Summary
Det här protokollet beskriver användningen av plast marker till kultur och kategoriserar primära murina nervceller. Dessa marker är förmonterade, användarvänlig och kompatibel med hög upplösning, levande, och fluorescens imaging. Det här protokollet beskriver hur plåt råtta Hippocampus nervceller inom dessa marker och utföra fluidic isolering, axotomy och immunfärgning.
Abstract
Biochips metoder att kategoriserar nervceller har blivit viktiga verktyg för många neuroforskare. Det här protokollet beskriver användningen av ett kommersiellt tillgängliga förmonterade plast chip för compartmentalizing odlade primära råtta Hippocampus nervceller. Dessa plast marker, som ingår i fotavtryck av ett standard objektglas, är kompatibla med hög upplösning, levande, och fluorescens imaging. Detta protokoll visar hur man retrograd etikett nervceller via isolerade axoner använder en modifierad rabiesvirus kodning en fluorescerande protein, skapa isolerade mikromiljö inom ett fack och utföra axotomy och immuncytokemi på-chip. Nervceller är odlade för > 3 veckor inom plast marker, som illustrerar förenligheten av dessa marker för långsiktiga neuronala kulturer.
Introduction
Traditionella neuron kultur närmar sig resultatet i slumpmässiga utväxt av axoner och dendriter, som hindrar studiet av nervceller i deras unika polariserade morfologi. Biochips multicompartment enheter har blivit väl etablerade och välanvända forskningsverktyg för neuroforskare under de senaste 10-15 år (utvalda högprofilerade publikationer finns refererade1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). dessa enheter kategoriserar nervceller och tillhandahålla en metod för att fysiskt och kemiskt manipulera subcellulär regioner av nervceller, inklusive somata, dendriter, axoner och synapser18,19. De ger också flera experimentella paradigm som inte är möjligt med hjälp av slumpmässiga kulturer, inklusive studier av axonal transport, axonal proteinsyntes, axon skada/förnyelse och axon-till-soma signalering. Den grundläggande 2-fack-konfigurationen består av två parallella mikroflödessystem kanaler åtskilda av en rad mindre vinkelrätt microgrooves. Primär eller stamceller-derived nervceller är klädd i en mikroflödessystem kanal, kvitta och bifoga till undersidan av enheten och förlänga neuriter under loppet av dagar. Många tillväxt kottar finna sin väg in i microgrooves, som är tillräckligt små för att de förhindrar cell organ kommer in. Eftersom tillväxten kottar är fysiskt begränsad och oförmögen att vända inom microgrooves, växer de rakt in i den angränsande fack (axonal fack) där de är isolerade.
Historiskt har är dessa enheter har varit gjuten med poly(dimethylsiloxane) (PDMS) från en photolithographically mönstrade herre mögel och antingen gjord in-house i utredarnas laboratorier eller köpt kommersiellt. En av de viktigaste nackdelarna med att använda PDMS är dess vattenavvisande egenskaper20. PDMS kan göras hydrofil tillfälligt, men sedan blir snabbt hydrofoba inom timmar i en icke vattenhaltigt miljö20. På grund av detta, måste enheter vara anslutna till ett täckglas eller andra lämpliga substrat vid tidpunkten för användningen. Förmonterade plast multicompartment marker finns nu kommersiellt tillgängliga (t.ex., XonaChips) i formsprutad plast. Dessa chips görs permanent hydrofil, förenkla enhet vätning och låta före montering av chip med en tunn film av cyklisk olefin copolymer (COC) omslutande mikroflödessystem kanalerna på botten. Dessa marker är tillverkade i ett optiskt transparent plast som är lämplig för högupplösta fluorescens imaging.
Syftet med detta protokoll är att demonstrera användningen av förmonterade plast mikroflödessystem marker för flera experimentella paradigm utförs med murin Hippocampus eller kortikala nervceller. Det här protokollet beskriver hur man retrograd etikett nervceller använder en modifierad rabiesvirus inom chip. Axotomy för studier av axon skada och regenerering beskrivs också. Avslutningsvis visar detta protokoll hur man utför fluorescens immunfärgning med enheten.
Protocol
Obs: En schematisk av plast multicompartment chip visas i figur 1A, B. Chipet är storleken på ett standard objektglas (75 mm × 25 mm). Funktioner i chipet, inklusive större kanaler eller fack, brunnar och microgrooves är märkta och tillhandahålls för framtida referens. Figur 1 c är ett fotografi av chip visar fluidic isolering av facken.
1. beredning och beläggning av Multicompartment Chips
- I ett biosäkerhet skåp, placera chipet i en petriskål eller annan lämplig steril behållare.
- Tillsätt 100 µL före beläggning lösning till det övre vänstra väl av chip och låt det rinna genom den viktigaste kanalen till den angränsande väl.
Obs: Före beläggning lösningen används till pre päls mikroflödessystem kanalerna för att eliminera risken för svällning luftbubblor inom chip. - Fyll lägst lämnade väl med 100 µL före beläggning lösning. Vänta 5 min så att lösningen att flöda genom microgrooves.
- Tillsätt 100 µL före beläggning lösning till övre rätt väl och låt det rinna genom den viktigaste kanalen till den angränsande väl. Fyll den lägsta rätt väl med 100 µL före beläggning lösning.
- Aspirera lösningen från varje brunn. Aspirera från de viktigaste kanalerna för att undvika att ta bort vätska från de främsta kanalerna (figur 2A). Tillsätt omedelbart 150 µL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) i det övre vänstra väl. Vänta 1,5 min.
Varning: Inte aspirera all vätska från de slutna huvudsakliga kanalerna. - Tillsätt 150 µL PBS till nedre vänster väl. Vänta 5 min så att vätska att flöda genom microgrooves. Tillsätt 150 µL PBS till övre rätt väl. Tillsätt 150 µL PBS till lägre rätt väl. Vänta 10 min.
- Upprepa steg 1.5-1.6 för en andra PBS-tvätt.
- Kontrollera chip i vävnadsodling Mikroskop för bubblor i de största kanalerna. Om det finns bubblor utför procedurerna nedan. Om inga bubblor är närvarande, hoppa till steg 1,9.
- Aspirera PBS från brunnarna angling Pipettera spets från kanalen öppnas (figur 2A).
- Dispensera 100 µL före beläggning lösning i övre brunnen, angling spetsen av Pipettera nära kanalen öppnas (figur 2B). Bubblorna bör flytta genom kanalen i nedre brunnen. Vänta 1,5 min.
- Upprepa steg 1.3-1.8.
- Aspirera PBS från brunnarna angling Pipettera spets från kanalen öppnas (figur 2A).
- Tillsätt 100 µL 0,5 mg/mL poly d-lysin (PDL) till det övre vänstra väl av chipet. Vänta 1,5 min. Fyll lägst lämnade väl med 100 µL av PDL.
- Tillsätt 100 µL av PDL till övre rätt väl av chipet. Vänta 1,5 min. Tillsätt 100 µL till den lägsta rätt väl.
- Stäng petriskål och placera chipet i en inkubator vid 37 ° C för 1 h.
- Upprepa PBS tvätta steg 1.5-1.6 två gånger för att ta bort överflödig PDL.
- Aspirera PBS från enheten.
- Tillsätt omedelbart 100 µL av cell kultur media i det övre vänstra väl av chip. Vänta 1,5 min. Lägg till media till nedre vänstra väl. Lägga till media till övre rätt väl. Vänta 1,5 min. Tillsätt 100 µL medium till lägre rätt väl av chipet.
- Placera chipet i 37° C inkubatorn tills redo att platta celler.
2. sådd nervceller i Multicompartment marker
- Förbered cellsuspension av dissocierade råtta Hippocampus nervceller enligt fastställda protokoll21,22 till ger en densitet på ~ 12 × 106 celler/mL.
Observera: Användning av cell suspension densiteter mellan 3 och 12 × 106 celler/mL är möjligt. Om du använder en lägre täthet ökas volymen av cellsuspensionen läggas till chip (se nedan). Anvisningarna nedan gäller för murina dissocierade kortikala eller Hippocampus nervceller. Optimal cell densiteter för andra neuron typer kan variera. - Ta bort majoriteten av media i varje brunn av chip, lämnar ca 5 µL i varje brunn. Aspirera från de viktigaste kanalerna för att undvika att ta bort vätska från de främsta kanalerna (figur 2A).
Varning: Inte aspirera vätska från slutna huvudsakliga kanaler. Luftbubblor kan fastna i chip om vätska är aspirerade från de största kanalerna. - Ladda 5 µL cellsuspension i övre rätt väl och en annan 5 µL cellsuspension i lägre rätt väl (~ 120 000 celler totalt). Ladda cellerna genom att man avskaffar nära den främsta kanalen (figur 2B). Kolla under ett mikroskop för att säkerställa nervceller i huvudkanalen. Vänta 5 min så att cellerna att bifoga.
Obs: Nervceller kan laddas i endera facket. För förklaring, somatiska kupén är den främsta kanalen på höger sida, men antingen fack kan användas som somatiska facket. Användning av lägre cell tätheter ner till 60 000 celler per chip är möjligt. Upp till 10 µL av cell suspension kan läggas till varje väl av det somatiska facket i kombination med en cellsuspension med färre celler än ovan. - Lägg till ca 150 µL av neuronala kultur media till var och en av de övre och nedre höger brunnar och sedan Tillsätt 150 µL av media till var och en av de övre och nedre vänster brunnar. Placera chipet i befuktade fack i en 5% CO2 37 ° C inkubator.
- Efter 24 h, utföra en media förändring genom att ta bort medier från brunnarna. Kontrollera den viktigaste kanalen fortfarande är fylld. Tillsätt 150 µL media i varje topp brunn, och sedan fylla botten brunnarna.
- Placera chipet tillbaka i inkubatorn för önskat antal dagar.
Obs: Övervaka medierna varje par dagar att se till att det förblir ljus rosa. Byt 50% av det med färska media om media är gulaktig. Om vätskenivån är låg, se till att det finns tillräcklig fuktighet och lämpliga sekundär inneslutning av chips att förhindra avdunstning. Minimera, eller till och med eliminera, media ändringar är möjligt använda sekundär inneslutning och/eller täcker skålen som innehåller chip med polytetrafluoreten (PTFE)-FEP film.
3. retrograd märkning av nervceller inom Chip
Obs: Retrograd märkning kan utföras med hjälp av flera tekniker, inklusive använder modifierade kolera toxin och rabies virus. Nedan instruktioner för märkning nervceller använder G-raderade Rabies-mCherry eller -andra virus. Hantera potentiellt smittsamt enligt lokala organisationens riktlinjer. Ytterligare utbildning kan krävas.
- Varma färska neuronala kultur media till 37 ° C. Uppskatta ~ 400 µL av media per chip.
- Späd ut 100.000 viral enheter av modifierade rabiesvirus i sammanlagt 50 µL med media som tas antingen från väl av axonal facket.
Obs: Lämna tips och rör i kontakt med viruset enligt organisation-godkända protokoll. - Försiktigt Pipettera återstående media från brunnarna av axonal fack och förvaras i en centrifug tube vid 37 ° C.
- Häll 150 µL färska varma media och de 50 µL utspädda virus i axonal facket. Inkubera under 2 timmar vid 37 ° C inkubator.
- Ta bort media som innehåller virus och kassera det ordentligt.
Obs: Luftbubblor kan fastna i chip om vätska är aspirerade från de största kanalerna. - Försiktigt lägga 75 µL av färska media till en axon väl och låt det rinna till andra axon väl.
- Ta bort genomströmning från andra axon väl och släng ordentligt.
- Upprepa steg 3.6 och 3.7 en gång.
- Lägg tillbaka lagrad media till axonal facket. Lägg till cirka 50 µL färska media, om nödvändigt, att upprätthålla tillräckliga volymer och återgå cellerna till inkubatorn.
Obs: Fluorescerande proteinuttryck syns av 48 h och kvarstår i upp till 8 dagar. Nervceller kan avbildas i upp till 30 min i rumstemperatur i neuronala kultur media. Kultur media kan också ersättas med värmde CO2-oberoende övervintra E med B27 och avbildas för längre. Nervceller kan också avbildas inom en väl fuktad miljö kammare vid 37 ° C och 5% CO2. I det här fallet är befuktning avgörande för att minimera avdunstningsförluster inom marker, som förvärras av värme och kan äventyra neuron hälsa.
4. fluidic isolering av Axonal facket inom Chip
- Ta bort 20 µL från nedre vänster väl i axonal fack och plats i övre högra brunnen av somatiska facket. Vänta 2 min för flöde inom varje kanal temperera.
- Ta bort 50 µL av media från axonal facket. Tillsätt 0,3 µL 1 mM Alexa Fluor 488 maleinhydrazid i detta media, blanda via Pipettera och återgå till axonal facket. Chipet är redo för avbildning.
Obs: Andra föreningar av intresse kan läggas. Lägga till ett fluorescerande färgämne med liknande molekylvikt som sammansatta av intresse rekommenderas för att övervaka fluidic isolering över tid.
5. utför Axotomy inom Chip
- Ta bort medier från axonal facket att Pipettera spetsen från ingången av den främsta kanalen (figur 2A) och förvara den i ett centrifugrör.
- Aspirera axonal facket helt, placera den aspiration Pipettera nära antingen hänrycka av den främsta kanalen av axonal facket (figur 2B). Fortsätt aspiration för 1-2 min. Kontrollera att lösningen är helt bort från facket.
Obs: Vakuum trycket för aspiration måste vara minst 18 tums-Hg för axotomy förfarandet ska fungera korrekt. - Ersätta axonal facket med lagrad media och bekräfta att axoner undertrckande genom att titta på chipet under ett mikroskop.
Obs: Om bubblor bildar i axonal facket när du byter media, upprepa steg 5,1-5,2. - Tillbaka chipet till inkubatorn.
6. fluorescens immunfärgning inom Chip
- Förbered 4% formaldehydlösning fixering i PBS (4% formaldehyd, 1 µM MgCl2, 0.1 µm CaCl2, 120 mM sackaros)
- Ta bort de flesta medier i brunnarna av chip (torka inte invändiga fack).
- Tillsätt omedelbart 100 µL av fixering lösning i övre brunnarna i de axonal och somatiska avdelningarna.
- Efter 1 min, tillsätt 100 µL av fixering lösning till botten brunnarna. Fix för 30 min i rumstemperatur.
- Ta bort de flesta av lösningen från brunnarna av chip (torka inte invändiga fack). Tillsätt omedelbart 150 µL av PBS till varje topp brunnarna i de axonal och somatiska avdelningarna. Vänta 2 min för PBS att flöda i botten brunnar.
- Upprepa steg 6,5 två gånger.
- Ta bort de flesta av PBS från brunnarna av chip. Tillsätt omedelbart 150 µL av PBS med 0,25% TritonX-100 till varje topp brunnarna i de axonal och somatiska avdelningarna. Vänta 15 min.
- Ta bort de flesta av vätskan från brunnarna av chip och omedelbart lägga 150 µL blockerande lösning (10% normala get serum i PBS) till var och en av topp brunnarna i de axonal och somatiska avdelningarna. Vänta 15 min.
Obs: Effektiva blockerande lösningar bör vara specifika för den sekundära antikroppen, t.ex., för en åsna anti får sekundär antikropp, Använd åsna serum i blockerande lösningen. - Ta bort de flesta av vätskan från brunnarna av chip och omedelbart Tillsätt 100 µL av primär antikropp (eller antikroppar) i 1% normala get serum i PBS till varje topp brunnarna i de axonal och somatiska avdelningarna. Täcka för att minimera avdunstning och vänta 1 h i rumstemperatur eller 4 ° C över natten.
- Ta bort de flesta av lösningen från brunnarna av chip (torka inte invändiga fack). Tillsätt omedelbart 150 µL av PBS till varje topp brunnarna i de axonal och somatiska avdelningarna. Vänta 5 min för PBS att flöda i botten brunnar.
- Upprepa steg 6.10 två gånger.
- Ta bort de flesta av vätskan från brunnarna av chip och omedelbart Tillsätt 100 µL av sekundär antikropp (eller antikroppar) i PBS till varje topp brunnarna i de axonal och somatiska avdelningarna. Täcka för att minimera avdunstning och vänta 1 h i rumstemperatur.
Obs: Se tillverkarens instruktioner för Rekommenderad spädning av sekundära antikroppar. - Upprepa steg 6.10-6.11.
- Om imaging inom 1 dag efter immunfärgning, hålla chip fylld med PBS. Om chip kommer att lagras längre än 1 dag innan imaging, wrap skålen som innehåller chip i paraffin film för att förhindra avdunstning och förvaras vid 4 ° C tills det att bilden.
- Längre sikt förvaring av prover, kan montering media (t.ex., Fluoromount-G) användas.
- Ta bort de flesta av vätskan från brunnarna av chip. Använd en 1 mL disponibel plast Pipettera lägga till 2 droppar montering media till varje topp brunnarna i de axonal och somatiska avdelningarna.
- Luta chipet för att uppmuntra flödet av montering media genom kanaler. Tillsätt 2 droppar till botten brunnarna efter 5 min. Vänta 1 h innan imaging.
Obs: Efter att ha använt montering media det kommer inte vara möjligt att åter probe för andra mål.
Representative Results
Efter ca 5-7 dagar av neuron tillväxt inom chip är axonal tillväxt uppenbart. Markerna är kompatibla med faskontrast imaging vilket visas i figur 3som visar neuronal tillväxt på 24 dagar. Markerna är också kompatibla med fluorescens imaging (figur 4, figur 5, figur 6och figur 7). Tre dagar efter rabies virusinfektion via axonal facket, var mCherry-positiv nervceller med axoner förlänga i axonal facket avbildade i chip (figur 4). För att demonstrera förmågan att fluidically isolera fack, lades ett lågmolekylärt fluorescerande färgämne (Alexa Fluor 488 maleinhydrazid) till axonal facket. Resultaten är jämförbara med PDMS-baserade kammare17 och påvisa lämpligheten av plast chip för faskontrast och fluorescens imaging.
För att illustrera neuronal tillväxt med plast marker och PDMS enheter, vi odlade nervceller i båda plattformarna och övervakas neuronal tillväxt över tid. Figur 5 visar neuronal tillväxt från 3 till 22 dagar i kultur; dessa resultat är representativa för 3 oberoende experiment. Neuronal tillväxt är jämförbara inom två plattformar upp till 15 dagar i kultur, men vid längre kultur åldrar (> 21 dagar) isolerade axoner inom plast chip visas friskare med mindre beading (figur 5A). Att ytterligare visualisera axoner inom axonal facken, vi immunostained för β-tubulin III som visar sund axonal tillväxt inom plast marker på 22 dagar i kultur (figur 5B).
Axon skada och förnyelse studier är vanliga använder mikroflödessystem uppdelade enheter. För att påvisa lämpligheten av dessa studier använder marker, retrograd märkt nervceller var avbildade innan och 24 h efter axotomy (figur 6). En dementi glödlampa och regenererande axon är båda uppenbart följande axotomy. Dessa resultat är likvärdiga med publicerade data med hjälp av PDMS-baserade enheter14,17.
Immuncytokemi är en vanlig teknik som utförs inom flera brandceller enheter att visualisera protein lokalisering. Efter 24 dagar i kultur, nervceller inom marker var fixeras och färgas för både retande och hämmande synaptisk markörer, vGlut1 och vGat, respektive (figur 7). Retrograd märkta mCherry nervceller var också avbildad (figur 7 c). Imaging utfördes med hjälp av spinning disk confocal med en 60 × silikon oljeimmersionsobjektivet, demonstrera förmågan att utföra högupplösta imaging. Ännu viktigare, var Dendritutskotten uppenbara inom en förstorad region, visar att de nervceller som odlade inom marker bilda mogna synapser.
Figur 1 : En förmonterade, plast två-fack mikroflödessystem chip för compartmentalizing nervceller. (A) Schematisk bild av multicompartment chip visar platser med övre och nedre brunnarna. (B) en utvidgad Schematisk av chip visar de viktigaste kanaler (eller fack) och microgrooves som förbinder facken. Större kanaler är cirka 1,5 mm × 7 × 0.060 mm (B × L × H). Bredden och höjden av microgrooves är cirka 0,01 mm × 0,005 mm, respektive. Microgrooves längd varierar beroende på konfiguration, 0,15 mm till 0.9 mm. (C) A fotografi av en representativ multicompartment chip som innehåller Livsmedelsfärgämnen färgämne i varje huvudkanal eller demonstrera förmågan att fluidically isolera varje kanal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Pipettering tekniker behövs när du använder plast multicompartment marker. (A) när du lägger till och aspirera media för tvättar, Pipettera spetsen ska vinklas från ingången av den främsta kanalen som visas. (B) när lastning nervceller eller utför axotomy, Pipettera tipset bör vara vinklad mot ingången till den främsta kanalen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : En fas kontrast Mikrograf visar typiska neuronal tillväxt inom chip på 24 dagar i kultur. Embryonala Hippocampus nervceller seedade i just somatiska facket. Axon tillväxt syns i axonal fack början på 5-7 dagar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Retrograd märkt nervceller express mCherry fluorescerande protein och förlänga axoner i en fluidically isolerade axonal facket. (A) en sammanslagna fluorescens Mikrograf visar levande retrograd märkt nervceller smittade via en modifierad mCherry rabiesvirus kort tillämpas i axonal facket. Neuroner var avbildad 3 dagar efter infektion 21 dagar i kultur. Att skapa en isolerad mikromiljö inom axonal facket demonstreras genom tillämpning av ett lågmolekylärt färgämne, Alexa Fluor 488 maleinhydrazid. (B) en sammanslagen bild av (A) inklusive en differentiell störningar kontrast (DIC) bild för att visualisera microgrooves regionen av chip. Bilder förvärvades med laserscanning confocal Mikroskop använder en 30 × / 1,05 N.A. silikonolja (ne = 1.406) objektiv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Sida-vid-sida jämförelse av neuronal tillväxt inom multicompartment PDMS enheter och plast marker. (A) fas kontrast micrographs av båda plattformarna som tas vid 3, 7, 15 och 22 dagar i kultur. En högre förstoring region tas från bilderna på 22 dagar ingår på botten, att illustrera axonal tillväxt vid denna ålder inom båda plattformarna. Axoner inom chip är mer kontinuerlig och visas friskare än i PDMS enheten vid denna ålder. (B) en invert immunofluorescens Mikrograf β-tubulin III målat axoner inom axonal kupén både PDMS enhet och plast chip 22 dagar i kultur. Bilder förvärvades med en snurrande disk confocal imaging system använder en 20 x / 0,45 N.A. objektiv. Alla skala barer är 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6 : Axotomy och regenerering av hippocampus nervceller inom plast multicompartment chip. (Överst) Neuroner var retrograd märkt med hjälp av en modifierad mCherry rabiesvirus och sedan avbildas innan axotomy på 24 dagar i kultur. Bilderna var pseudocolored använda tabellen 'Eld' färg look-up. (Botten) Samma neuron avbildas i den övre panelen var avbildad 24 h post-axotomy. Vita streckade linjer visar kanterna på microgroove barriären. Axotomy inträffade vid platsen för den vänstra streckad linjen. Vita pilspetsen visar en dementi glödlampa. Den vita pilen indikerar en regenererande axon. Bilder förvärvades med en snurrande disk confocal imaging system använder en 20 × / 0,45 N.A. objektiv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Synapser form mellan Hippocampus nervceller odlade inom plast multicompartment chips. Immunfärgning utfördes på 24 dagar i kultur och avbildas inom somatisk kupén med en 60 × silikon olja nedsänkning objektiv. Nervceller express (A) excitatorisk synaps markör, vGlut1 (grön) och (B) hämmande synaps markör, vGAT (blå). (C) Retrograde märkt mCherry nervceller (röd) var smittade via modifierade rabiesvirus tillämpas i axonal facket. (D) en sammanslagna fluorescens Mikrograf vGlut1, vGat och mCherry. (E) regionen förstorade i (D) anges med en vit ruta visar Dendritutskotten, webbplatser som får synaptisk input från andra nervceller. Bilder förvärvades med en snurrande disk confocal imaging system använder en 60 × / 1.3 N.A. silikonolja (ne = 1.406) objektiv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Plast multicompartment chips | PDMS multicompartment enheter |
| isolera axoner | isolera axoner |
| upprätta mikromiljö | upprätta mikromiljö |
| axotomize nervceller | axotomize nervceller |
| optiskt transparent | optiskt transparent |
| kompatibel med hög upplösning imaging | kompatibel med hög upplösning imaging |
| kompatibel med fluorescensmikroskopi | kompatibel med fluorescensmikroskopi |
| färdigmonterad | montering till substrat krävs |
| friska axoner > 21 dagar | friska axoner > 14 dagar |
| hydrofil odlingsskålar yta | hydrofoba |
| gas ogenomtränglig | gas permeabla |
| rundade microgrooves och kanaler | raka microgrooves |
| färre förberedelser | toppen är flyttbara för färgning inom microgrooves |
| inte kompatibel med laser ablation | absorptionen av små molekyler & organiska lösningsmedel |
| inte kompatibel med mineralolja-baserade nedsänkning oljor (silikonbaserat oljor är bra) |
Tabell 1: Jämförelse av plast och PDMS multicompartment plattformar för odling neuroner.
Discussion
Plast multicompartment marker ger en lätt-till-använda alternativet för compartmentalizing nervceller, som tillhandahåller långsiktiga neuronala kulturer (> 3 veckor). Detta protokoll Detaljer hur man kultur kortikala och Hippocampus murina nervceller inom dessa marker. Skapandet av lösliga mikromiljö och hur retrograd etikett nervceller, axotomy, och utföra immuncytokemi diskuterades också. Ännu viktigare, dessa marker är kompatibla med högupplösta, fluorescens och levande imaging.
Plast multicompartment marker ger många av samma funktioner som de PDMS-baserade uppdelade enheterna, men har fördelar, nackdelar och vissa utmärkande dragen. Tabell 1 ger en funktionsjämförelse av både plast chip och PDMS-baserade enheter. Först och främst är marker förmonterade och gjort permanent hydrofil, vilket underlättar vätning, vilket gör dem lättare att använda. Plasten är inte gas permeabla, till skillnad från PDMS, så om bubblor bildar oväntat inom kanalerna, de lätt undgår inte och måste tas bort. En före beläggning lösning innehållande främst etanol och några andra egenutvecklade agenter eliminerar bubbla bildandet.
Bor avbildning av projektioner följande transduktion av fluorescerande proteiner utfördes inom marker (figur 4) och det var inga detekterbara autofluorescens av plast. En varning är att nedsänkning oljor används med chip för höga numeriska bländaröppningen mål måste vara silikonolja baserat och inte mineralolja baserat. Mineralolja kan orsaka en biverkning med den cyklisk olefin copolymer. För brightfield imaging, det är viktigt att notera att microgrooves i kretsen är avrundade ändar och det finns en gradvis nedtrappning av z-riktningen av de viktigaste kanalerna gentemot microgroove barriären orsakar vissa ljusbrytning i vardera änden av den microgrooves under brightfield imaging (figur 3). Eftersom chipet är förmonterade, antikropp genomträngningen in i micron stora microgrooves kan vara ojämn (som med permanent bundna PDMS-baserade enheter); kvantitativ analys efter immunfärgning bör således utföras i kanaler/fack. Immunfärgning av neuronala prognoser inom microgrooves kan förbättras genom att skapa en volymskillnad mellan facken att underlätta flödet av antikroppar och fluorophores in microgrooves.
Disclosures
A.M.T. är uppfinnare av mikroflödessystem kammaren/chip (oss 7419822 B2) och är medlem i Xona Microfluidics, LLC. V.P. är anställd i Xona Microfluidics, LLC. J.H. är medlem i Xona Microfluidics, LLC. T. förklarar inget konkurrerande finansiella intressen. Öppna publikationen av denna artikel är sponsrad av Xona Microfluidics.
Acknowledgments
Författarna erkänner tekniska eller redaktionella stöd från Taylor Wilt (Xona), Smita Paranjape (UNC-Chapel Hill), Joyce Ciechanowski (Xona) och Brad Taylor (Xona). Författarna erkänner stöd från Xona Microfluidics, LLC och National Institute of Mental Health (R42 MH097377). Imaging stöddes delvis av de Confocal och Multiphoton Imaging Core Facility av NINDS Center Grant P30 NS045892 och NICHD Center Grant (U54 HD079124). Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
| Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
| Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
| XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
| XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
| E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
| neuronal culture media: | |||
| - Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
| -B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
| -GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| -Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
| fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
| modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
| Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
| Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
| Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
| hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
| PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
| normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
| triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
| anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
| anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
| anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
| Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
| Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
| Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
| Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
| Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |
References
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Virlogeux, A., et al. Reconstituting Corticostriatal Network on-a-Chip Reveals the Contribution of the Presynaptic Compartment to Huntington's Disease. Cell Reports. 22 (1), 110-122 (2018).
- Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell Reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).
- Yang, Y., et al. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61 (6), 880-894 (2009).
- Sutton, M. A., Taylor, A. M., Ito, H. T., Pham, A., Schuman, E. M. Postsynaptic decoding of neural activity: eEF2 as a biochemical sensor coupling miniature synaptic transmission to local protein synthesis. Neuron. 55 (4), 648-661 (2007).
- Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nature Cell Biology. 11 (8), 1024-1030 (2009).
- Sharma, N., et al. Long-distance control of synapse assembly by target-derived NGF. Neuron. 67 (3), 422-434 (2010).
- Harrington, A. W., et al. Recruitment of actin modifiers to TrkA endosomes governs retrograde NGF signaling and survival. Cell. 146 (3), 421-434 (2011).
- Zhang, Y., et al. Assembly and maintenance of nodes of ranvier rely on distinct sources of proteins and targeting mechanisms. Neuron. 73 (1), 92-107 (2012).
- Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal translation of beta-catenin regulates synaptic vesicle dynamics. The Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
- Tran, H. T., et al. Alpha-synuclein immunotherapy blocks uptake and templated propagation of misfolded alpha-synuclein and neurodegeneration. Cell Reports. 7 (6), 2054-2065 (2014).
- Calafate, S., et al. Synaptic Contacts Enhance Cell-to-Cell Tau Pathology Propagation. Cell Reports. 11 (8), 1176-1183 (2015).
- Cosker, K. E., Fenstermacher, S. J., Pazyra-Murphy, M. F., Elliott, H. L., Segal, R. A. The RNA-binding protein SFPQ orchestrates an RNA regulon to promote axon viability. Nature Neuroscience. 19 (5), 690-696 (2016).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Pinto, M. J., et al. The proteasome controls presynaptic differentiation through modulation of an on-site pool of polyubiquitinated conjugates. The Journal of Cell Biology. 212 (7), 789-801 (2016).
- Bigler, R. L., Kamande, J. W., Dumitru, R., Niedringhaus, M., Taylor, A. M. Messenger RNAs localized to distal projections of human stem cell derived neurons. Scientific Reports. 7 (1), 611 (2017).
- Nagendran, T., et al. Distal axotomy enhances retrograde presynaptic excitability onto injured pyramidal neurons via trans-synaptic signaling. Nature Communications. 8 (1), 625 (2017).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. What are its weaknesses, and which other polymers can researchers add to their toolboxes? Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , Second edition, MIT Press. (1998).
