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Neuroscience

Compartmentalizing प्राथमिक Murine न्यूरॉन्स के लिए पूर्व इकट्ठे प्लास्टिक Microfluidic चिप्स का उपयोग

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/58421
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,2,3
1UNC Neuroscience Center, 2UNC/NC State Joint Department of Biomedical Engineering, UNC, 3Xona Microfluidics, LLC

Summary

इस प्रोटोकॉल संस्कृति और compartmentalize प्राथमिक murine ंयूरॉंस के लिए प्लास्टिक चिप्स के उपयोग का वर्णन । ये चिप्स, उपयोगकर्ता के अनुकूल है, और उच्च संकल्प, जी के साथ संगत, और प्रतिदीप्ति इमेजिंग । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे प्लेट चूहे हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स इन चिप्स के भीतर और तरल पदार्थ अलगाव, axotomy और immunostaining प्रदर्शन.

Abstract

compartmentalize न्यूरॉन्स के लिए Microfabricated तरीकों कई neuroscientists के लिए आवश्यक उपकरण बन गए हैं. इस प्रोटोकॉल compartmentalizing कल्चरल प्राइमरी रैट हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूर्व इकट्ठे प्लास्टिक चिप के उपयोग का वर्णन करता है । ये प्लास्टिक चिप्स, एक मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड के पदचिह्न के भीतर समाहित, उच्च संकल्प, जी, और प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ संगत कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कैसे पृथक axons के माध्यम से प्रतिगामी लेबल ंयूरॉंस को एक संशोधित रेबीज एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन एंकोडिंग वायरस का उपयोग कर, एक डिब्बे के भीतर अलग microenvironments बनाने के लिए, और axotomy और immunocytochemistry पर चिप प्रदर्शन करते हैं । न्यूरॉन्स के लिए संस्कृति रहे हैं > 3 प्लास्टिक चिप्स के भीतर सप्ताह, लंबी अवधि के न्यूरॉन संस्कृतियों के लिए इन चिप्स की अनुकूलता चित्रण.

Introduction

पारंपरिक ंयूरॉन संस्कृति axons और dendrites, जो उनके अद्वितीय ध्रुवीय आकृति विज्ञान में ंयूरॉंस के अध्ययन को रोकने के यादृच्छिक वृद्धि में परिणाम दृष्टिकोण । Microfabricated multicompartment उपकरणों अच्छी तरह से स्थापित है और पिछले 10-15 वर्षों में neuroscientists के लिए अच्छी तरह से इस्तेमाल किया अनुसंधान उपकरण बन गए है (चयनित उच्च प्रोफ़ाइल प्रकाशनों1,2,3 संदर्भित कर रहे है , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). इन उपकरणों compartmentalize ंयूरॉंस और शारीरिक और रासायनिक सोमता, dendrites, axons, और synapses18,19सहित न्यूरॉन्स के सेलुलर क्षेत्रों में हेरफेर करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं । उंहोंने यह भी कई प्रयोगात्मक मानदंड है कि axonal परिवहन, axonal प्रोटीन संश्लेषण, axon चोट/पुनर्जनन, और axon के अध्ययन सहित यादृच्छिक संस्कृतियों, का उपयोग संभव नहीं है प्रदान करने वाली सोमा संकेतन । बुनियादी 2 डिब्बे विंयास दो समानांतर microfluidic छोटे सीधा microgrooves की एक श्रृंखला से अलग चैनलों के होते हैं । प्राथमिक या स्टेम कोशिका व्युत्पंन न्यूरॉन्स microfluidic चैनलों में से एक में चढ़ाया जाता है, बसा है और डिवाइस के नीचे की सतह के लिए देते हैं, और दिनों के पाठ्यक्रम पर neurites का विस्तार । कई विकास शंकु microgrooves, जो काफी छोटे है कि वे में प्रवेश करने से सेल निकायों को रोकने में अपनी तरह लगता है । क्योंकि विकास शंकु शारीरिक रूप से प्रतिबंधित है और microgrooves के भीतर घूम करने में असमर्थ हैं, वे सीधे सटे डिब्बे (axonal डिब्बे) जहां वे अलग कर रहे है में हो जाना ।

ऐतिहासिक रूप से, इन उपकरणों को एक photolithographically नमूनों मास्टर मोल्ड से पाली (dimethylsiloxane) (PDMS) का उपयोग कर ढाला गया है और या तो जांचकर्ता प्रयोगशालाओं में घर में किए गए हैं या व्यावसायिक रूप से खरीदे गए हैं । PDMS का उपयोग कर के मुख्य कमियों में से एक इसकी hydrophobicity20है । PDMS अस्थाई रूप से हाइड्रोफिलिक बनाया जा सकता है, लेकिन फिर जल्दी से एक गैर जलीय पर्यावरण20में घंटे के भीतर hydrophobic हो जाता है । इस वजह से, उपकरणों के उपयोग के समय में एक गिलास coverslip या अन्य उपयुक्त सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न किया जाना चाहिए. पूर्व इकट्ठे प्लास्टिक multicompartment चिप्स अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है (उदा, XonaChips) इंजेक्शन ढाला प्लास्टिक में । इन चिप्स स्थाई रूप से हाइड्रोफिलिक बना रहे हैं, गीला डिवाइस को सरल बनाने और पूर्व की अनुमति चक्रीय olefin copolymer की एक पतली फिल्म के साथ चिप के विधानसभा (कॉक) नीचे microfluidic चैनल संलग्न । इन चिप्स एक ऑप्टिकली पारदर्शी उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए उपयुक्त प्लास्टिक में गढ़े हैं ।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य कई प्रयोगात्मक मानदंड murine हिप्पोकैम्पस या cortical ंयूरॉंस का उपयोग प्रदर्शन के लिए पूर्व इकट्ठे प्लास्टिक microfluidic चिप्स के उपयोग का प्रदर्शन है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे प्रतिगामी लेबल ंयूरॉंस चिप के भीतर एक संशोधित रेबीज वायरस का उपयोग कर । axon चोट और पुनर्जनन के अध्ययन के लिए Axotomy भी बताए गए हैं. अंत में, इस प्रोटोकॉल को दिखाता है कि डिवाइस के साथ प्रतिदीप्ति immunostaining प्रदर्शन करने के लिए ।

Protocol

नोट: प्लास्टिक multicompartment चिप के एक योजनाबद्ध चित्र 1a, बीमें दिखाया गया है चिप एक मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड (७५ मिमी × 25 मिमी) का आकार है । चिप, मुख्य चैनल या डिब्बों, कुओं, और microgrooves सहित की विशेषताएं लेबल है और भविष्य के संदर्भ के लिए प्रदान की जाती हैं । चित्रा 1C डिब्बों के द्रव अलगाव का प्रदर्शन चिप की एक तस्वीर है ।

1. तैयारी और Multicompartment चिप्स की कोटिंग

  1. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, एक पेट्री पकवान या अंय उपयुक्त बाँझ कंटेनर में चिप जगह है ।
  2. जोड़ें १०० µ पूर्व के एल-कोटिंग समाधान ऊपरी चिप की अच्छी तरह से छोड़ दिया और यह अच्छी तरह से आसपास के मुख्य चैनल के माध्यम से प्रवाह करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: पूर्व कोटिंग समाधान के लिए पूर्व कोट microfluidic चैनलों के लिए चिप के भीतर हवा के बुलबुले को फँसाने के लिए क्षमता को खत्म करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  3. भरें लोअर पूर्व के १०० µ एल के साथ अच्छी तरह से छोड़ दिया कोटिंग समाधान । microgrooves के माध्यम से प्रवाह के समाधान की अनुमति देने के लिए 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें ।
  4. पूर्व के १०० µ एल जोड़ने के ऊपरी सही ठीक से कोटिंग समाधान और यह अच्छी तरह से आसपास के मुख्य चैनल के माध्यम से प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं । पूर्व के १०० µ एल के साथ कम सही अच्छी तरह से भरें-कोटिंग समाधान ।
  5. प्रत्येक कुआं से समाधान महाप्राण । मुख्य चैनलों (चित्रा 2a) से तरल को हटाने से बचने के लिए प्रमुख चैनलों से दूर महाप्राण. तुरंत ऊपरी बाईं ओर अच्छी तरह से फास्फेट-बफर खारा (पंजाब) के १५० µ एल जोड़ें । १.५ मिनट रुको ।
    चेतावनी: सभी तरल संलग्न मुख्य चैनलों से महाप्राण मत करो ।
  6. लोअर लेफ्ट वेल में १५० µ l पंजाबियों को जोड़ें । तरल पदार्थ microgrooves के माध्यम से प्रवाह करने के लिए अनुमति देने के लिए 5 मिनट रुको । ऊपरी दाईं ओर १५० µ l पंजाबियों को अच्छी तरह जोड़ें । जोड़ें १५० µ एल पंजाबियों सही अच्छी तरह से कम करने के लिए । 10 मिनट रुको ।
  7. एक दूसरे पंजाबियों धोने के लिए कदम 1.5-1.6 दोहराएं ।
  8. मुख्य चैनलों में बुलबुले के लिए एक ऊतक संस्कृति माइक्रोस्कोप के तहत चिप की जाँच करें । यदि बुलबुले मौजूद हैं, प्रक्रियाओं के नीचे प्रदर्शन करते हैं । कोई बुलबुले मौजूद हैं, तो चरण १.९ के लिए छोड़ें ।
    1. चैनल खोलने से दूर प्लास्टिक टिप angling कुओं से महाप्राण पंजाबियों (चित्रा 2a) ।
    2. वितरण १०० पूर्व के µ एल-ऊपरी अच्छी तरह से कोटिंग समाधान, चैनल खोलने के पास प्लास्टिक की नोक angling (चित्रा बी) । बुलबुले कम अच्छी तरह से चैनल के माध्यम से चलना चाहिए । १.५ मिनट रुको ।
    3. चरण 1.3-1.8 दोहराएं ।
  9. चैनल खोलने से दूर प्लास्टिक टिप angling कुओं से महाप्राण पंजाबियों (चित्रा 2a) ।
  10. जोड़ें १०० µ एल के ०.५ मिलीग्राम/एमएल पाली डी-lysine (PDL) के ऊपरी छोड़ दिया अच्छी तरह से चिप की । १.५ मिनट प्रतीक्षा करें निचले बाएं अच्छी तरह से PDL के १०० µ एल के साथ भरें ।
  11. चिप के ऊपरी दाएँ अच्छी तरह से PDL के १०० µ एल जोड़ें. प्रतीक्षा १.५ min. Add १०० µ l को कम सही अच्छी तरह से ।
  12. पेट्री पकवान बंद करो और एक मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए चिप जगह है ।
  13. दोहराएं पंजाब धो कदम 1.5-1.6 दो बार अतिरिक्त PDL को दूर करने के लिए ।
  14. महाप्राण उपकरण से पंजाबियों को.
  15. तुरंत ऊपरी चिप की अच्छी तरह से छोड़ दिया करने के लिए सेल संस्कृति मीडिया के १०० µ एल जोड़ें । प्रतीक्षा करें १.५ min. media जोड़ें निचले बाईं ओर अच्छी तरह से । ऊपरी दाईं ओर मीडिया को अच्छी तरह से जोड़ें । १.५ min. Add १०० µ l मध्यम चिप के निचले सही अच्छी तरह से करने के लिए प्रतीक्षा करें ।
  16. थाली कोशिकाओं को तैयार जब तक 37 डिग्री सेल्सियस मशीन में चिप रखें ।

2. Multicompartment चिप्स में न्यूरॉन्स सीडिंग

  1. असंबद्ध चूहा हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस के सेल निलंबन की स्थापना के अनुसार तैयार करने के लिए स्थापित प्रोटोकॉल21,22 ~ 12 × 106 कोशिकाओं के एक घनत्व उपज/
    नोट: 3 और 12 × 106 कोशिकाओं/एमएल के बीच सेल सस्पेंशन घनत्व का प्रयोग संभव है । अगर एक कम घनत्व इस्तेमाल किया जाता है, सेल निलंबन की मात्रा चिप में जोड़ा जा करने के लिए बढ़ाया जा सकता है (नीचे देखें) । नीचे वर्णित प्रक्रिया murine असंबद्ध cortical या हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के लिए लागू है । अंय ंयूरॉन प्रकार के लिए इष्टतम कोशिका घनत्व भिंन हो सकते हैं ।
  2. चिप के प्रत्येक कुआं में मीडिया के बहुमत को हटा दें, एक अच्छी तरह से लगभग 5 µ एल जा । मुख्य चैनलों (चित्रा 2a) से तरल को हटाने से बचने के लिए प्रमुख चैनलों से दूर महाप्राण.
    सावधानी: संलग्न मुख्य चैनलों से लिक्विड महाप्राण न करें । हवा के बुलबुले चिप में फंस अगर द्रव मुख्य चैनलों से aspirated है हो सकता है ।
  3. लोड 5 µ एल सेल निलंबन के ऊपरी सही में अच्छी तरह से और एक और 5 µ एल सेल निलंबन के निचले सही अच्छी तरह से (~ १२०,००० कुल कोशिकाओं) । मुख्य चैनल (चित्रा बी) के करीब वितरण द्वारा कोशिकाओं लोड । न्यूरॉन्स मुख्य चैनल में हैं यह सुनिश्चित करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें. कक्षों को अनुलग्न करने की अनुमति देने के लिए 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें ।
    नोट: न्यूरॉन्स या तो डिब्बे में लोड किया जा सकता है. विवरण प्रयोजनों के लिए, दैहिक डिब्बे सही पक्ष पर मुख्य चैनल है, लेकिन या तो डिब्बे दैहिक डिब्बे के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । कम सेल घनत्व के प्रयोग नीचे चिप प्रति ६०,००० कोशिकाओं के लिए संभव है । सेल निलंबन के 10 µ एल अप करने के लिए ऊपर वर्णित से कम कोशिकाओं के साथ एक सेल निलंबन के साथ संयोजन में दैहिक डिब्बे की एक अच्छी तरह से जोड़ा जा सकता है ।
  4. प्रत्येक ऊपरी और निचले सही कुओं में से प्रत्येक के लिए लगभग १५० µ एल जोड़ें ंयूरॉन संस्कृति मीडिया, और फिर जोड़ने के १५० µ एल मीडिया के प्रत्येक को ऊपरी और निचले बाएं कुओं । humidified ट्रे में एक 5% CO2 ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में चिप रखें ।
  5. 24 ज के बाद, मीडिया को कुएं से हटाकर मीडिया में बदलाव करें । सुनिश्चित करें कि मुख्य चैनल भरा रहता है । प्रत्येक शीर्ष पर अच्छी तरह से मीडिया के १५० µ एल जोड़ें, और फिर नीचे कुओं को भरने ।
  6. दिन की वांछित संख्या के लिए चिप वापस मशीन में रखें ।
    नोट: मीडिया हर दो दिन की निगरानी यकीन है कि यह प्रकाश गुलाबी बना हुआ है । यदि मीडिया पीले है, ताजा मीडिया के साथ इसे का ५०% की जगह । यदि द्रव स्तर कम है, सुनिश्चित करें कि वहां पर्याप्त नमी और चिप्स के उचित माध्यमिक रोकथाम के लिए वाष्पीकरण को रोकने है । ंयूनतम, या भी नष्ट करने, मीडिया में परिवर्तन संभव माध्यमिक शामिल करने और/या polytetrafluoroethylene (PTFE)-FEP फिल्म के साथ चिप युक्त पकवान को कवर का उपयोग कर रहा है ।

3. न्यूरॉन्स के भीतर प्रतिगामी लेबलिंग चिप

नोट: प्रतिगामी लेबलिंग संशोधित हैजा विष और रेबीज वायरस का उपयोग कर सहित कई तकनीकों, का उपयोग किया जा सकता है । नीचे लेबल का उपयोग कर ंयूरॉंस के लिए निर्देश है जी नष्ट रेबीज-mCherry या-eGFP वायरस । स्थानीय संगठन के दिशानिर्देशों के अनुसार संभावित संक्रामक सामग्रियों को संभालें । अतिरिक्त प्रशिक्षण की आवश्यकता हो सकती है ।

  1. ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म ताजा ंयूरॉन संस्कृति मीडिया । अनुमान ~ चिप प्रति मीडिया के ४०० µ एल ।
  2. axonal डिब्बे के या तो अच्छी तरह से लिया मीडिया का उपयोग कर ५० µ एल की कुल में संशोधित रेबीज वायरस की १००,००० वायरल इकाइयों पतला ।
    नोट: युक्तियां और वायरस के साथ संपर्क में ट्यूबों के संगठन को मंजूरी दे दी प्रोटोकॉल के अनुसार निपटान ।
  3. धीरे axonal डिब्बे के कुओं से बचे हुए मीडिया प्लास्टिक और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक केंद्रापसारक ट्यूब में स्टोर ।
  4. ताजा गर्म मीडिया और axonal डिब्बे को पतला वायरस के ५० µ एल के १५० µ एल जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन पर 2 एच के लिए मशीन ।
  5. वायरस युक्त मीडिया निकालें और इसे ठीक से निपटाने ।
    नोट: यदि द्रव मुख्य चैनलों से aspirated है तो हवा के बुलबुले चिप में फँस जाते हैं ।
  6. धीरे ताजा मीडिया के ७५ µ एल जोड़ने के लिए एक अच्छी तरह से axon और यह अंय axon को अच्छी तरह से प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं ।
  7. दूसरी axon से फ्लो-थ्रू निकालें और ठीक से निपटारा करें.
  8. दोहराएं चरण ३.६ और ३.७ एक बार ।
  9. axonal डिब्बे में वापस संग्रहीत मीडिया जोड़ें । लगभग ५० µ एल ताजा मीडिया जोड़ें, यदि आवश्यक हो, पर्याप्त मात्रा बनाए रखने के लिए और मशीन के लिए कोशिकाओं को वापस ।
    नोट: फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति ४८ एच द्वारा दिखाई दे रहा है और 8 दिनों के लिए बनी रहती है । न्यूरॉन्स ंयूरॉंस संस्कृति मीडिया में कमरे के तापमान पर करने के लिए 30 मिनट के लिए imaged किया जा सकता है । संस्कृति मीडिया भी गरम सह2के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है-B27 के साथ स्वतंत्र हाइबरनेट ई और अब के लिए छवि बनाई । न्यूरॉन्स भी ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2में एक अच्छी तरह से humidified पर्यावरण चैंबर के भीतर imaged जा सकता है । इस मामले में, humidification चिप्स के भीतर वाष्पीकरण नुकसान को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है, जो हीटिंग से गहरा है और ंयूरॉन स्वास्थ्य समझौता कर सकते हैं ।

4. चिप के भीतर Axonal डिब्बे के द्रव अलगाव

  1. कम से 20 µ एल निकालें axonal डिब्बे के अच्छी तरह से छोड़ दिया और शारीरिक डिब्बे के ऊपरी सही अच्छी तरह से जगह है । equilibrate करने के लिए प्रत्येक चैनल के भीतर प्रवाह के लिए 2 मिनट रुको ।
  2. axonal डिब्बे से मीडिया के ५० µ l को हटा दें । 1 मिमी Alexa Fluor ४८८ हयद्रज़ीदे के ०.३ µ एल जोड़ें इस मीडिया, प्लास्टिक के माध्यम से मिश्रण और axonal डिब्बे में वापस लौटने के लिए । चिप इमेजिंग के लिए तैयार है ।
    नोट: ब्याज के अंय यौगिकों जोड़ा जा सकता है । ब्याज की यौगिक के रूप में एक समान आणविक वजन के साथ एक फ्लोरोसेंट डाई जोड़ने के क्रम में समय के साथ द्रवित अलगाव की निगरानी की सिफारिश की है ।

5. प्रदर्शन चिप के भीतर Axotomy

  1. axonal प्लास्टिक टिप मुख्य चैनल के प्रवेश द्वार से दूर रखने के डिब्बे से मीडिया निकालें (चित्रा 2a) और यह एक केंद्रापसारक ट्यूब में स्टोर ।
  2. axonal डिब्बे को पूरी तरह से महाप्राण, axonal डिब्बे के मुख्य चैनल के या तो प्रवेश द्वार के पास आकांक्षा प्लास्टिक (चित्रा बी) के पास रखकर । 1-2 मिनट के लिए जारी आकांक्षा । सुनिश्चित करें कि समाधान पूरी तरह से डिब्बे से निकाल दिया गया है ।
    नोट: आकांक्षा के लिए वैक्यूम दबाव axotomy प्रक्रिया को ठीक से काम करने के लिए कम से 18 इंच पारा होना चाहिए ।
  3. संग्रहीत मीडिया के साथ axonal डिब्बे बदलें और पुष्टि करते है कि axons एक खुर्दबीन के नीचे चिप को देखकर गंभीर हैं ।
    नोट: जब मीडिया की जगह axonal डिब्बे में बुलबुले के रूप में, दोहराएं कदम 5.1-5.2 ।
  4. मशीन के लिए चिप लौटें ।

6. प्रतिदीप्ति Immunostaining चिप के भीतर

  1. पंजाब में 4% formaldehyde निर्धारण समाधान तैयार करें (4% formaldehyde, 1 µ m MgCl2, ०.१ µM CaCl2, १२० mM सुक्रोज)
  2. मीडिया के अधिकांश हिस्से को चिप के कुंए में हटा दें (अंदरूनी डिब्बों को न सुखाएं) ।
  3. तुरंत axonal और दैहिक डिब्बों के शीर्ष कुओं को निर्धारण समाधान के १०० µ एल जोड़ें ।
  4. 1 मिनट के बाद, नीचे कुओं के लिए निर्धारण समाधान के १०० µ एल जोड़ें । कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए फिक्स ।
  5. चिप के कुओं से समाधान के अधिकांश निकालें (आंतरिक डिब्बों सूखी नहीं है) । तुरंत axonal और दैहिक डिब्बों के शीर्ष कुओं में से प्रत्येक के लिए पंजाब के १५० µ एल जोड़ें । नीचे कुओं में प्रवाह के लिए पंजाबियों के लिए 2 मिनट रुको ।
  6. दोहराएं चरण ६.५ दो बार ।
  7. ज्यादातर पंजाबियों को चिप के कुंए से हटा दें । तुरंत axonal और दैहिक डिब्बों के शीर्ष कुओं में से प्रत्येक के लिए ०.२५% TritonX-१०० के साथ पंजाब के १५० µ एल जोड़ें । 15 मिनट के लिए रुको ।
  8. चिप के कुओं से तरल के अधिकांश निकालें और तुरंत समाधान अवरुद्ध की १५० µ एल जोड़ने (10% पंजाब में सामान्य बकरी सीरम) axonal और दैहिक डिब्बों के शीर्ष कुओं में से प्रत्येक के लिए. 15 मिनट के लिए रुको ।
    नोट: प्रभावी अवरुद्ध समाधान माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए विशिष्ट होना चाहिए, उदाहरणके लिए, एक गधा विरोधी भेड़ माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए, अवरुद्ध समाधान में गधा सीरम का उपयोग करें ।
  9. चिप के कुओं से तरल के अधिकांश निकालें और तुरंत axonal और दैहिक डिब्बों के शीर्ष कुओं में से प्रत्येक के लिए पंजाब में 1% सामांय बकरी सीरम में प्राथमिक एंटीबॉडी (या एंटीबॉडी) के १०० µ एल जोड़ें । कवर वाष्पीकरण को कम करने के लिए और कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में 1 घंटे के लिए रुको ।
  10. चिप के कुओं से समाधान के अधिकांश निकालें (आंतरिक डिब्बों सूखी नहीं है) । तुरंत axonal और दैहिक डिब्बों के शीर्ष कुओं में से प्रत्येक के लिए पंजाब के १५० µ एल जोड़ें । नीचे कुओं में प्रवाह के लिए पंजाबियों के लिए 5 मिनट रुको ।
  11. दोहराएं चरण ६.१० दो बार ।
  12. चिप के कुओं से तरल के अधिकांश निकालें और तुरंत axonal और दैहिक डिब्बों के शीर्ष कुओं में से प्रत्येक के लिए पंजाब में माध्यमिक एंटीबॉडी (या एंटीबॉडी) के १०० µ एल जोड़ें । कवर वाष्पीकरण को कम करने और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्रतीक्षा करें ।
    नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी की सिफारिश की कमजोर पड़ने के लिए निर्माता के निर्देशों का संदर्भ लें ।
  13. दोहराएं चरण 6.10-6.11 ।
  14. यदि immunostaining के 1 दिन के भीतर इमेजिंग, तो पंजाबियों से भरी चिप रखें । यदि चिप इमेजिंग से पहले 1 दिन से अधिक समय तक संग्रहित किया जाएगा, तेल फिल्म में चिप युक्त पकवान लपेट के लिए वाष्पीकरण को रोकने और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान तक तैयार छवि के लिए ।
  15. नमूनों की अब अवधि भंडारण के लिए, बढ़ते मीडिया (जैसे, Fluoromount-जी) इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. चिप के कुओं से तरल के अधिकांश निकालें । axonal और दैहिक डिब्बों के शीर्ष कुओं में से प्रत्येक के लिए बढ़ते मीडिया के 2 बूंदें जोड़ने के लिए एक 1 मिलीलीटर डिस्पोजेबल प्लास्टिक प्लास्टिक का प्रयोग करें ।
    2. चैनलों के माध्यम से बढ़ते मीडिया के प्रवाह को प्रोत्साहित करने के लिए चिप झुकाव । 5 मिनट के बाद नीचे कुओं में 2 बूंदें जोड़ें । इमेजिंग से पहले 1 घंटे के लिए रुको ।
      नोट: बढ़ते मीडिया का उपयोग करने के बाद यह अंय लक्ष्यों के लिए फिर से जांच संभव नहीं होगा ।

Representative Results

चिप के भीतर ंयूरॉन वृद्धि के लगभग 5-7 दिनों के बाद, axonal वृद्धि स्पष्ट है । चिप्स चरण के विपरीत इमेजिंग के साथ संगत कर रहे हैं के रूप में चित्रा 3में प्रदर्शन किया, जो 24 दिनों में ंयूरॉन विकास से पता चलता है. चिप्स भी प्रतिदीप्ति इमेजिंग (चित्रा 4, चित्रा 5, चित्रा 6, और चित्रा 7) के साथ संगत कर रहे हैं । तीन दिन axonal डिब्बे के माध्यम से रेबीज वायरस संक्रमण के बाद, mCherry-axonal डिब्बे में विस्तार axons के साथ सकारात्मक ंयूरॉंस चिप में imaged थे (चित्रा 4) । को डिब्बों अलग fluidically करने की क्षमता का प्रदर्शन, एक कम आणविक वजन फ्लोरोसेंट डाई (Alexa Fluor ४८८ हयद्रज़ीदे) axonal डिब्बे में जोड़ा गया था । इन परिणामों PDMS के लिए तुलना कर रहे हैं-17 चैंबर आधारित है और चरण के लिए प्लास्टिक चिप की उपयुक्तता का प्रदर्शन इसके विपरीत और प्रतिदीप्ति इमेजिंग ।

प्लास्टिक चिप्स और PDMS उपकरणों के साथ न्यूरॉन्स विकास को समझाने के लिए, हम दोनों प्लेटफार्मों में न्यूरॉन्स और समय के साथ न्यूरॉन्स वृद्धि पर नजर रखी. चित्रा 5 संस्कृति में 3 से 22 दिनों के लिए ंयूरॉन विकास से पता चलता है; इन परिणामों के 3 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं । ंयूरॉन विकास संस्कृति में 15 दिनों के लिए दो प्लेटफार्मों के भीतर तुलनीय है, लेकिन अब संस्कृति उंर में (> 21 दिन) प्लास्टिक चिप के भीतर अलग axons कम मनके (चित्र 5) के साथ स्वस्थ दिखाई देते हैं । आगे axonal डिब्बों के भीतर axons कल्पना करने के लिए, हम β-tubulin III जो संस्कृति (चित्रा axonal) में 22 दिनों में प्लास्टिक चिप्स के भीतर स्वस्थ 5B विकास से पता चलता है के लिए immunostained ।

Axon चोट और पुनर्जनन अध्ययन microfluidic compartmentalized उपकरणों का उपयोग कर आम हैं । इन चिप्स का उपयोग कर अध्ययन की उपयुक्तता का प्रदर्शन करने के लिए, प्रतिगामी लेबल ंयूरॉंस से पहले और 24 axotomy के बाद एच छवि थे (6 चित्रा) । एक कर्षण बल्ब और पुनः सृजन axon दोनों स्पष्ट axotomy निंनलिखित हैं । ये परिणाम PDMS-आधारित डिवाइस14,17का उपयोग कर प्रकाशित डेटा के समान हैं ।

Immunocytochemistry एक आम तकनीक है बहु डिब्बा उपकरणों के भीतर प्रदर्शन के लिए प्रोटीन स्थानीयकरण कल्पना । संस्कृति में 24 दिनों के बाद, चिप्स के भीतर ंयूरॉंस तय किया गया और दोनों उत्तेजक और निरोधात्मक synaptic मार्करों, vGlut1 और vGat, क्रमशः (चित्रा 7) के लिए दाग । प्रतिगामी लेबल mCherry न्यूरॉन्स भी imaged (figure 7C) थे. इमेजिंग एक ६० × सिलिकॉन तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ फोकल कताई डिस्क का उपयोग किया गया था, उच्च संकल्प इमेजिंग प्रदर्शन करने की क्षमता का प्रदर्शन । महत्वपूर्ण बात, वृक्ष spins एक बढ़ाया क्षेत्र के भीतर स्पष्ट थे, का प्रदर्शन है कि चिप्स के भीतर संस्कृति ंयूरॉंस परिपक्व synapses बनाने थे ।

Figure 1
चित्रा 1 : एक पूर्व इकट्ठे, प्लास्टिक दो डिब्बे compartmentalizing ंयूरॉंस के लिए microfluidic चिप । (एक) multicompartment चिप के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व ऊपरी और निचले कुओं के स्थानों दिखा । (ख) मुख्य चैनल (या डिब्बों) और microgrooves जो डिब्बों से कनेक्ट दिखा चिप के एक बढ़े हुए योजनाबद्ध । मुख्य चैनल लगभग १.५ मिमी × 7 × ०.०६० मिमी (डब्ल्यू × एल × एच) हैं । चौड़ाई और microgrooves की ऊंचाई लगभग ०.०१ मिमी × ०.००५ मिमी, क्रमशः कर रहे हैं । microgrooves की लंबाई कॉन्फ़िगरेशन के आधार पर भिन्न होता है, ०.१५ मिमी करने के लिए ०.९ mm. (ग) प्रत्येक मुख्य चैनल या fluidically करने की क्षमता का प्रदर्शन डिब्बे में खाद्य रंग डाई युक्त एक प्रतिनिधि multicompartment चिप की एक तस्वीर प्रत्येक चैनल को अलग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : Pipetting तकनीक की जरूरत है जब प्लास्टिक multicompartment चिप्स का उपयोग कर । (क) जब जोड़ और बहाकर के लिए aspirating मीडिया, प्लास्टिक टिप मुख्य चैनल के प्रवेश द्वार से दूर angled के रूप में दिखाया जाना चाहिए । (ख) न्यूरॉन्स लोड करने या axotomy प्रदर्शन करते समय, प्लास्टिक टिप मुख्य चैनल के प्रवेश द्वार की ओर angled किया जाना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : एक चरण विपरीत संस्कृति में 24 दिनों में चिप के भीतर ठेठ ंयूरॉन विकास दिखा micrograph । भ्रूण हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स सही दैहिक डिब्बे में वरीयता प्राप्त थे । 5-7 दिन की शुरुआत में axonal डिब्बे में Axon ग्रोथ दिख रही है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : प्रतिगामी लेबल ंयूरॉंस mCherry फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक्सप्रेस और एक fluidically अलग axonal डिब्बे में axons का विस्तार । (क) एक विलय प्रतिदीप्ति micrograph एक संशोधित mCherry रेबीज वायरस संक्षेप में axonal डिब्बे में लागू के माध्यम से संक्रमित रहते प्रतिगामी लेबल ंयूरॉंस दिखा रहा है । न्यूरॉन्स 3 दिनों के बाद imaged थे संस्कृति में 21 दिनों में संक्रमण । axonal डिब्बे के भीतर एक अलग microenvironment बनाना एक कम आणविक वजन डाई, Alexa Fluor ४८८ हयद्रज़ीदे के आवेदन द्वारा प्रदर्शन किया है । (ख) के एक विलय छवि (ए) एक अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (उद्योग) छवि को चिप के microgrooves क्षेत्र कल्पना सहित । छवियां लेजर फोकल माइक्रोस्कोप एक 30 ×/1.05 एनए सिलिकॉन तेल (ne = १.४०६) उद्देश्य लेंस का उपयोग स्कैनिंग के साथ अधिग्रहीत किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : multicompartment PDMS उपकरणों और प्लास्टिक चिप्स के भीतर ंयूरॉन विकास के साथ-साथ तुलना । (क) दोनों प्लेटफार्मों के चरण कंट्रास्ट माइक्रोग्राफ 3, 7, 15, और संस्कृति में 22 दिनों में लिया । नीचे, एक उच्च आवर्धन 22 दिनों में छवियों से लिया क्षेत्र में दोनों प्लेटफार्मों के भीतर इस उंर में axonal विकास वर्णन शामिल है । Axons चिप के भीतर और अधिक निरंतर कर रहे है और इस उंर में PDMS डिवाइस की तुलना में स्वस्थ दिखाई देते हैं । (ख) संस्कृति में 22 दिनों में axonal यन्त्र और प्लास्टिक चिप दोनों के PDMS डिब्बे के भीतर β-tubulin III सना axons का एक पलटन इम्यूनोफ्लोरेसेंस micrograph । छवियां एक कताई डिस्क फोकल इमेजिंग प्रणाली एक 20x/0.45 एनए उद्देश्य लेंस का उपयोग कर के साथ अधिग्रहीत किया गया । सभी पैमाने सलाखों के १०० µm हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6 : प्लास्टिक multicompartment चिप के भीतर हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के Axotomy और पुनर्जनन. (ऊपर) न्यूरॉन्स एक संशोधित mCherry रेबीज वायरस का उपयोग कर लेबल प्रतिगामी थे और फिर संस्कृति में 24 दिनों में axotomy से पहले छवि । चित्र ' आग ' रंग देखो तालिका का उपयोग कर pseudocolored थे । (नीचे) शीर्ष पैनल में इसी न्यूरॉन इमेज्ड 24 एच पोस्ट-axotomy की इमेज की गई थी । सफ़ेद डैश्ड रेखाएं microgroove बैरियर के किनारों को दिखाती हैं । Axotomy बाईं ओर डैश्ड रेखा के स्थान पर हुई । सफेद arrowhead एक कर्षण बल्ब से पता चलता है । सफेद तीर एक regenerating axon इंगित करता है । छवियां एक कताई डिस्क फोकल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर एक 20 ×/0.45 एनए उद्देश्य लेंस के साथ अधिग्रहीत किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस के बीच Synapses फार्म प्लास्टिक multicompartment चिप्स के भीतर कल्चरल । Immunostaining संस्कृति में 24 दिनों में प्रदर्शन किया और दैहिक एक ६० × सिलिकॉन तेल विसर्जन लेंस का उपयोग डिब्बे के भीतर imaged था । न्यूरॉन्स एक्सप्रेस (क) उत्तेजक synapse मार्कर, vGlut1 (हरा) और (ख) निरोधात्मक synapse मार्कर, vGAT (नीला). (ग) प्रतिगामी लेबल mCherry ंयूरॉंस (लाल) axonal डिब्बे में लागू संशोधित रेबीज वायरस के माध्यम से संक्रमित थे । (घ) vGlut1, vGat, और mCherry की एक मर्जी प्रतिदीप्ति micrograph । (ङ) में बढ़ाया क्षेत्र (घ) एक सफेद बॉक्स के साथ संकेत वृक्ष spins दिखाता है, साइटों है कि अंय ंयूरॉंस से synaptic इनपुट प्राप्त करते हैं । छवियां एक कताई डिस्क फोकल इमेजिंग एक 60 ×/1.3 एनए सिलिकॉन तेल (ne = १.४०६) उद्देश्य लेंस का उपयोग कर प्रणाली के साथ अधिग्रहीत किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्लास्टिक multicompartment चिप्स PDMS multicompartment उपकरण
axons को अलग करना axons को अलग करना
त्यामध्ये microenvironments त्यामध्ये microenvironments
axotomize न्यूरॉन्स axotomize न्यूरॉन्स
ऑप्टिकली पारदर्शी ऑप्टिकली पारदर्शी
उच्च संकल्प इमेजिंग के साथ संगत उच्च संकल्प इमेजिंग के साथ संगत
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संगत प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संगत
पूरी तरह से इकट्ठे सब्सट्रेट करने के लिए विधानसभा की आवश्यकता
स्वस्थ axons > 21 दिन स्वस्थ axons > 14 दिन
हाइड्रोफिलिक संवर्धन भूतल hydrophobic
गॅस अभेद्य गॅस पारगंय
गोल microgrooves और चैनल सीधे microgrooves
कम तैयारी के कदम शीर्ष microgrooves के भीतर धुंधला के लिए हटाने योग्य है
लेजर पृथक के साथ संगत नहीं छोटे अणुओं और कार्बनिक सॉल्वैंट्स के अवशोषण
नहीं खनिज तेल आधारित विसर्जन तेलों के साथ संगत (सिलिकॉन आधारित तेलों ठीक हैं)

तालिका 1: संवर्धन न्यूरॉन्स के लिए प्लास्टिक और PDMS multicompartment प्लेटफार्मों की तुलना.

Discussion

प्लास्टिक multicompartment चिप्स compartmentalizing ंयूरॉंस के लिए एक आसान उपयोग विकल्प प्रदान करते हैं, लंबी अवधि के ंयूरॉंस संस्कृतियों (> 3 सप्ताह) प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल विवरण कैसे संस्कृति cortical और हिप्पोकैम्पस murine ंयूरॉंस इन चिप्स के भीतर । घुलनशील microenvironments का निर्माण और प्रतिगामी लेबल न्यूरॉन्स के लिए कैसे, axotomy प्रदर्शन, और प्रदर्शन immunocytochemistry भी चर्चा की गई । महत्वपूर्ण बात, इन चिप्स उच्च संकल्प, प्रतिदीप्ति, और लाइव इमेजिंग के साथ संगत कर रहे हैं ।

प्लास्टिक multicompartment चिप्स PDMS आधारित compartmentalized उपकरणों के रूप में एक ही कार्य के कई प्रदान करते हैं, लेकिन फायदे, नुकसान, और कुछ भेद सुविधाओं है । तालिका 1 दोनों प्लास्टिक चिप और PDMS-आधारित उपकरणों की एक सुविधा की तुलना प्रदान करता है । और सबसे पहले, चिप्स पूर्व इकट्ठे कर रहे है और स्थाई रूप से हाइड्रोफिलिक, जो गीला की सुविधा, उंहें आसानी से उपयोग कर बना । प्लास्टिक गैस पारगंय नहीं है, PDMS के विपरीत है, तो अगर बुलबुले अप्रत्याशित रूप से चैनलों के भीतर फार्म, वे आसानी से बच नहीं है और हटा दिया जाना चाहिए । मुख्य रूप से इथेनॉल और कुछ अंय स्वामित्व एजेंटों युक्त एक पूर्व कोटिंग समाधान बुलबुला गठन समाप्त ।

अनुमानों के लाइव इमेजिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के transduction निंनलिखित चिप्स (चित्रा 4) के भीतर प्रदर्शन किया था और वहां प्लास्टिक की कोई detectable autofluorescence था । एक चेतावनी है कि विसर्जन तेलों उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्यों के लिए चिप के साथ इस्तेमाल किया सिलिकॉन आधारित तेल, और नहीं खनिज तेल आधारित होना चाहिए । खनिज तेल चक्रीय olefin copolymer के साथ एक प्रतिकूल प्रतिक्रिया पैदा कर सकता है । brightfield इमेजिंग के लिए, यह ध्यान रखें कि चिप में microgrooves सिरों पर गोल कर रहे है और वहां के एक क्रमिक पतला है microgroove बाधा की ओर मुख्य चैनलों की दिशा में कुछ प्रकाश अपवर्तन के कारण या तो अंत में महत्वपूर्ण है brightfield इमेजिंग (चित्रा 3) के दौरान microgrooves । क्योंकि चिप पूर्व इकट्ठे है, माइक्रोन-आकार microgrooves में एंटीबॉडी पैठ असमान हो सकता है (के रूप में स्थाई रूप से बंधुआ PDMS आधारित उपकरणों के साथ); इस प्रकार, मात्रात्मक विश्लेषण निंनलिखित immunostaining चैनलों में किया जाना चाहिए/ microgrooves के भीतर ंयूरॉन अनुमानों के Immunostaining डिब्बों के बीच एक मात्रा अंतर बनाने के द्वारा सुधार किया जा सकता है microgrooves में एंटीबॉडी और fluorophores के प्रवाह को सहायता ।

Disclosures

A.M.T. microfluidic चैंबर के एक आविष्कारक है/चिप (US ७४१९८२२ B2) और Xona Microfluidics, LLC के एक सदस्य है । V.P. Xona Microfluidics, LLC के एक कर्मचारी है । J.H. Xona Microfluidics, LLC के एक सदस्य है । T.N. कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा की । ओपन एक्सेस इस लेख के प्रकाशन Xona Microfluidics द्वारा प्रायोजित है ।

Acknowledgments

लेखक टेलर टूटेगी (Xona), स्मिता Paranjape (UNC-चैपल हिल), जॉइस Ciechanowski (Xona) और ब्रैड टेलर (Xona) से तकनीकी या संपादकीय सहायता स्वीकार करते हैं । लेखक Xona Microfluidics, LLC और मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (R42 MH097377) से समर्थन स्वीकार करते हैं । इमेजिंग आंशिक रूप से NINDS केंद्र अनुदान P30 NS045892 और niched केंद्र अनुदान (U54 HD079124) के फोकल और Multiphoton इमेजिंग कोर सुविधा द्वारा समर्थित था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
XonaChip Xona Microfluidics, LLC XC150 150 µm length microgroove barrier
Xona Microfluidics, LLC XC450 450 µm length microgroove barrier
Xona Microfluidics, LLC XC900 900 µm length microgroove barrier
XC pre-coat  Xona Microfluidics, LLC XC Pre-Coat included with XonaChips
XonaPDL  Xona Microfluidics, LLC XonaPDL
E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats Charles River 24100564
neuronal culture media:
- Neurobasal medium ThermoFisher Scientific 21103049
-B-27 Plus Supplement (50x) ThermoFisher Scientific A3582801
-GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 35050061
-Antibiotic-Antimycotic (100x) ThermoFisher Scientific 15240112
fluorinated ethylene propylene film American Durafilm 50A 0.5 mil thickness
modified rabies virus Salk Institute for Biological Studies G-deleted Rabies-eGFP Material Transfer Agreement required
Salk Institute for Biological Studies G-deleted Rabies-mCherry Material Transfer Agreement required
Alexa Fluor hydrazide 488 ThermoFisher Scientific A10436
Fluoromount G ThermoFisher Scientific 00-4958-02
Glass Pasteur pipettes Sigma-Aldrich CLS7095D5X SIGMA 5.75 in length
hibernate-E Medium ThermoFisher Scientific A1247601
Pierce 16% formaldehyde ThermoFisher Scientific 28906
PBS (10x) ThermoFisher Scientific QVC0508
normal goat serum ThermoFisher Scientific 16210064
triton X-100 ThermoFisher Scientific 28314
anti-vGlut1 antibody NeuroMab 75-066 clone N28/9, 1:100
anti-vGAT antibody Synaptic Systems 131 003 1:1000
anti_beta-tubulin III Aves TUJ 1:1000
Alexa Fluor secondary antibodies ThermoFisher Scientific 1:1000
Incubator, 5% CO2 37 °C
Epifluorescence imaging system EVOS Fluorescence imaging system AMF4300 10x objective
Spinning disk confocal imaging system Andor Technology CSU-X1, iXon X3 EMCCD 60x silicone oil & 20x objectives
Laser scanning confocal imaging system Olympus FV3000RS 30x silicone oil objective

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References

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Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons. J. Vis. Exp. (141), e58421, doi:10.3791/58421 (2018).

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