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Cancer Research

सतह से बढ़ी अनुनाद रमन प्रकीर्णन फोलेट रिसेप्टर लक्ष्यीकरण के माध्यम से सूक्ष्म ओवेरियन कैंसर का पता लगाने के लिए नैनोप्रोब रतिमिति

Published: March 25, 2019 doi: 10.3791/58389
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3,4,5,6,7
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Department of Chemistry, The Graduate Center of the City University of New York, 3Molecular Pharmacology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT), Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 5Gerstner Sloan Kettering Graduate School of Biomedical Sciences, 6Department of Radiology, Weill Cornell Medical College of Cornell University, 7Dana-Farber Cancer Institute and Harvard Medical Center

Summary

डिम्बग्रंथि कैंसर पेरिटोनेयल गुहा में मेटास्टेसिस रूपों । यहां, हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान बनाने और उपयोग करने के लिए फोलेट-रिसेप्टर लक्षित सतह-संवर्धित अनुनाद रमन प्रकीर्णन nanoprobes कि ratiometric इमेजिंग के माध्यम से उच्च विशिष्टता के साथ इन घावों को प्रकट करते हैं । nanoprobes के चूहों के रहने के लिए intraperitoneally प्रशासित रहे हैं, और व्युत्पन्न चित्र ऊतक विज्ञान के साथ अच्छी तरह से संबद्ध.

Abstract

डिम्बग्रंथि कैंसर घातक स्त्रीरोगों द्रोह का प्रतिनिधित्व करता है । एक उंनत चरण (FIGO स्टेज III या IV) में मौजूद अधिकांश रोगी, जब स्थानीय मेटास्टेटिक स्प्रेड पहले ही आ चुका है । हालांकि, डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेटिक प्रसार का एक अनूठा पैटर्न है, कि ट्यूमर प्रत्यारोपण शुरू में पेरिटोनिअल गुहा के भीतर निहित हैं । यह सुविधा, सिद्धांत रूप में, उपचारात्मक मंशा के साथ ट्यूमर प्रत्यारोपण की पूरी लकीर सक्षम कर सकता है । इन मेटास्टेटिक घावों के कई सूक्ष्म हैं, उन्हें पहचानने और इलाज करने के लिए मुश्किल बना रही है । ऐसे micrometastases को निष्क्रिय ट्यूमर पुनरावृत्ति को नष्ट करने और दीर्घकालिक अस्तित्व को प्राप्त करने की दिशा में एक प्रमुख लक्ष्य माना जा रहा है । रमन इमेजिंग के साथ भूतल बढ़ाया अनुनाद रमन कैटरिंग nanoprobes उच्च संवेदनशीलता के साथ सूक्ष्म ट्यूमर चित्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, उनके उज्ज्वल और bioorthogonal स्पेक्ट्रल हस्ताक्षर के कारण. यहां, हम इस तरह के nanoprobes के दो ' जायके के संश्लेषण का वर्णन: एक एंटीबॉडी-एक functionalized कि लक्ष्य फोलेट रिसेप्टर-कई डिम्बग्रंथि के कैंसर में overexpressed-और एक गैर लक्षित नियंत्रण नैनोप्रोब, विशिष्ट स्पेक्ट्रा के साथ । नैनोप्रोब्स मेटास्टेटिक मानव डिम्बग्रंथि एडीनोकार्सिनोमा के माउस मॉडलों के लिए intraperitoneally सह प्रशासित रहे हैं । सभी पशु अध्ययन संस्थागत पशु देखभाल और स्मारक Sloan केटरिंग कैंसर केंद्र के उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । जानवरों के पेरिटोनेयल गुहा शल्य चिकित्सा, धुल, और एक रमन माइक्रोफोटोस्पेक्ट्रोमीटर के साथ स्कैन की गई है । बाद में, दो nanoprobes के रमन हस्ताक्षर एक शास्त्रीय ंयूनतम वर्गों फिटिंग एल्गोरिथ्म का उपयोग decoupled हैं, और उनके संबंधित स्कोर को फोलेट की एक रातिमितीय संकेत प्रदान करने के लिए विभाजित-अलक्षित जांच पर लक्षित । इस तरह, माइक्रोस्कोपिक मेटास्टेसिस उच्च विशिष्टता के साथ कल्पना हैं । इस दृष्टिकोण का मुख्य लाभ यह है कि पेरिटोनियल गुहा में स्थानीय आवेदन-जो आसानी से शल्य प्रक्रिया के दौरान किया जा सकता है-प्रणालीगत nanoparticle जोखिम के लिए रोगी subjecting बिना ट्यूमर टैग कर सकते हैं । गलत सकारात्मक संकेत गैर से stemming-आंत सतहों पर nanoprobes के विशिष्ट बाध्यकारी एक रतिमितीय दृष्टिकोण है जहां लक्षित और गैर विशिष्ट रमन हस्ताक्षर के साथ nanoprobes लक्षित एक मिश्रण के रूप में लागू कर रहे है निंनलिखित द्वारा समाप्त किया जा सकता है । प्रक्रिया वर्तमान में अभी भी एक वाणिज्यिक व्यापक क्षेत्र रमन इमेजिंग कैमरा प्रणाली है, जो एक बार उपलब्ध ऑपरेटिंग थियेटर में इस तकनीक के आवेदन के लिए अनुमति देगा की कमी से सीमित है ।

Introduction

रमन इमेजिंग विथ ' सरफेस एंहांस्ड रमन कैटरिंग ' (SERS) नैनोकणों ने विभिन्न प्रकार की सेटिंग्स में घावों को delineating में बहुत बड़ा वादा दिखाया है और कई विभिन्न ट्यूमर प्रकारों के लिए1,2,3,4 . SERS नैनोकणों का मुख्य लाभ उनके फिंगरप्रिंट-वर्णकीय हस्ताक्षर की तरह है, उंहें असंदिग्ध पता है कि जैविक पृष्ठभूमि5संकेतों द्वारा नहीं किया है affording । इसके अतिरिक्त, उत्सर्जित संकेत की तीव्रता आगे उत्तेजन लेजर के साथ लाइन में अवशोषण maxima के साथ रिपोर्टर अणुओं (रंजक) के उपयोग के साथ परिलक्षित होता है, ' सतह बढ़ाया अनुनाद रमन बिखरने ' (serrs) को जंम दे रही है नैनोकणों के साथ भी अधिक से अधिक संवेदनशीलता6,7,8,9,10,11,12.

एक बाधा है कि एसई के गोद लेने के लिए संबोधित किया जा करने की जरूरत है (नि.) रुपये नैनोकणों13 और कई अन्य नैनोलेख constructs14,15 नैदानिक उपयोग के लिए प्रशासन की उनकी विधा है, के रूप में अंतःशिरा इंजेक्शन प्रणालीगत कारण एजेंट के जोखिम, और व्यापक परीक्षण संभावित प्रतिकूल प्रभाव को बाहर करने के लिए आवश्यक है । इस अनुच्छेद में, हम एक अलग प्रतिमान वर्तमान में vivo मेंस्थानीय नैनोकणों के आवेदन के आधार पर, शल्य चिकित्सा के दौरान पेरिटोनियल गुहा में सीधे, एक धोने कदम के बाद किसी भी असीम नैनोकणों1को दूर करने के लिए । इस दृष्टिकोण उपंयास चिकित्सीय दृष्टिकोण है कि वर्तमान में जांच के तहत कर रहे है कि यह भी पेरिटोनेयल गुहा में एजेंटों के स्थानीय टपकाना का उपयोग करने के साथ लाइन में है, hyperthermic intraperitoneal कीमोथेरेपी (hipec) कहा जाता है । इस प्रकार, सिद्धांत ही अपेक्षाकृत एक नैदानिक कार्यप्रवाह में एकीकृत करने के लिए आसान होना चाहिए । हम intraperitoneal आवेदन के बाद नैनोकणों के जैव वितरण का अध्ययन किया है, और प्रणालीगत परिसंचरण1में किसी भी detectable अवशोषण नहीं देखा है । इसके अतिरिक्त, स्थानीय अनुप्रयोग दृष्टिकोण के लिए एक प्रकार का पदार्थ है, तो आवश्यक नैनोकणों की संख्या बहुत कम कर रहे हैं, तो नैनोकणों की ज़ब्ती circumvents । हालांकि, जब topically लागू, एंटीबॉडी functionalized नैनोकणों अपने लक्ष्य के अभाव में भी आंत सतहों पर पालन करते हैं । आदेश में गैर विशिष्ट nanoparticle आसंजन के कारण झूठी सकारात्मक संकेतों को कम करने के लिए, हम एक रतिमितीय दृष्टिकोण है, जहां एक लौह लक्षित nanoparticle विशिष्ट संकेत प्रदान करता है पीछा, और एक गैर लक्षित नियंत्रण nanoparticle, अलग रमन स्पेक्ट्रम के साथ, गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि16,17के लिए खाते । हम topically लागू सतह बढ़ाया अनुनाद रमन ratiometric स्पेक्ट्रोस्कोपी की इस पद्धति का प्रदर्शन हाल ही में फैलाना ओवेरियन कैंसर1के एक माउस मॉडल में है ।

इस विधि के समग्र लक्ष्य के लिए दो serrs nanoprobes, एक लक्षित और एक गैर विशिष्ट, विकसित करने के लिए माउस मॉडल में स्थानीय रूप से लागू किया जाना है, ताकि छवि के लिए एक कैंसर से संबंधित बायोमार्कर का प्रयोग/ वाया रमण इमेजिंग. इस काम में, फोलेट रिसेप्टर (FR) लक्ष्य के रूप में चुना गया था, क्योंकि यह एक मार्कर कई डिम्बग्रंथि कैंसर18,19में upregulated है । SERS-आधारित नैनोकणों के साथ रमन माइक्रोइमेजिंग को भी कैंसर कोशिका पहचान20के लिए प्रदर्शित किया गया है । रमन नैनोकणों के दो अलग "जायके" संश्लेषित कर रहे हैं, प्रत्येक एक अलग कार्बनिक डाई से अपने फिंगरप्रिंट संस्थाओ । नैनोकणों एक सितारा के आकार का सोने के एक सिलिका खोल से घिरा हुआ कोर से मिलकर बनता है और लगभग ७१० एनएम पर सतह plasmon अनुनाद का प्रदर्शन । रमन रिपोर्टर (ऑर्गेनिक डाई) सिलिका शेल के गठन के साथ समवर्ती जमा है. अंत में, FR-लक्षित nanoprobes (α एफआर-एनपीएस) के लिए सिलिका शेल एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित है, जबकि गैर-लक्षित नैनोप्रोब्स (एनटी-एनपीएस) पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) के मोनोलेयर के साथ पाससिटेड हैं ।

इस तकनीक को सफलतापूर्वक फैलाना मेटास्टेटिक ओवेरियन कैंसर (SKOV-3) के एक माउस xenograft मॉडल में सूक्ष्म ट्यूमर नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, vivo उपयोग में इसके प्रयोज्यता का प्रदर्शन । यह भी excised ऊतकों में उपयोग के लिए बढ़ाया जा सकता है, ट्यूमर phenotyping, या मार्जिन दृढ़ संकल्प के बाद के रूप में एक सजाना अध्ययन21में दिखाया गया है ।

SERRS nanoprobes biomarkers के लिए कई लक्षित टैग के निर्माण के लिए एक मजबूत मंच प्रदान करते हैं, सरल रासायनिक प्रतिक्रियाओं के साथ संश्लेषित के रूप में रेखांकित चित्र 1में योजनाबद्ध । यहां, हम SERRS nanoprobes के दो प्रकार के संश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल वर्तमान (अनुभाग 1-3), एक उपयुक्त डिम्बग्रंथि कैंसर माउस मॉडल (धारा 4), nanoprobes और इमेजिंग के प्रशासन (धारा 5) के विकास, और अंत में डेटा विश्लेषण और विज़ुअलाइज़ेशन (अनुभाग 6) ।

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Protocol

सभी पशु अध्ययन संस्थागत पशु देखभाल और स्मारक Sloan Kettering कैंसर केंद्र (#06-07-011) के उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. गोल्ड नैनोस्टार कोर संश्लेषण

नोट: गोल्ड nanostars इस प्रयोग में इस्तेमाल किया SERRS nanostars के दोनों जायके के लिए कोर के रूप में उपयोग किया जाता है ।

  1. विआयनीकृत में ६० मिमी ascorbic एसिड की ८०० मिलीलीटर (सी6एच8ओ6) समाधान तैयार (डि) पानी और 8 मिलीलीटर 20 मिमी tetrachloroauric एसिड (haucl4) समाधान DI पानी में. 4 ° c करने के लिए शांत ।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर इस प्रतिक्रिया कदम प्रदर्शन करते हैं । एक शंकु कुप्पी एक चुंबकीय हलचल प्लेट पर ascorbic एसिड समाधान के ८०० मिलीलीटर युक्त और एक स्थिर भंवर प्रेरित प्लेस । जल्दी से भंवर में tetrachloroauric एसिड समाधान के 8 मिलीलीटर जोड़ें । सेकंड के भीतर, nanostars फार्म का होगा और समाधान एक गहरे नीले रंग ग्रहण करेंगे । मामले में किसी भी समय रंग गुलाबी या बैंगनी हो जाता है, nanospheres के गठन वाचक, निलंबन खारिज कर दिया जाना चाहिए और संश्लेषण पुनः प्रयास किया ।
  3. ५० मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में nanostar निलंबन डालो, और 20 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस, ३,२२० एक्स जी) के लिए सेंट्रीफ्यूज । महाप्राण प्रत्येक ट्यूब में समाधान के लगभग २०० μL छोड़ने supernatant । भुगतान चेतावनी ट्यूब के तल पर नैनोकणों के गोली परेशान करने के लिए नहीं ।
    नोट: सुपरनैटंट को शेष निलंबित नैनोस्टार्स की वजह से ब्लू टिंट चाहिए ।
  4. एक micropipette का उपयोग करना, निलंबित और प्रत्येक ट्यूब से नैनोकणों इकट्ठा करने के लिए समाधान आंदोलन । गोली का हिस्सा ट्यूब के तल पर जमा हो सकता है और जोरदार पिख्ता के साथ भी resuspend नहीं होगा-इस भाग को छोड़ दें ।
  5. एक डायलिसिस कैसेट (MWCO ३.५ केडीए) के लिए nanoparticle निलंबन स्थानांतरण और DI पानी के 2 एल के खिलाफ कम से कम तीन दिनों dialyze, दैनिक पानी बदल रहा है । 4 डिग्री सेल्सियस पर डायलिसिस में एक महीने के लिए पानी के साथ हर 3-4 दिनों के लिए nanostars स्टोर ।
    नोट: nanostars डायलिसिस में रखा जाना चाहिए जब तक सिलिकेशन प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है, के रूप में धारा 2 में वर्णित है ।

2. सिलिका शैल का गठन

नोट: रमन nanoprobes के दो जायके संश्लेषित कर रहे हैं । संश्लेषण प्रक्रिया दोनों के लिए ही है, केवल अंतर रमन रिपोर्टर अणु जा रहा है (डाई) के साथ प्रयोग किया जाता है । इस प्रयोग में IR780 परक्लोरेट और IR140 का प्रयोग किया जाता है । प्रतिक्रिया हमेशा प्लास्टिक के कंटेनर में किया जाना चाहिए । संश्लेषण अत्यधिक स्केलेशनीय है और आवश्यक इंजेक्शन की वांछित राशि के लिए समायोजित किया जा सकता है । यहाँ, एक मध्यम बैच संश्लेषण वर्णित है, जो एक ही सांद्रता और प्रतिक्रिया समय के साथ जरूरत के रूप में कम या अधिक मात्रा के लिए linearly बढ़ाया जा सकता है. दो SERRS नैनोप्रोब प्रकार के लिए प्रतिक्रियाओं समानांतर में किया जा सकता है । क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए ध्यान देना । Sonication धोने कदम, या के बाद नैनोकणों एक घंटे से अधिक समय के लिए संग्रहीत किया गया के बाद नैनोपलेख छर्रों के पुनर्फैलाव के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए । Sonication किया जाना चाहिए जब तक नैनोकणों स्पष्ट रूप से समाधान में निलंबित कर रहे हैं, आमतौर पर के लिए 1 एस.

  1. ट्यूब में एक (एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब), 10 मिलीलीटर आइसोप्रोपानोल, TEOS के ५०० μL, DI पानी की २०० μL, और डाई के ६० μL (IR780 परक्लोरेट या IR140, DMF में 20 मिमी (dimethylformamide)).
  2. ट्यूब बी (15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब) में, इथेनॉल के 3 मिलीलीटर और अमोनियम हीड्राक्साइड के २०० μL मिश्रण । समाधान में किसी भी क्लस्टर फैलाने और ट्यूब के लिए nanostars के १.२ मिलीलीटर जोड़ने के लिए कदम १.४ से nanostars Sonicate ।
    नोट: अमोनियम हीड्राक्साइड समाधान अत्यधिक अस्थिर और सही ढंग से पिपेट करने के लिए मुश्किल है । यह 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, जब तक की जरूरत है, के लिए पाइपलाइन की सुविधा ।
  3. जगह एक भंवर मिक्सर पर एक ट्यूब और एक स्थिर भंवर प्रेरित । तेजी से भंवर में ट्यूब बी की सामग्री जोड़ने और के बारे में 5 एस के लिए मिश्रण रखने के तुरंत एक शेखर को हस्तांतरण और 15 मिनट के लिए प्रतिक्रिया करते हुए ३०० rpm पर मिलाते हुए, कमरे के तापमान पर ।
  4. 15 मिनट ऊष्मायन के बाद, ५० मिलीलीटर ट्यूब को भरने के लिए इथेनॉल जोड़कर प्रतिक्रिया बुझाने । ३,२२० x g और 4 ° c पर 20 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज ।
  5. supernatant महाप्राण, समाधान के बारे में ०.५ मिलीलीटर जा रहा है, गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है । इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक पिपेट के साथ आंदोलन नैनोकणों resuspend करने के लिए । एक १.५ मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए स्थानांतरण और 4 मिनट के लिए ११,००० एक्स जी पर केंद्रापसारक द्वारा इथेनॉल के साथ 4 बार धोने, supernatant aspirating, और लगभग 1 एस के लिए ultrasonication से गोली resuspending ।
    नोट: इस स्तर पर, सिलिकेटित नैनोकणों functionalized जा सकता है, के रूप में धारा 3 में वर्णित है, या एक अतिरिक्त धोने कदम के साथ DI पानी में सस्पेंड, भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह के लिए ।

3. भूतल Functionalization

नोट: IR780 SERRS nanoprobes फोलेट रिसेप्टर के साथ संयुग्मित किया जाएगा-एक खूंटी crosslinker के माध्यम से एंटीबॉडी को लक्षित करने के लिए α एफआर-एनपीएस; IR140 SERRS नियंत्रण nanoprobes एक passivating खूंटी monolayer, nt-एनपीएस के लिए के साथ संयुग्मित किया जाएगा । दोनों जायके एक thiol-अलग लेकिन समानांतर प्रतिक्रियाओं में maleimide प्रतिक्रिया के माध्यम से गठित कर रहे हैं ।

  1. नैनोकणों धो 4 मिनट के लिए ११,००० x g पर अपकेंद्रण द्वारा दो बार, supernatant aspirating, और ultrasonication द्वारा इथेनॉल के 1 मिलीलीटर में गोली resuspending । एक बार फिर धोने के कदम को दोहराएं, लेकिन ८५% इथेनॉल, 10% 3-MPTMS (3-mercaptopropyltrimethoxysilane), और 5% DI पानी की 1 मिलीलीटर में फिर से बिखरने । कण की सतह पर thiols पेश करने के लिए 1-2 ज के लिए कमरे के तापमान पर सेते ।
  2. 4 मिनट के लिए ११,००० x g पर अपकेंद्रण द्वारा thiol-functionalized नैनोकणों धो, supernatant aspirating और ultrasonication द्वारा गोली resuspending, दो बार इथेनॉल में, DI में दो बार, और अंत में hepes में (4-(2-hydroxyethyl)-1- (10 मिमी, पीएच ७.१) बफर, और एक तरफ सेट करें....
    नोट: एमईएस (2-(N-morpholino) ethanesulfonic एसिड) बफर या hepes इस्तेमाल किया जाना चाहिए । PBS (फॉस्फेट-buffered खारा) के रूप में उच्च लवणता के साथ बफ़र्स, nanoparticle एकत्रीकरण प्रेरित कर सकते हैं ।
  3. एंटीबॉडी functionalized-एनपीएस के लिए, प्रतिक्रिया २०० μg एंटीबॉडी (विरोधी फोलेट बाइंडिंग प्रोटीन एंटीबॉडी क्लोन [LK26]) के साथ दस गुना दाढ़ अतिरिक्त खूंटी crosslinker (पाली (एथिलीन glycol) (n-hydroxysuccinimide 5-pentanoate) ईथर एन ′-(3- मलेइमिडोप्रॉपियोनिल) एमिनोएथेन (CAS: 851040-94-3), में डाइमेथिल सल्फोक्साइड (DMSO)) में ५०० μL में MES बफर (10 मिमी, पीएच ७.१) 30 मिनट के लिए ।
  4. अतिरिक्त crosslinker निकालें और एक केंद्रापसारक फिल्टर (MWCO १०० केडीए) में एंटीबॉडी-खूंटी समाधान केंद्रापसारक द्वारा एंटीबॉडी ध्यान केंद्रित । इस अध्ययन में इस्तेमाल किया केंद्रापसारक फिल्टर के लिए, १४,००० एक्स जी और 23 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक प्रदर्शन । फिल्टर और 2 मिनट के लिए १,००० x जी पर अपकेंद्रण द्वारा एक ताजा ट्यूब में संयुग्मित एंटीबॉडी पुनर्प्राप्त करें ।
  5. IR780 नानोकणों से ट्यूब में एंटीबॉडी के साथ कदम ३.२ और पिपेट मिश्रण करने के साथ आंदोलन । मिश्रण को न्यूनतम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर, या, वैकल्पिक रूप से 4 ° c पर α एफआर-एनपीएस बनाने के लिए सेते हैं ।
  6. करने के लिए nt-NPs, जोड़ें 1% w/v methoxy-समाप्त (m) PEG5000-maleimide (CAS: 99126-64-4) चरण ३.२ से IR140 SERRS नैनोकणों के लिए DMSO में भंग और में प्रतिक्रिया दें ५०० μL एमईएस बफर (10 मिमी, पीएच ७.१) कमरे के तापमान, या, वैकल्पिक रूप से 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर.
  7. प्रशासन के लिए चूहों के लिए (धारा 5), 4 मिनट के लिए ११,००० x g पर दोनों nanoprobe जायके नीचे स्पिन, supernatant मुक्त unreacted एंटीबॉडी के साथ समाधान निकालने के लिए महाप्राण/खूंटी, और एमईएस बफर में प्रत्येक स्वाद reबिखरने (10 मिमी, पीएच ७.१) पर ६०० बजे एकाग्रता . जब पुनः लंबित नैनोकणों, अल्ट्रासाउंड के लिए अनावश्यक जोखिम को कम करने के लिए, एंटीबॉडी के विकृतिकरण को रोकने के लिए ।

4. माउस मॉडल विकास

  1. मानव डिम्बग्रंथि ग्रंथिकर्कटता (skov-3) सेल लाइन की एक स्थिर संस्कृति की स्थापना । वैकल्पिक रूप से, bioluminescence/प्रतिदीप्ति के माध्यम से निगरानी सक्षम करने के लिए, transfected SKOV-3 का उपयोग करें+/Gfp+ कोशिकाओं । RPMI में संस्कृति कोशिकाओं (Roswell पार्क मेमोरियल संस्थान) 10% भ्रूण बछड़ा सीरम और पारित होने के साथ मध्यम दो बार एक सप्ताह । इंजेक्शन के लिए, ०.२५% trypsin के साथ सेते कोशिकाओं/0.05% EDTA को अलग करने के लिए 3 मिनट के लिए, और बाद में धोने और PBS में 2 x 106 कोशिकाओं/100 μl पर पुन;
  2. डिम्बग्रंथि माइक्रोमेस्टेसिस मॉडल स्थापित करने के लिए, २०० μL निलंबित SKOV-3 कोशिकाओं intraperitoneally athymic मादा चूहों में इंजेक्शन (FOXn1nu/FOXn1nu चूहों, 6-8 सप्ताह पुरानी). प्रसार पेरिटोनियल प्रसार लगभग 4 हफ्तों में हो जाएगा । यदि SKOV-3 Luc+ कोशिकाओं का उपयोग कर, ट्यूमर के विकास के साथ निगरानी की जा सकती bioluminescence के प्रशासन द्वारा 2 बीटल लूसिफेरिं के ५० ΜL pbs के माध्यम से रिकऑर्बिटर इंजेक्शन ।

5. नैनोप्रोब इंजेक्शन और इमेजिंग

  1. nanoprobes (α Fr-NPs और nt-NPs) के रूप में खंड 1-3 में वर्णित और मिक्स एक 1:1 अनुपात में, एमईएस बफर (10 मिमी, पीएच ७.१) में प्रत्येक प्रकार के ३०० pM की एक अंतिम एकाग्रता के लिए तैयार करें । वैकल्पिक रूप से, छोटे (१०० μL) शंक्वाकार ट्यूबों में नैनोप्रोब जायके में से प्रत्येक के 30 बजे के संदर्भ मानकों को तैयार ।
  2. intraperitoneally प्रत्येक माउस में nanoparticle निलंबन के 1 मिलीलीटर सुई और धीरे पेट मालिश पेरिटोनियल गुहा के भीतर नैनोकणों वितरित करने के लिए । अपने आवास के लिए माउस वापस लौटें । 25 या अधिक मिनट के बाद, सह2 asphyxiation के माध्यम से माउस euthanize ।
  3. एक शल्य मंच पर माउस जकड़ना, लापरवाह स्थिति में (पूरे पेट इमेजिंग के लिए, मंच को ईमानदार माइक्रोस्कोप मंच पर mountable की जरूरत है) ।
    1. दांतेदार संदंश और विच्छेदन कैंची का प्रयोग, पेरिटोनियम को बेनकाब करने के लिए त्वचा को हटाने और पूरे पेट को बेनकाब करने के लिए (लंबाई में 2 और 3 सेमी के बीच) एक बड़े सममीतल चीरा प्रदर्शन । मंच पर पेरिटोनियल फ्लैप संलग्न करें । एक प्लास्टिक की बोतल का उपयोग कर pbs के कम से ६० मिलीलीटर के साथ पेरिटोनियल गुहा के अंदर धो लें ।
      नोट: पूरे पेट की अबाधित इमेजिंग को सक्षम करने के लिए, आंतों को जुटाया या उत्तेजित करने की जरूरत है । उच्छेदन के लिए, उदर गुहा में नकसीर को कम करने के लिए mesenteric जहाजों के एक बंधाव के साथ काटना ।
    2. वैकल्पिक रूप से, विशिष्ट अंगों की छवि के लिए, उन्हें PBS धोने के बाद एक्साइज, और उन्हें माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें ।
  4. सीधा ऑप्टिकल विन्यास और इमेजिंग के लिए एक मोटरीकृत चरण के साथ एक रमन माइक्रोस्पेक्ट्रोफोटोमीटर के लिए मंच या स्लाइड स्थानांतरण; एक ३०० मेगावाट ७८५ एनएम डायोड लेजर के साथ एक वाणिज्यिक प्रणाली का प्रयोग करें, प्रति मिमी १,२०० खांचे की कसा के साथ, १,११५ सेमी-1पर केंद्रित है ।
    1. रमन लेजर के साथ सफेद प्रकाश प्रकाशिकी, पैराफोकल का उपयोग कर ब्याज के क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित । imaged और इच्छित रिज़ॉल्यूशन के लिए क्षेत्र का चयन करें; इस रिपोर्ट में एक उच्च गति अधिग्रहण मोड का उपयोग किया गया था (स्पेक्ट्रा सतत लेजर रोशनी के तहत माइक्रोस्कोप के साथ लगातार बढ़ रहा है, प्रभावी स्थानिक संकल्प के साथ १४.२ μm द्वारा २०० μm; 5x आवर्धन, १०० मेगावाट बिजली पर उद्देश्य, और < १०० प्रति बिंदु एमएस एक्सपोजर) ।
      नोट: कदम ५.१ से संदर्भ nanoprobes के साथ ट्यूबों imaged क्षेत्र के भीतर रखा जा सकता है अगर वांछित, बाद के विश्लेषण के लिए आंतरिक संदर्भ मानकों को प्रदान करने के लिए । सुनिश्चित करें कि लेजर के अलावा कोई बाहरी प्रकाश स्रोत उद्देश्य तक पहुंचें ।
  5. वैकल्पिक रूप से, 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात pbs में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में निर्धारण द्वारा ऊतकीय प्रसंस्करण और सत्यापन के लिए नमूना तैयार करते हैं । 4 डिग्री सेल्सियस पर PBS के साथ कुल्ला 15 मिनट के लिए कम से दो बार । मानक ऊतकीय प्रसंस्करण और पैराफिन embedding जब तक पानी में ७०% इथेनॉल में नमूना रखें । ट्यूमर के ऊतकीय सत्यापन के लिए, पैराफिन ब्लॉक के विभिन्न गहराई से वर्गों (5 μm मोटी) hematoxylin और eosin (एच & ई) के साथ दाग हो सकता है ।

6. डाटा प्रोसेसिंग और विज़ुअलाइज़ेशन

नोट: सभी डेटा प्रोसेसिंग एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस के साथ किया गया में घर विकसित, वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर । प्रयुक्त कार्यों के सभी सामांय समकक्ष अंय कंप्यूटिंग वातावरण में उपलब्ध है ।

  1. प्रत्येक के शुद्ध निलंबन से पूछताछ करके दो जायके के लिए संदर्भ स्पेक्ट्रा प्राप्त करें । संदर्भ स्पेक्ट्रा nanoprobes के बिंदु स्कैन से व्युत्पंन किया जा सकता है, अच्छी तरह से प्लेटों में nanoprobes की इमेजिंग, या संदर्भ ट्यूबों में प्रयोगात्मक स्कैन में आंतरिक संदर्भों को शामिल करके (चरण ५.१ देखें).
  2. Preprocess संदर्भ स्पेक्ट्रा, आधारभूत घटाव का उपयोग करके (Whittaker फिल्टर, λ = २००), वक्र के तहत क्षेत्र द्वारा सामान्यीकरण, और Savitzky-गोलय व्युत्पन्न फिल्टर (द्वितीय डिग्री बहुपद फिट, प्रथम आदेश व्युत्पंन, चौड़ाई = 15 कदम). ये पूर्वसंसाधित स्पेक्ट्रा शास्त्रीय ंयूनतम वर्गों (CLS) मॉडल के लिए संदर्भ के रूप में काम करेंगे ।
  3. संदर्भ स्पेक्ट्रा के रूप में एक ही रास्ते में छवि से नमूना डेटा Preprocess. एक उपलब्ध CLS एल्गोरिथ्म का उपयोग करके प्रत्येक नमूना बिंदु के लिए CLS स्कोर प्राप्त करें । प्रत्यक्ष CLS (DCLS) के स्कोर बस रेखीय सामांयीकृत व्युत्क्रम मैट्रिक्स द्वारा परिभाषित अंतरिक्ष पर एक नमूना स्पेक्ट्रम के प्रक्षेपण के निर्देशांक (मूर-Penrose व्युत्क्रम) के संदर्भ स्पेक्ट्रा । अंय फिटिंग एल्गोरिदम (गैर नकारात्मक ंयूनतम वर्गों, आंशिक रूप से कम वर्ग, या दूसरों) इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    नोट: कुछ फिटिंग एल्गोरिदम नकारात्मक स्कोर को जंम दे सकते हैं, जो इस संदर्भ में भौतिक नहीं हैं । यदि यह स्थिति है, तो एक थ्रेशोल्ड ऋणात्मक स्कोर को छोड़ने के लिए सेट किया जा सकता है, या किसी अवरोधित गैर-ऋणात्मक कम वर्ग एल्गोरिथ्म के स्थान पर नियोजित किया जा ।
  4. गैर-लक्षित नैनोकणों (स्कोरnt) के लिए संदर्भ पर स्कोर पर लक्षित नैनोकणों (स्कोरα एफआर) के लिए संदर्भ पर स्कोर के बिंदुवार अनुपात की गणना करें । यदि स्कोर गैर नकारात्मक हैं, अनुपात एक लघुगणकीय फैशन में व्यक्त किया जा सकता है:
    R = log10(स्कोरα fr/
    अनुपात आर सबसे अच्छा एक अपसारी रंग शूंय पर केंद्रित पैमाने में प्रदर्शित किया जाता है, परिमाण के आदेश में जांच के सापेक्ष बहुतायत व्यक्त करते हैं । परिणामी छवि नमूने की सफेद प्रकाश छवि पर मढ़ा जा सकता है, फोलेट रिसेप्टर मढ़ा के क्षेत्रों को प्रकट करने के लिए ।

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Representative Results

गुणवत्ता नियंत्रण प्रयोजनों के लिए, नैनोकणों संश्लेषण की प्रक्रिया के दौरान तरीकों की एक किस्म का उपयोग कर विशेषता हो सकता है, सहित, TEM, DLS, नैनोलेख ट्रैकिंग विश्लेषण, और यूवी/

इस तरह, सोने nanostar कोर के आकार (1 खंड में वर्णित), सिलिका शैल के गठन (खंड 2) और बाद में सतह functionalization (खंड 3) सत्यापित किया जा सकता है (चित्रा 2) । आमतौर पर, सोने nanostar कोर के आकार (hydrodynamic व्यास) के आसपास ८० एनएम होने की उंमीद है, और सिलिका शैल लगभग 20 एनएम मोटी है, कुल सिलिकेटित नैनोलेख आकार के आसपास १२० एनएम और लगभग १४० एनएम के साथ संयुग्मन के बाद बना रहे हैंएफआर-एंटीबॉडी । यूवी/इस अवशोषण भी नैनोकणों की आकृति विज्ञान की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । Nanostar कोर पानी में आम तौर पर ६७० एनएम पर एक अवशोषण अधिकतम है, जबकि सिलिकेशन के बाद लगभग ७१० एनएम के लिए अधिकतम बदलाव । कम तरंगदैर्ध्य पर अवशोषण maxima या तो गोलाकार आकृति विज्ञान या एकत्रीकरण का संकेत कर रहे हैं । ठेठ प्रतिक्रिया पैदावार और सांद्रता तालिका 1 में दिखाया गया है और धोने के चरणों के दौरान तकनीक pipetting पर दृढ़ता से निर्भर करते हैं ।

रमन स्कैन से प्राप्त प्रत्येक बिंदु एक पूछताछ स्थान के लिए एक स्पेक्ट्रम शामिल हैं. इन स्पेक्ट्रा nanoprobes के serrs संकेत और किसी भी पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की एक रैखिक अध्यारोपण हैं । स्पेक्ट्रा प्रतिदीप्ति हटाने और इकाई क्षेत्र के लिए सामांयीकृत संकेत शक्ति के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए संसाधित किया जा सकता है, CLS मॉडल लागू करने से पहले (धारा 6 में वर्णित), के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है । प्रत्येक नैनोप्रोब संदर्भ स्पेक्ट्रा पर अंक के लिए प्रतिनिधि बिंब और उनका बिंदुवार अनुपात चित्र 4में दर्शाया गया है । हालांकि प्रत्येक स्कोर व्यक्तिगत ट्यूमर का विशिष्ट स्थानीयकरण प्रदान नहीं करता है, अनुपात फैलाया हुआ सूक्ष्म प्रसार की उपस्थिति का पता चलता है ।

चरण आरंभिक आयतन प्रारंभिक सांद्रण अंतिम आयतन अंतिम सांद्रता
1. नैनोस्टार कोर 8 मिलीलीटर HAuCl4 20 मिमी HAuCl4 5 मिलीलीटर १.३ एनएम
2. सिलिकेशन १.२ मिलीलीटर १.३ एनएम १.२ मिलीलीटर ०.५ एनएम
३.१. थायोलेशन 1 मिलीलीटर ०.५ एनएम 1 मिलीलीटर ०.४३ एनएम
३.५. संयुग्मन 1 मिलीलीटर ०.४३ एनएम 1 मिलीलीटर ०.३९ एनएम

तालिका 1: Nanoparticle उपज प्रत्येक प्रतिक्रिया कदम के बाद । सांद्रता लगभग है । उपज nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था, दो स्वतंत्र syntheses और प्रत्येक से 5 स्वतंत्र माप के साथ ।

Figure 1
चित्रा 1 : संश्लेषण और रातिमितीय SERRS नैनोप्रोब इमेजिंग के आवेदन की योजनाबद्ध । (1) सोने nanostars संश्लेषित कर रहे है के रूप में खंड 1 में वर्णित है । (2) एक सिलिका शैल सोने nanostar कोर और रमन रिपोर्टर अणुओं के आसपास का गठन किया है (अवरक्त रंजक IR-७८० परक्लोरेट और IR-१४०) के लिए दो अलग nanostar जायके बनाने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, के रूप में खंड 2 में वर्णित है । (3) नैनोकणों की सतह thiols के साथ लेपित है, के रूप में धारा ३.१ में वर्णित है, आगे सतह functionalization सक्षम करने के लिए । ir-७८० स्वाद नैनोकणों एक विरोधी फोलेट रिसेप्टर एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित हैं, जबकि ir-१४० वाले पेग-5k की एक परत के साथ निष्क्रियकृत तल है के रूप में ३.३ वर्गों में वर्णित है ३.६ । (4) फैलाना intraperitoneal डिम्बग्रंथि मेटास्टेटिक स्प्रेड का एक माउस मॉडल खंड 4 में वर्णित के रूप में विकसित किया गया है, और जब तैयार, SERRS nanoprobes intraperitoneal प्रशासित रहे हैं । (5) चूहों euthanized रहे हैं, और शल्य चिकित्सा के लिए पेट की धारा 5 में वर्णित के रूप में रमन इमेजिंग सक्षम उजागर । (6) रमन स्पेक्ट्रा दो जांच के सापेक्ष बहुतायत निर्धारित करने के लिए और धारा 6 में वर्णित के रूप में फोलेट रिसेप्टर overexpression के एक ratiometric नक्शा उत्पन्न करने के लिए बिंदुवार विश्लेषण कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : SERRS nanoprobes के भौतिक लक्षण वर्णन । नैनोकणों संश्लेषण के प्रत्येक भाग के बाद गुणवत्ता नियंत्रण के अधीन किया जा सकता है । संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) सोने की कोर और nanoparticle एकत्रीकरण के बिना सिलिका शैल के सफल गठन के आकार का पता चलता है; स्केल बार = १०० nm. गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) नानोकणों के आकार और ζ-क्षमता को मापने के लिए सफल सिलिकेशन और functionalization सत्यापित कर सकते हैं । यूवी/विज़ अवशोषण के लिए ६७० एनएम के आसपास एक plasmonic चोटी की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता nanostars, सिलिकेशन के बाद ७१० एनएम के लिए स्थानांतरण । रमन माप संश्लेषण भर में प्रत्येक स्वाद के अद्वितीय स्पेक्ट्रा की उपस्थिति प्रकट करते हैं । नानोस्टार स्पेक्ट्रम की तीव्रता, कोई विशिष्ट चोटियों के साथ, जोर देने के लिए 100x द्वारा प्रवर्धित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : रमन स्पेक्ट्रा का प्रसंस्करण. कच्चे स्पेक्ट्रा nanoprobes ' SERRS हस्ताक्षर से मिलकर बनता है, एक व्यापक प्रतिदीप्ति बैंड के शीर्ष पर अध्यारोपित । आधारभूत घटाव के साथ प्रतिदीप्ति बैंड हटा दिया जाता है, और रमन चोटियों प्रमुख हो जाते हैं । नैनोकणों के स्पेक्ट्रल हस्ताक्षर तीव्रता की परवाह किए बिना का पता लगाने के लिए, प्रत्येक स्पेक्ट्रम (संदर्भ और नमूने एक जैसे) इकाई क्षेत्र के लिए सामान्यीकृत है. अंत में, एक चौरसाई-व्युत्पन्न फिल्टर रमन चोटियों को बढ़ावा देने के लिए लागू किया जाता है, जबकि शोर को कम करने. संसाधित संदर्भ स्पेक्ट्रा का उपयोग एक CLS मॉडल को विकसित करने के लिए किया जाता है, ताकि यह अनुपात R के आधार पर संसाधित नमूना स्पेक्ट्रा को वर्गीकृत कर सके. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 : पेट में ओवेरियन कैंसर माइक्रोमेस्टेसिस की रेतिमितीय इमेजिंग । एक माउस के उजागर पेट की रमन इमेजिंग, व्यापक डिम्बग्रंथि मेटास्टेसिस की विशेषता के रूप में bioluminescence इमेजिंग द्वारा पता चला । स्कैन के प्रत्येक बिंदु एक स्पेक्ट्रम है, जो (धारा 6, चित्रा 3) संसाधित है और एक cls मॉडल के आधार पर रन बनाए, दो संदर्भों पर स्कोर प्राप्त करने के लिए: α FR-np लाल में दिखाया गया है, और nt-नीले रंग में एनपी । स्कोर तो एक अनुपात के रूप में दो जांच के सापेक्ष बहुतायत प्रकट करने के लिए, बिंदुवार विभाजित कर रहे हैं । वैकल्पिक रूप से, अनुपात की दहलीज से, "सकारात्मक" क्षेत्रों पेट की एक ऑप्टिकल छवि पर अध्यारोपित किया जा सकता है, लकीर या अन्य केंद्रित उपचार की अनुमति देने के लिए. चित्रा 4 , जर्नल से अनुमति के साथ संदर्भ1से एक अनुकूलित संस्करण है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्रोटोकॉल यहां वर्णित दो SERRS nanoprobes के "जायके" के संश्लेषण के लिए अनुदेश प्रदान करता है, और डिम्बग्रंथि ट्यूमर के रमन इमेजिंग के लिए चूहों में उनके रोजगार फोलेट रिसेप्टर overexpressing, एक ratiometric एल्गोरिथ्म का उपयोग कर । अंय ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीकों पर रमन इमेजिंग का मुख्य लाभ (जैसे प्रतिदीप्ति) नैनोप्रोब संकेत है कि जैविक मूल के किसी भी संकेत के साथ नहीं किया जा सकता की उच्च विशिष्टता है । रमन इमेजिंग के इस अवतार में, नैनोकणों नसों के द्वारा प्रशासित नहीं कर रहे हैं, लेकिन स्थानीय रूप से, एक एकल धोने कदम के बाद एक intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से. इस पद्धति, एक बार नैदानिक क्षेत्र में अनुवाद, एक सुरुचिपूर्ण समाधान का प्रतिनिधित्व करने के लिए कल्पना और इसलिए सभी डिम्बग्रंथि के कैंसर प्रत्यारोपण, यहां तक कि उन है कि नग्न आंखों से पता लगाने के लिए बहुत छोटे हैं, और जो लक्षित नहीं किया जा सकता है सर्जन सक्षम करने के लिए प्रणालीगत परिसंचरण से जुड़े जहाजों की कमी के कारण एक प्रणालीबद्ध इमेजिंग एजेंट के साथ । एक ही समय में, के रूप में हमारे SERRS नैनोकणों प्रणालीगत संचलन में नहीं है, साइड इफेक्ट के लिए संभावित चिंताओं को कम कर रहे हैं । हमारे अध्ययन बढ़ सबूत है कि ध्यान से डिजाइन nanoconstructs पारंपरिक इमेजिंग और चिकित्सा प्रौद्योगिकियों22,23,24,25से अधिक अद्वितीय लाभ प्रदान कर सकते है का एक उदाहरण है, 26,27,28,29,30,31,३२,३३,३४, ३५,३६,३७,३८.

SERRS nanoprobes यहां वर्णित biologically निष्क्रिय कर रहे है और कई प्रकार के कैंसर के माउस मॉडल में ट्यूमर अष्टक के लिए नियोजित किया गया है । सिलिका शैल के गठन के लिए प्रतिक्रिया (रिपोर्टर डाई encapsulation के साथ समवर्ती) हमारे पहले रिपोर्ट संश्लेषण के एक उंनत संस्करण है1,7,8, जो कम nanoparticle एकत्रीकरण के लिए प्रवण है और "मुक्त सिलिका" नैनोकणों (गोल्ड कोर के बिना) के गठन । प्रतिक्रिया व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अवरक्त कार्बनिक रंगों की एक किस्म के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, यहां प्रस्तुत लोगों के अलावा, रमन जायके का एक बड़ा संग्रह उपज है । परिणामस्वरूप संकेत तीव्रता, हालांकि, सोने के लिए डाई के संबध पर निर्भर करता है, और अन्य कारकों. इसके अतिरिक्त, डाई की राशि प्रतिक्रिया करने के लिए जोड़ा एक प्रति डाई आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए, के रूप में कुछ अणुओं और उनके counterions दूसरों की तुलना में अधिक सोने nanostars के एकत्रीकरण का कारण । गंभीर नैनोपलेख एकत्रीकरण के मामले में प्रयुक्त डाई की मात्रा में कमी की जानी चाहिए. सोने कोर का एकत्रीकरण अवांछनीय है, क्योंकि यह रमन संकेत तीव्रता में गंभीर परिवर्तनशीलता पैदा कर सकता है और अर्जित डेटा को जटिल कर सकते हैं । मुक्त सिलिका का गठन सबसे अधिक अहानिकर भाग के लिए है, क्योंकि यह कोई रमन संकेत प्रदान करता है । हालांकि, functionalization के दौरान एंटीबॉडी सिलिका नैनोकणों का पालन करेंगे, इस विधि के समग्र लक्ष्यीकरण प्रभावशीलता ह्रासमान । सिलिका शैल की मोटाई प्रतिक्रिया समय, तापमान पर निर्भर करता है, और पानी की मात्रा जोड़ा (चरण २.१). यदि परिणामी सिलिका शेल बहुत पतली समझी जाती है (चित्र 1, ऊपर दाईं ओर), तो इनमें से एक या अधिक पैरामीटर्स को उचित रूप से बढ़ाया जा सकता है ।

साथ डेटा अधिग्रहण करने का संबंध है, इसकी गुणवत्ता बहुत nanoprobes की चमक पर निर्भर करता है । यह विशेष रूप से स्पष्ट हो जाता है जब रैपिड रमन अधिग्रहण, के रूप में धारा 5 में वर्णित है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि डेटा शोर से पर्याप्त रूप से स्पष्ट है, स्पेक्ट्रा निरीक्षण किया जाना चाहिए, और जांच के प्रतिनिधि रमन चोटियों की उपस्थिति सत्यापित. यदि सिग्नल बहुत कमजोर है, तो प्रति बिंदु एक्सपोज़र समय बढ़ाया जा सकता है । हालांकि, इस दृष्टिकोण को निषेधात्मक रूप से लंबे समय तक स्कैन या बहुत कम स्थानिक संकल्प के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । reproducibility और निरंतरता सुनिश्चित करने के लिए, रमन स्कैनर के अंशांकन निर्माता की सिफारिश के अनुसार किया जाना चाहिए और आम तौर पर एक सामान्य मानक का उपयोग किया जाता है (जैसे, एक सिलिकॉन वेफर).

इस विधि की मुख्य शक्तियों में से एक अपनी बहुमुखी प्रतिभा है । विभिन्न ट्यूमर प्रकार विभिन्न आणविक मार्कर लक्ष्यीकरण विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके imaged किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, nanoprobes यहां वर्णित पशु मॉडल के लिए प्रशासित किया जा सकता है-intraperitoneally या नसों के द्वारा-लेकिन यह भी, एक ही तकनीक का उपयोग कर, वे ऊतकों दाग, या तो तय या हौसले से उत्तेजित किया जा सकता है ।

हालांकि ratiometric तकनीक सूक्ष्मदर्शी ट्यूमर का पता लगाने के लिए विशिष्टता प्रदान करता है, व्यक्तिगत जांच के वितरण ट्यूमर क्षेत्रों के लिए विशिष्ट नहीं है । इसका मतलब यह है कि प्रकाश तापीय/photothermal थेरेपी या दवा लदान के रूप में theranostic तकनीकों आदर्श नहीं होगा, के रूप में चिकित्सा के रूप में अच्छी तरह से स्वस्थ क्षेत्रों के लिए दिया जाएगा । एक संभावित चिकित्सकीय इस तकनीक के द्वारा afforded आवेदन ratiometric पता लगाने के बाद माइक्रोट्यूमर के स्वचालित अपक्षरण होगा ।

हमें आशा है कि रमन इमेजिंग के इस स्थानीय, ratiometric दृष्टिकोण SERRS nanoprobes का उपयोग करने के लिए रास्ता प्रशस्त कर सकते हैं, आवश्यक नैदानिक परीक्षणों के बाद, रोगियों में एक आणविक इमेजिंग एजेंट के रूप में । इस विधि के लिए मानव में संभावित भविष्य अनुप्रयोगों के साथ संगत हो विकसित किया गया था, के रूप में नैनोकणों के लिए प्रशासित किया जा सकता है और उदर गुहा से हटा दिया है कि उपकरणों का उपयोग कर HIPEC के लिए नैदानिक उपयोग में पहले से ही कर रहे हैं ।

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Disclosures

• M.F.K. इस काम से संबंधित कई जारी या लंबित पेटेंट आवेदनों पर एक आविष्कारकों के रूप में सूचीबद्ध है । M.F.K. एक सह रियो इमेजिंग, Inc, जो क्लीनिक में SERRS नैनोकणों अनुवाद करना है के संस्थापक है ।

• लेखकों की घोषणा है कि वे कोई अंय प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

निंनलिखित धन स्रोतों (M.F.K.) को स्वीकार कर रहे हैं: NIH R01 EB017748, R01 CA222836 और K08 CA16396; डैमॉन रुनयोन-रचलेफ इनोवेशन अवार्ड डीआरआर-29-14, पर्शिंग स्क्वायर सोहन कैंसर रिसर्च एलायंस, और आणविक इमेजिंग & नैनो (CMINT) के लिए MSKCC केंद्र और प्रौद्योगिकी विकास अनुदान द्वारा वर्ग Sohn पुरस्कार । रसीद भी MSKCC NIH कोर अनुदान (P30-CA008748) द्वारा प्रदान की अनुदान-फंडिंग समर्थन करने के लिए विस्तारित कर रहे हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Reagent
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960
3-MPTMS Sigma-Aldrich 175617
Ammonium hydroxide (28%) Sigma-Aldrich 338818
Anti-Folate Receptor antibody [LK26]  AbCam ab3361
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 276855
Dimethyl sulfoxide (anhydrous) Sigma-Aldrich 276855
Ethanol Sigma-Aldrich 792780
IR140 Sigma-Aldrich 260932
IR780 perchlorate* Sigma-Aldrich 576409 Discontinued*
Isopropanol Sigma-Aldrich 650447
N.N.Dimethylformamide Sigma-Aldrich 227056
PEG crosslinker Sigma-Aldrich 757853
PEG-maleimide Sigma-Aldrich 900339
Tetrachloroauric Acid Sigma-Aldrich 244597
Tetraethyl Orthosilicate Sigma-Aldrich 86578
*IR792 Sigma-Aldrich 425982 *Alternative
Name of Equipment
Dialysis cassette (3,500 MWCO) ThermoFIsher 87724
Centrifugal filters Millipore UFC510096
inVia confocal Raman microscope Renishaw
MATLAB (v2014b) Mathworks
PLS Toolbox (v8.0) Eigenvector research

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References

  1. Oseledchyk, A., Andreou, C., Wall, M. A., Kircher, M. F. Folate-Targeted Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detection of Microscopic Ovarian Cancer. ACS Nano. 11 (2), 1488-1497 (2017).
  2. Andreou, C., et al. Imaging of Liver Tumors Using Surface-Enhanced Raman Scattering Nanoparticles. ACS Nano. 10 (5), 5015-5026 (2016).
  3. Karabeber, H., et al. Guiding brain tumor resection using surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and a hand-held Raman scanner. ACS Nano. 8 (10), 9755-9766 (2014).
  4. Kircher, M. F., et al. A brain tumor molecular imaging strategy using a new triple-modality MRI-photoacoustic-Raman nanoparticle. Nature Medicine. 18 (5), 829-834 (2012).
  5. Andreou, C., Kishore, S. A., Kircher, M. F. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy: A New Modality for Cancer Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1295-1299 (2015).
  6. Harmsen, S., et al. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nature Communications. 6, 6570 (2015).
  7. Harmsen, S., et al. Surface-enhanced resonance Raman scattering nanostars for high-precision cancer imaging. Science Translational Medicine. 7 (271), 271ra277 (2015).
  8. Harmsen, S., Wall, M. A., Huang, R., Kircher, M. F. Cancer imaging using surface-enhanced resonance Raman scattering nanoparticles. Nature Protocols. 12 (7), 1400-1414 (2017).
  9. Huang, R., et al. High Precision Imaging of Microscopic Spread of Glioblastoma with a Targeted Ultrasensitive SERRS Molecular Imaging Probe. Theranostics. 6 (8), 1075-1084 (2016).
  10. Iacono, P., Karabeber, H., Kircher, M. F. A "schizophotonic" all-in-one nanoparticle coating for multiplexed SE(R)RS biomedical imaging. Angewandte Chemie, International Edition in English. 53 (44), 11756-11761 (2014).
  11. Spaliviero, M., et al. Detection of Lymph Node Metastases with SERRS Nanoparticles. Molecular Imaging and Biology. 18 (5), 677-685 (2016).
  12. Nayak, T. R., et al. Tissue factor-specific ultra-bright SERRS nanostars for Raman detection of pulmonary micrometastases. Nanoscale. 9 (3), 1110-1119 (2017).
  13. Thakor, A. S., et al. The fate and toxicity of Raman-active silica-gold nanoparticles in mice. Science Translational Medicine. 3 (79), 79ra33 (2011).
  14. Liu, J., et al. Effects of Cd-based Quantum Dot Exposure on the Reproduction and Offspring of Kunming Mice over Multiple Generations. Nanotheranostics. 1 (1), 23-37 (2017).
  15. Wu, N., et al. The biocompatibility studies of polymer dots on pregnant mice and fetuses. Nanotheranostics. 1 (3), 261-271 (2017).
  16. Garai, E., et al. High-sensitivity real-time, ratiometric imaging of surface-enhanced Raman scattering nanoparticles with a clinically translatable Raman endoscope device. Journal of Biomedical Optics. 18 (9), 096008 (2013).
  17. Wang, Y. W., et al. Rapid ratiometric biomarker detection with topically applied SERS nanoparticles. Technology (Singap World Sci). 2 (2), 118-132 (2014).
  18. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
  19. Vergote, I. B., Marth, C., Coleman, R. L. Role of the folate receptor in ovarian cancer treatment: evidence, mechanism, and clinical implications. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 41-52 (2015).
  20. Fasolato, C., et al. Folate-based single cell screening using surface enhanced Raman microimaging. Nanoscale. 8 (39), 17304-17313 (2016).
  21. Wang, Y. W., et al. Raman-Encoded Molecular Imaging with Topically Applied SERS Nanoparticles for Intraoperative Guidance of Lumpectomy. Cancer Research. 77 (16), 4506-4516 (2017).
  22. Andreou, C., Pal, S., Rotter, L., Yang, J., Kircher, M. F. Molecular Imaging in Nanotechnology and Theranostics. Molecular Imaging and Biology. 19 (3), 363-372 (2017).
  23. Chitgupi, U., Qin, Y., Lovell, J. F. Targeted Nanomaterials for Phototherapy. Nanotheranostics. 1 (1), 38-58 (2017).
  24. Choi, D., et al. Iodinated Echogenic Glycol Chitosan Nanoparticles for X-ray CT/US Dual Imaging of Tumor. Nanotheranostics. 2 (2), 117-127 (2018).
  25. Dubey, R. D., et al. Novel Hyaluronic Acid Conjugates for Dual Nuclear Imaging and Therapy in CD44-Expressing Tumors in Mice In Vivo. Nanotheranostics. 1 (1), 59-79 (2017).
  26. Gupta, M. K., et al. Recent strategies to design vascular theranostic nanoparticles. Nanotheranostics. 1 (2), 166-177 (2017).
  27. Huang, Y. J., Hsu, S. H. TRAIL-functionalized gold nanoparticles selectively trigger apoptosis in polarized macrophages. Nanotheranostics. 1 (3), 326-337 (2017).
  28. Pal, S., Harmsen, S., Oseledchyk, A., Hsu, H. T., Kircher, M. F. MUC1 Aptamer Targeted SERS Nanoprobes. Advanced Functional Materials. 27 (32), (2017).
  29. Zanganeh, S., et al. Iron oxide nanoparticles inhibit tumour growth by inducing pro-inflammatory macrophage polarization in tumour tissues. Nat Nanotechnol. 11 (11), 986-994 (2016).
  30. Lee, J., Lee, Y. M., Kim, J., Kim, W. J. Doxorubicin/Ce6-Loaded Nanoparticle Coated with Polymer via Singlet Oxygen-Sensitive Linker for Photodynamically Assisted Chemotherapy. Nanotheranostics. 1 (2), 196-207 (2017).
  31. Li, R., Zheng, K., Yuan, C., Chen, Z., Huang, M. Be Active or Not: the Relative Contribution of Active and Passive Tumor Targeting of Nanomaterials. Nanotheranostics. 1 (4), 346-357 (2017).
  32. Lin, S. Y., Huang, R. Y., Liao, W. C., Chuang, C. C., Chang, C. W. Multifunctional PEGylated Albumin/IR780/Iron Oxide Nanocomplexes for Cancer Photothermal Therapy and MR Imaging. Nanotheranostics. 2 (2), 106-116 (2018).
  33. Roberts, S., et al. Sonophore-enhanced nanoemulsions for optoacoustic imaging of cancer. Chemical Science (Royal Society of Chemistry: 2010). 9 (25), 5646-5657 (2018).
  34. Liu, L., Ruan, Z., Yuan, P., Li, T., Yan, L. Oxygen Self-Sufficient Amphiphilic Polypeptide Nanoparticles Encapsulating BODIPY for Potential Near Infrared Imaging-guided Photodynamic Therapy at Low Energy. Nanotheranostics. 2 (1), 59-69 (2018).
  35. Liu, R., Tang, J., Xu, Y., Zhou, Y., Dai, Z. Nano-sized Indocyanine Green J-aggregate as a One-component Theranostic Agent. Nanotheranostics. 1 (4), 430-439 (2017).
  36. Sneider, A., VanDyke, D., Paliwal, S., Rai, P. Remotely Triggered Nano-Theranostics For Cancer Applications. Nanotheranostics. 1 (1), 1-22 (2017).
  37. Wall, M. A., et al. Surfactant-Free Shape Control of Gold Nanoparticles Enabled by Unified Theoretical Framework of Nanocrystal Synthesis. Advanced Materials. 29 (21), (2017).
  38. Sonali,, et al. Nanotheranostics: Emerging Strategies for Early Diagnosis and Therapy of Brain Cancer. Nanotheranostics. 2 (1), 70-86 (2018).

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कैंसर अनुसंधान अंक १४५ रमन SERS nanoparticle आणविक इमेजिंग डिम्बग्रंथि के कैंसर फोलेट रिसेप्टर ratiometry
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Andreou, C., Oseledchyk, A., Nicolson, F., Berisha, N., Pal, S., Kircher, M. F. Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting. J. Vis. Exp. (145), e58389, doi:10.3791/58389 (2019).

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