tumor Targeting of Nanomaterials. Nanotheranostics. 1 (4), 346-357 (2017).
  32. Lin, S. Y., Huang, R. Y., Liao, W. C., Chuang, C. C., Chang, C. W. Multifunctional PEGylated Albumin/IR780/Iron Oxide Nanocomplexes for Cancer Photothermal Therapy and MR Imaging. Nanotheranostics. 2 (2), 106-116 (2018).
  33. Roberts, S., et al. Sonophore-enhanced nanoemulsions for optoacoustic imaging of cancer. Chemical Science (Royal Society of Chemistry: 2010). 9 (25), 5646-5657 (2018).
  34. Liu, L., Ruan, Z., Yuan, P., Li, T., Yan, L. Oxygen Self-Sufficient Amphiphilic Polypeptide Nanoparticles Encapsulating BODIPY for Potential Near Infrared Imaging-guided Photodynamic Therapy at Low Energy. Nanotheranostics. 2 (1), 59-69 (2018).
  35. Liu, R., Tang, J., Xu, Y., Zhou, Y., Dai, Z. Nano-sized Indocyanine Green J-aggregate as a One-component Theranostic Agent. Nanotheranostics. 1 (4), 430-439 (2017).
  36. Sneider, A., VanDyke, D., Paliwal, S., Rai, P. Remotely Triggered Nano-Theranostics For Cancer Applications. Nanotheranostics. 1 (1), 1-22 (2017).
  37. Wall, M. A., et al. Surfactant-Free Shape Control of Gold Nanoparticles Enabled by Unified Theoretical Framework of Nanocrystal Synthesis. Advanced Materials. 29 (21), (2017).
  38. Sonali,, et al. Nanotheranostics: Emerging Strategies for Early Diagnosis and Therapy of Brain Cancer. Nanotheranostics. 2 (1), 70-86 (2018).

Tags

Cancerforskning fråga 145 Raman SERS nanopartiklar molekylär imaging äggstockscancer folat receptor ratiometry
Surface-förbättrade resonans Raman spridning Nanoprobe Ratiometry för att upptäcka mikroskopisk äggstockscancer via folat Receptor inriktning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Andreou, C., Oseledchyk, A.,… More

Andreou, C., Oseledchyk, A., Nicolson, F., Berisha, N., Pal, S., Kircher, M. F. Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting. J. Vis. Exp. (145), e58389, doi:10.3791/58389 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter