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Biology

प्रवाह Cytometry द्वारा Dictyostelium discoideum Macropinocytosis का उच्च-प्रवाह मापन

Published: September 10, 2018 doi: 10.3791/58434
Automatic Translation
1, 1
1MRC-Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK

Summary

Macropinocytosis, बड़े पैमाने पर गैर विशिष्ट द्रव, इम्यूनोलॉजी, संक्रमण, कैंसर, और neurodegenerative रोगों सहित नैदानिक जीव विज्ञान के कई क्षेत्रों में महत्वपूर्ण है । यहां, मौजूदा तकनीकों में macropinocytosis के उच्च प्रवाह, एकल-कक्ष रिज़ॉल्यूशन माप की अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया है macropinocytosis मॉडल जीव Dictyostelium प्रवाह cytometry का उपयोग discoideum ।

Abstract

macropinocytosis द्वारा बड़े पैमाने पर गैर विशिष्ट द्रव के ऊपर उठाना कुछ कैंसर कोशिकाओं के प्रसार के लिए महत्वपूर्ण है, प्रतिजन नमूना, मेजबान सेल आक्रमण और neurodegenerative रोगों के प्रसार. अमीबा Dictyostelium discoideum के आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रयोगशाला उपभेदों अत्यंत उच्च द्रव तेज दर जब पोषक तत्व मध्यम में उगाया जाता है, जिनमें से ९०% से अधिक macropinocytosis के कारण है । इसके अलावा स्तनधारी macropinocytosis के कई जाने-माने कोर कंपोनेंट्स भी मौजूद हैं, जिससे macropinocytosis की पढ़ाई के लिए यह एक बेहतरीन मॉडल सिस्टम बना है । यहां, मानक एक लेबल के रूप में फ्लोरोसेंट dextran का उपयोग तरल पदार्थ को मापने के लिए तकनीक एक ९६-अच्छी प्लेट प्रारूप के लिए अनुकूलित है, नमूने के साथ प्रवाह cytometry एक उच्च प्रवाह नमूना (HTS) लगाव का उपयोग करके विश्लेषण किया ।

कोशिकाओं को एक पूर्व समय की लंबाई निर्धारित के लिए गैर अतृप्त फ्लोरोसेंट dextran खिलाया, बर्फ में विसर्जन से धोया-ठंड बफर और 5 मिमी सोडियम azide, जो भी exocytosis बंद हो जाता है का उपयोग कर अलग कर रहे हैं । प्रत्येक कुआं में कोशिकाओं को फिर प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । विधि भी झिल्ली को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और फ्लोरोसेंट मोती या बैक्टीरिया के phagocytosis ।

इस विधि के लिए एक उच्च प्रवाह, श्रम और संसाधन कुशल तरीके से Dictyostelium द्वारा द्रव तेज की माप की अनुमति के लिए डिज़ाइन किया गया था । यह कई उपभेदों की एक साथ तुलना की अनुमति देता है (एक जीन की नॉकआउट म्यूटेंटउदाहरण के लिए) और शर्तों (विभिंन मीडिया मेंउदाहरण के लिए कोशिकाओं या अवरोध करनेवाला के विभिंन सांद्रता के साथ इलाज) समानांतर में और समय-पाठ्यक्रमों को सरल ।

Introduction

macropinocytosis द्वारा बड़े पैमाने पर गैर विशिष्ट द्रव के ऊपर उठाना कई जैविक संदर्भों में महत्वपूर्ण है1, प्रतिजन प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा नमूना सहित2, होस्ट कोशिकाओं में रोगज़नक़ प्रवेश3, कैंसर सेल प्रसार4 और prion रोगों का प्रसार5. स्तनधारी और Dictyostelium कोशिकाओं में, actin6,7, PI (3, 4, 5) p8,9,10 (हालांकि लिपिड की सटीक प्रकृति दो11के बीच अलग है), सक्रिय रास12,13, और सक्रिय आरएसी14,15 macropinocytosis द्वारा कुशल तरल पदार्थ के लिए महत्वपूर्ण हैं, हालांकि वहां रहने के बारे में कई अनुत्तरित प्रश्न कैसे macropinocytic पैच है का गठन, संगठित और अंततः आंतरिक । अधिक macropinocytosis के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन की खोज, और कैसे वे विभिंन जैविक संदर्भों में महत्वपूर्ण है के बाद के निर्धारण, macropinocytosis की एक और अधिक व्यापक समझ दे और संभवतः के विकास की अनुमति देगा स्थितियों की एक सीमा के लिए लक्षित उपचार ।

Dictyostelium macropinocytosis के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली है । मानक प्रयोगशाला उपभेदों में गठित macropinocytosis के उच्च स्तर का मतलब है कि द्रव तेज macropinocytosis6के कारण ९०% से अधिक है । यह macropinocytosis केवल द्रव का निर्धारण द्वारा मापा जा करने के लिए अनुमति देता है, स्तनधारी कोशिकाओं के विपरीत, जहां macropinocytosis के कारण तरल पदार्थ का अनुपात काफी कम है । कि macropinocytosis इतनी अच्छी तरह से परिभाषित है और आसानी से इस प्रणाली में12 visualized इसी तरह अंय प्रणालियों पर macropinosome के कोर संरक्षित घटकों की जांच के लिए अलग लाभ प्रदान करता है जहां कई विनियामक संकेत हो सकता है 16 , 17. शी.

मानक तकनीक स्तनधारी कोशिकाओं द्वारा macropinocytosis मापने के लिए इस्तेमाल किया समय की एक छोटी अवधि के लिए सूक्ष्मता के बाद एक सेल है कि dextran द्वारा कब्जा कर लिया है के क्षेत्र निर्धारित करने के लिए dextran के साथ स्पंदन के बाद कोशिकाओं फिक्सिंग शामिल है-सकारात्मक बुलबुले18। इस तकनीक को हालांकि सेल, जो19 Dictyosteliumमें सूचित किया गया है में प्रवेश करने पर सिकुड़ते macropinosomes की संभावना के लिए खाते में नहीं है, और केवल खाते में सेल के एकल विमानों लेता है, आंतरिक मात्रा अर्थ अस्पष्ट है । एक वैकल्पिक तकनीक, एक निश्चित समय में आंतरिक macropinosomes की संख्या की गिनती की, एक ही नकारात्मक पक्ष20है । Dictyostelium का उपयोग इन समस्याओं से बचा जाता है; हालांकि, Dictyostelium द्वारा द्रव को मापने के लिए मौजूदा तकनीक अपेक्षाकृत गहन श्रम कर रहे हैं, दोनों कोशिकाओं और21dextran की एक बड़ी राशि का उपयोग कर । कोशिकाओं फ्लोरोसेंट dextran और विभिंन समय पर हटा नमूनों में उच्च घनत्व पर हिल रहे है एक fluorimeter का उपयोग कर आंतरिक प्रतिदीप्ति के निर्धारण के लिए अंक । इस तरह से तैयार कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है के लिए एक सेल लाभ, बजाय जनसंख्या स्तर, संकल्प22, हालांकि इस कम प्रवाह रहता है ।

यहां, मानक एक लेबल के रूप में फ्लोरोसेंट dextran का उपयोग तरल पदार्थ को मापने के लिए तकनीक एक ९६-अच्छी प्लेट प्रारूप के लिए अनुकूलित है, नमूने के साथ प्रवाह cytometry एक उच्च प्रवाह नमूना (HTS) लगाव का उपयोग करके विश्लेषण किया । कोशिकाओं को एक पूर्व समय की लंबाई निर्धारित के लिए गैर अतृप्त फ्लोरोसेंट dextran खिलाया, बर्फ में विसर्जन से धोया-ठंड बफर और 5 मिमी सोडियम azide, जो भी exocytosis बंद हो जाता है का उपयोग कर अलग कर रहे हैं । प्रत्येक कुआं में कोशिकाओं को फिर प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । इस विधि से ऊपर के तरीकों की सीमाओं पर काबू पाने के लिए डिज़ाइन किया गया था और कम संसाधनों का उपयोग करते हुए और शामिल श्रम को कम करने, जबकि उपभेदों की बड़ी संख्या के द्रव का एक साथ तुलना की अनुमति/

Protocol

1. कोशिकाओं और सामग्री की तैयारी

  1. या तो Klebsiella aerogenesके रूप में बैक्टीरिया के साथ संयोजन के रूप में एसएम आगर प्लेटों, या पोषक तत्व जैसे HL5 के रूप में23के रूप में वर्णित कोशिकाओं पर खेती ।
    नोट: पीटकर म्यूटेंट कि बैक्टीरिया पर macropinocytosis में दोषपूर्ण है बढ़ती माध्यमिक उत्परिवर्तनों है कि macropinocytosis की दर में वृद्धि हो सकती है के संचय को रोकने में मदद करता है । इष्टतम परिणामों के लिए शेयरों से कोशिकाओं को चढ़ाना के बाद 4 से नीचे बीतने संख्या रखो । म्यूटेंट के रूप में जितनी जल्दी हो सके जमे हुए शेयरों के रूप में जमा किया जाना चाहिए अलगाव ।
  2. एसएम आगर प्लेट्स पर कोशिकाओं की खेती करने के लिए एसएम मीडियम में संगम को aerogenes. 200-300 बैक्टीरिया की μL एक एसएम आगर प्लेट और प्रसार पर जोड़ें । कोशिकाओं के एक बाँझ पाश ले लो (जब एक और जीवाणु की थाली से स्थानांतरित) और प्लेट के एक किनारे पर फैल गया. एक सप्ताह तक के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  3. भंग टेट्रा-मिथाइल-rhodamine isothiocyanate (TRITC-) dextran करने के लिए ५० मिलीग्राम/एमएल में ०.२२ माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर 1 मिलीलीटर aliquots और स्टोर में-20 डिग्री सेल्सियस । Aliquots को अनिश्चितकाल के लिए रखा जा सकता है ।
    नोट: १५५ केडीए ठेठ आकार इस विधि के साथ प्रयोग किया जाता है, के रूप में इसे थोक में सस्ते में खरीदा जा सकता है, लेकिन छोटे dextrans उपाय macropinocytosis बस के रूप में प्रभावी ढंग से24 Dictyosteliumमें । विभिंन गैर-शमन dextrans, जैसे झरना नीला या Alexa-६४७, विकल्प है यदि विभिंन fluorophores आवश्यक हैं ।

2. मात्रात्मक में गुणात्मक माप परिवर्तित (वैकल्पिक)

  1. निलंबन में कोशिकाओं का उपयोग कर एक द्रव को बेहतर परख करें ।
    1. गोली axenically 3 मिनट के लिए ३०० x g पर बढ़ती कोशिकाओं, supernatant त्यागें और पोषक तत्व मध्यम में resuspend करने के लिए 1x107 कोशिकाओं/एमएल । जोड़ें TRITC-dextran करने के लिए ०.५ मिलीग्राम/एमएल और शेक पर १८० rpm, 22 डिग्री सेल्सियस ।
    2. बर्फ के ०.७ मिलीलीटर में ०.८ मिलीलीटर के नमूनों पतला-शीत केके2 पर 0, 30, ६०, ९०, १२० मिनट में एक बार धो लो बर्फ के १.५ मिलीलीटर में ठंडा केके2 बफर23 एक benchtop केंद्रापसारक में, एक ही बफर और बर्फ पर स्टोर में 1 मिलीलीटर को पुनः निलंबित ।
      नोट: तुरंत धुलाई या एक बार सभी नमूनों पैदावार समकक्ष परिणाम एकत्र किया गया है ।
  2. कोशिकाओं द्वारा आंतरिक तरल पदार्थ की मात्रा का निर्धारण ।
    1. fluorimeter सेट के लिए एक 10 एनएम भट्ठा के साथ ५४४ एनएम और ५७४ एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग प्रतिदीप्ति उपाय । TRITC-dextran की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला सेट और dextran के दिए गए संस्करणों के लिए प्रतिदीप्ति को मापने के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं । एक अंशांकन वक्र बनाएं ।
    2. सेल निलंबन के ०.९ मिलीलीटर का उपयोग धारा २.१ में कोशिकाओं द्वारा आंतरिक प्रतिदीप्ति उपाय । अंशांकन वक्र24का उपयोग कर प्रति कोशिका आंतरिक द्रव की मात्रा की गणना ।
  3. प्रत्येक समय बिंदु से ०.५ मिलीलीटर बर्फ ठंडा केके2में अलग कोशिकाओं के शेष पतला । 5 मिलीलीटर polystyrene फ्लो cytometry ट्यूबों में एक ७० µm सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर । प्रवाह cytometer सेट करें ताकि प्रत्येक समय बिंदु से कक्ष एक-दूसरे से भिंन हों और उनके प्रतिदीप्ति रिकॉर्ड (अनुभाग ३.४ और ३.५ देखें) ।
  4. ऊपर सेटिंग्स का उपयोग cytometer प्रवाह में अंशांकन मोतियों की प्रतिदीप्ति को मापने और इसे रिकॉर्ड.
    नोट: यह प्रवाह cytometer पर भविष्य प्रतिदीप्ति माप के लिए संदर्भ है: फिर से उपयोग कर मोतियों को चलाने और सेटिंग्स को समायोजित करने से पहले तो वे एक ही प्रतिदीप्ति है । यह एक बहुत ही संकीर्ण परिभाषित चोटी दे देंगे । प्रतिदीप्ति चोटी के चारों ओर एक गेट डाल यह आसान बना सकते हैं ।
  5. तीन बार दोहराएँ और एक दूसरे के खिलाफ वर्गों २.२ और २.३ में प्राप्त सेल प्रतिदीप्ति डेटा प्लॉट. प्लॉट सबसे अच्छा फिट की एक पंक्ति और समीकरण का उपयोग करने के लिए मात्रात्मक इकाइयों में cytometry प्रवाह से गुणात्मक डेटा परिवर्तित ।

3. तरल पदार्थ को मापने

Figure 1
चित्रा 1: macropinocytosis के उच्च प्रवाह माप की योजनाबद्ध । (क) एक एसएम प्लेट पर Dictyostelium के aerogenes बैक्टीरिया (पीला) के साथ बीज उगाना । खिला सामने (नारंगी) से फसल कोशिकाओं, पहले से ही विकसित कर रहे हैं कि कोशिकाओं से परहेज (हरा), केके2 बफर के 25 मिलीलीटर में. अलग कर देना को भंवर, ३०० x gपर 3 मिनट केंद्रापसारक द्वारा गोली, तो केके2 बफर के ५० मिलीलीटर में 3 बार धो, supernatant हर बार खारिज । HL5 विकास माध्यम में 1 x 105 कोशिकाओं/एमएल के लिए resuspend और एक फ्लैट नीचे ९६ के नमूने के प्रति तीन कुओं में ५० µ l जोड़ें अच्छी तरह से थाली । 24 घंटे के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर मशीन (ख) पतला TRITC-dextran करने के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल के शेयर समाधान से HL5 विकास मध्यम में ५० मिलीग्राम/ प्रत्येक नमूने के लिए ५० µ l जोड़ें (0 मिनट के ऊपर नियंत्रण कुओं को छोड़कर), और 1 ज के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी, जिसके बाद 0 मिनट के लिए dextran नियंत्रण जोड़ने के लिए । (ग) तुरंत मीडिया की खिचड़ी बनाना, एक टिश्यू पर प्लेट थपथपा कर अतिरिक्त मध्यमा को हटाने और बर्फ के एक स्नान में जलमग्न-ठंडा केके2 बफर, कुएँ को धोने के लिए भरना. बफर और पॅट सूखी फिर से खिचड़ी भाषा । जोड़ें १०० µ एल के 5 मिमी सोडियम azide में भंग केके2MC कोशिकाओं को अलग करने के लिए. आंतरिक प्रतिदीप्ति की माप के लिए cytometer प्रवाह करने के लिए ले लो । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. एक फ्लैट तली ९६-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली (आंकड़ा 1a) सेट करें । बैक्टीरिया पर उगाया कोशिकाओं का उपयोग करें और उन्हें HL5 माध्यम में स्थानांतरित करने के लिए (युक्त १०० µ जी/एमएल dihydrostreptomycin, १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन और ५० µ जी/एमएल कनमीसिन) 24 एच से पहले परख; यह macropinocytosis24बैक्टीरिया पर उगाई कोशिकाओं में देखा निम्न स्तर से विनियमित किया जा करने के लिए अनुमति देता है. वैकल्पिक रूप से, axenic संस्कृति से सीधे कोशिकाओं को पतला, परख से पहले 24 घंटे के लिए गर्मी, कोशिकाओं को अलग घनत्व से पतला होने के कारण त्रुटियों को कम करने के लिए ।
    1. एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में केके2 के 25 मिलीलीटर में खिला सामने से फसल कोशिकाओं । भंवर और गोली द्वारा अलग कर देना कोशिकाओं 3 मिनट के लिए ३०० x g पर। supernatant त्यागें, गोली resuspend और2केके के ५० मिलीलीटर में 3 मिनट के लिए ३०० x g में 3 बार धो, supernatant हर बार हटाने के जीवाणुओं को खारिज ।
    2. सेल घनत्व का निर्धारण (एक hemacytometer या अंय सेल गिनती प्रणाली का उपयोग कर) और 1 x 105 कोशिकाओं को एंटीबायोटिक दवाओं से युक्त HL5 में पतला/ पिपेट ५० प्रत्येक कुआं में μL, प्रत्येक हालत के लिए तीन कुओं का उपयोग कर । 24 घंटे के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर मशीन एक 0 मिनट के ऊपर नियंत्रण स्थापित करने के लिए याद रखें ।
      नोट: एक वैकल्पिक माध्यम, उदाहरण के लिए, शिः, VL6 बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. TRITC-dextran (चित्रा 1b) के साथ कोशिकाओं लोड ।
    1. dextran को पतला करने के लिए इस्तेमाल किया मध्यम में 1 मिलीग्राम/एमएल (यह करने के लिए बढ़ाया जा सकता है 2.5-5 मिलीग्राम/एमएल जब बहुत कम के साथ कोशिकाओं का आकलन) । जोड़ें ५० μL प्रत्येक अच्छी तरह से (एक अंतिम एकाग्रता देने के ०.५ मिलीग्राम/एमएल TRITC-dextran) और 1 एच के लिए 22 डिग्री सेल्सियस के लिए थाली वापस, के रूप में यह महत्वपूर्ण dextran संचय लेकिन exocytosis dextran की अनुमति देता है अभी तक शुरू नहीं किया है ।
      नोट: एक पुनरावर्तक पिपेट इस कदम और अधिक तेजी से किया जा करने के लिए, त्रुटि को कम करने की अनुमति देता है ।
  3. फ्लो cytometry (फिगर 1C) के लिए सेल तैयार करें ।
    1. तुरंत धोने से पहले, ५० μL dextran जोड़ने-0 मिनट के लिए नियंत्रण मीडिया युक्त ।
    2. एक ऊतक पर मध्यम और पॅट सूखी खिचड़ी भाषा । आइस-कोल्ड केके2में थाली को उपविलयित करके धो लें, फिर खिचड़ी में ।
      नोट: पालन दोष के साथ कुछ उपभेदों इस कदम के दौरान अलग हो सकता है, जैसे टलीं (तल्-/talB-)25के दोनों homologs के एक नॉकआउट । यदि आवश्यक हो, तो खराब और महाप्राण मीडिया अनुलग्न करें कक्ष रेखाओं के साथ कार्य करते समय सावधानी बरतें ।
    3. जोड़ें १०० μL बर्फ ठंडा 5 मिमी सोडियम azide में भंग केके2एम सी (केके2 + 2 मिमी MgSO4 और १०० माइक्रोन CaCl2).
      चेतावनी: सोडियम azide अत्यंत विषाक्त है । पाउडर के साथ काम करते समय एक धूल मुखौटा और सुरक्षा चश्मे का उपयोग करें । हमेशा दस्ताने और लैब कोट पहनें । गर्मी से बचने और एसिड के साथ मिश्रण नहीं है ।
      नोट: कोशिकाओं को तेजी से अलग है, और exocytosis24रोका है । एक खुर्दबीन इस जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. प्रवाह cytometry द्वारा द्रव तेज उपाय
    1. यदि निरपेक्ष लोगों के सापेक्ष मूल्यों को बदलने की योजना बना, मोती का उपयोग करने के लिए मानक प्रवाह cytometer सेटिंग्स (2 अनुभाग देखें) । वैकल्पिक रूप से, अनुभाग 2 में dextran के साथ लोड किए गए कक्षों का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए करें कि आगे स्कैटर और साइड स्कैटर कक्षों को अलग करने के लिए उचित रूप से सेट हैं (आरेख 2a), मशीन को सुनिश्चित करने के लिए ब्लॉक नहीं किया गया है, (आंकड़ा 2 बी) और पैरामीटर्स समायोजित करें आंतरिक प्रतिदीप्ति (चित्रा 2c) को मापने ।
    2. उच्च प्रवाह नमूना प्रणाली संलग्न और थाली जोड़ें । प्रतिदीप्ति को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल सेट करें (TRITC-dextran के लिए एक पीले-हरे रंग की लेजर का उपयोग करने के लिए उत्तेजित और मापने के लिए ५८२ एनएम चैनल या इसी तरह) के ६५ μL तक के सेल सस्पेंशन और भागो ।
  5. विश्लेषण प्रवाह cytometry परिणाम
    1. आगे स्कैटर और साइड स्कैटर (चित्रा 2a) का उपयोग कर कोशिकाओं पर गेट. सांख्यिकी विकल्प का उपयोग कर कोशिकाओं के माध्य प्रतिदीप्ति की गणना । एक नमूना का उपयोग कर इन मापदंडों सेट और सभी नमूनों के लिए लागू होते हैं ।
      नोट: विभिन्न म्यूटेंट या अवरोधकों का उपयोग करते समय आगे स्कैटर/साइड स्कैटर प्रोफ़ाइल नमूने के बीच भिन्न हो सकते हैं.
    2. प्रत्येक शर्त के लिए तीन कुओं का मतलब निर्धारित करें और 0 मिनट के ऊपर नियंत्रण घटाना । या तो खंड 2 में निर्धारित समीकरण का उपयोग करके मात्रात्मक मानों में कनवर्ट करें या नियंत्रण को सामान्य बनाएं ।

4. प्रदर्शन द्रव समय-पाठ्यक्रम

  1. अनुभाग 3 में के रूप में सेट अप करें, प्रत्येक समय बिंदु के लिए तीन कुओं के साथ और तनाव/
  2. क्रमिक रूप से विभिन्न कुओं में dextran बला मध्यम जोड़ें. एक ठेठ समय पाठ्यक्रम उपायों 0, 30, ६०, ९०, १२० और १८० मिनट में तरल पदार्थ पर ले लो dextran-१८० मिनट समय बिंदु कुओं के लिए मध्यम युक्त, बाद में ६० मिनट १२० मिनट के लिए कुओं को जोड़ने के द्वारा बाद में, आदि (चित्रा 3ए) ।
  3. 0 मिनट पर, dextran-युक्त मध्यम और तुरंत खिचड़ी भाषा के ५० μL जोड़ें और धारा ३.३ में के रूप में थाली धो लो । विश्लेषण के रूप में धारा ३.५ में वर्णित है ।

5. खुराक प्रतिक्रिया घटता

  1. धारा 3 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को सेट, प्रत्येक तनाव और शर्त के लिए तीन कुओं के साथ ।
  2. मध्यम में ब्याज की यौगिक पतला 1 मिलीग्राम/एमएल dextran परिसर के दोहरे वांछित अधिकतम अंतिम एकाग्रता में शामिल हैं । पहले के रूप में वाहन के समान अनुपात के साथ dextran के साथ एक दूसरे के माध्यम से युक्त ट्यूब तैयार करें । भंवर मिश्रण करने के लिए ।
  3. २०० μL dextran में ब्याज के यौगिक के एक कमजोर पड़ने श्रृंखला बनाने के प्रति नमूना (चित्र 4a) के माध्यम से युक्त । भंवर मिश्रण करने के लिए । प्रत्येक नमूने के लिए अच्छी तरह से 1 एच के लिए मध्यम के ५० μL जोड़ें ।
  4. धो और विश्लेषण के रूप में धारा ३.३ के बाद में वर्णित है ।

6. Phagocytosis और झिल्ली

  1. झिल्ली को मापने के लिए, खंड 3 में वर्णित के रूप में तैयार कोशिकाओं । 10 माइक्रोन की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 20 माइक्रोन एफएम 1-43 युक्त माध्यम के ५० μL जोड़ें । लोड करने के बाद, धो और धारा ३.३ में के रूप में प्रवाह cytometry के लिए कोशिकाओं को तैयार । ५८५ एनएम चैनल या इसी तरह, एक नीली लेजर का उपयोग करने के लिए उत्तेजित में उपाय ।
    नोट: के रूप में झिल्ली की तस्करी से अधिक तेजी से द्रव-चरण, 10 मिनट है एक अधिक उपयुक्त समय बिंदु से 1 ज26का उपयोग करें । वैकल्पिक रंजक है कि fluoresce केवल जब झिल्ली में शामिल किया जा सकता है इसके बजाय ।
  2. phagocytosis को मापने के लिए या तो फ्लोरोसेंट बला मोतियों या बैक्टीरिया का प्रयोग करें । फ्लोरोसेंट खमीर इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, के रूप में वे Dictyostelium से आगे और साइड तितर बितर24से अविभाज्य हैं । अनुभाग 3 में बताए अनुसार कक्ष सेट करें और27के रूप में वर्णन किया गया विश्लेषण ।
    1. मोतियों की phagocytosis को मापने के लिए धारा ३.२ में वर्णित के रूप में पीले रंग की बला मोतियों को जोड़ने के 5 x 107 मोती/एमएल (के अंतिम एकाग्रता के लिए १.७५ और 2 माइक्रोन) या 1 x 108 मोतियों/एमएल (1 और १.५ माइक्रोन) धोने और के रूप में प्रवाह cytometry के लिए तैयार करने से पहले 1 ज के लिए धारा ३.३ । ५२५ एनएम चैनल या इसी तरह, एक नीली लेजर का उपयोग करने के लिए उत्तेजित में उपाय ।
      नोट: उच्च सांद्रता कोशिका टुकड़ी को बढ़ावा मिलेगा ।
    2. जीवाणुओं के phagocytosis को मापने के लिए, ३.२ धारा में 1 x 108 बैक्टीरिया/एमएल के लिए 1 एच के लिए और धारा ३.३ के रूप में प्रवाह cytometry के लिए तैयार करने से पहले के रूप में वर्णित टेक्सास लाल बला ई कोलाई कणों जोड़ें । ६१० एनएम चैनल या इसी तरह, एक पीले-हरे रंग की लेजर का उपयोग कर उत्तेजित करने के लिए में उपाय ।

Representative Results

एक बार तकनीक प्रदर्शन किया गया है और कोशिकाओं dextran और विश्लेषण के लिए तैयार के साथ भरी हुई है (चित्रा 1), सुनिश्चित प्रवाह cytometer अवरुद्ध नहीं है और आगे तितर बितर/समायोजित करने के लिए चित्र 2aमें दिखाया कोशिकाओं की तरह लग रहे यदि मशीन अवरुद्ध है, यह और अधिक की तरह दिखेगा कि चित्र बी में दिखाया गया है और जारी रखने से पहले अनब्लॉक किया जाना चाहिए । सुनिश्चित करें कि पैरामीटर्स दिखाएँ नियंत्रण axenic कोशिकाओं को उच्च आंतरिक dextran प्रतिदीप्ति पर लंबे समय अंक और कम आंतरिक प्रतिदीप्ति छोटे लोगों में (चित्रा 2c).

जब म्यूटेंट के बीच मतभेदों की तलाश में, यह संभावना है कि वहां तीन phenotypes में से एक होगा । म्यूटेंट सामांय तरल पदार्थ हो सकता है, वे एक आंशिक दोष हो सकता है, या तरल पदार्थ को पूरी तरह से समाप्त किया जा सकता है । चित्रा 2d सामांय द्रव के साथ एक तनाव से पता चलता है, इस मामले में मानक प्रयोगशाला तनाव Ax2, एक के साथ एक उत्परिवर्ती ~ द्रव में ५०% कमी (Ax2 rasG-14) और समाप्त द्रव के साथ एक (Ax3 gefB-28) । औसत माध्य द्रव (धारा ३.५) ले लो और इसे का उपयोग करने के लिए या तो ( चित्र में बीके रूप में) आंतरिक द्रव की मात्रा की गणना या एक नियंत्रण करने के लिए डेटा की तुलना ( चित्रा 4B और 4cके रूप में) ।

जब एक तरल पदार्थ समय पाठ्यक्रम प्रदर्शन, चित्र 3ए के रूप में, आंतरिक प्रतिदीप्ति 60 के लिए वृद्धि-90 मिनट चाहिए, जिसके बाद dextran के लिए exocytosed होना शुरू होता है और एक पठार तक पहुंच गया है (चित्र बी) । मानक समय बिंदु के रूप में ६० मिनट का प्रयोग जब विभिंन म्यूटेंट में macropinocytosis तुलना/इसलिए एक अच्छा संकेत प्राप्त करने की अनुमति देता है, और कोई संकेत exocytosis के कारण खो दिया है । म्यूटेंट जहां exocytosis गंभीर रूप से बाधित है एक पठार29तक पहुंचने में अधिक समय लग सकता है ।

जब अवरोधकों कि Dictyostelium में macropinocytosis के खिलाफ प्रभावी रहे है के साथ कोशिकाओं के इलाज ( चित्र 4aके रूप में स्थापित), 1 ज में आंतरिक dextran मामलों के बहुमत में उच्च अवरोध करनेवाला सांद्रता में लगभग कुछ भी नहीं करने के लिए नीचे जाना होगा (चित्रा 4B). कुछ अवरोधकों १००% प्रभावी नहीं हो सकता है, तथापि, उदाहरण के लिए nocodazole केवल macropinocytosis द्वारा द्रव तेज के ५०% तक रोकता है जब तीव्रता से जोड़ा (आंकड़ा 4c) । यदि अवरोधकों प्रभावी नहीं हैं, तो कोशिकाओं को नियंत्रण के रूप में dextran की एक समान मात्रा internalize जाएगा, और प्रतिदीप्ति में एक कमी नहीं देखा जाएगा । इस तकनीक के विभिंन अवरोधकों और अवरोध करनेवाला सांद्रता की एक बड़ी रेंज की अनुमति देता है बहुत जल्दी macropinocytosis द्वारा तरल पदार्थ पर प्रभाव के लिए जांच की जा करने के लिए, समय को कम करने के अवरोधक उपचार के अनुकूलन बिताया ।

Figure 2
चित्रा 2: फ्लो cytometer और प्रतिनिधि डेटा की स्थापना की । (A) कोशिकाओं के फॉरवर्ड स्कैटर (FSC) और साइड स्कैटर (एसएससी) प्रोफाइल सेट किया जाना चाहिए ताकि कोशिकाओं को आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सके. Ax2 कक्षों को कैसे दिखना चाहिए इसका एक उदाहरण दिखाया गया है । (ख) यदि प्रवाह cytometer ब्लॉक किया गया है, इस उदाहरण के रूप में, कक्ष बहुत कम साइड स्कैटर है । लेजर fluorophores ठीक से उत्तेजित नहीं होगा और मशीन जारी रखने से पहले अनब्लॉक किया जाना चाहिए । मशीन अवरुद्ध होने के दौरान प्राप्त किसी भी डेटा को छोड़ दिया जाना चाहिए । (ग) प्रतिदीप्ति इतना है कि एक 0 मिनट के अनुरूप नमूना कम प्रतिदीप्ति है, जो बढ़ जाती है जब कोशिकाओं फ्लोरोसेंट माध्यम में अब के लिए तैयार किया गया है, के रूप में इस विलियंस और Kay २०१८24से लिया उदाहरण में दिखाया गया है चाहिए । (घ) कोशिकाओं है कि सामांय macropinocytosis (Ax2, हरा), कम macropinocytosis (Ax2 rasG -, HM172614, नारंगी) के साथ 1 घंटे के लिए TRITC dextran के साथ किया गया है और समाप्त macropinocytosis (Ax3 gefB -, के साथ मशीन के उदाहरण HM177628, नीला) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रदर्शन द्रव समय-९६ में पाठ्यक्रम-अच्छी तरह से प्लेटें । (A) Dextran नमूने के प्रत्येक सेट करने के लिए क्रमिक रूप से, एक ही समाप्त समय के साथ जोड़ा जाना चाहिए । इसके बाद कुओं को धोएं, अलग करें और आंतरिक प्रतिदीप्ति को फ्लो cytometry से नाप लें । उदाहरण के बार जोड़ने के लिए dextran यहां दिखाए जाते हैं । (ख) द्रव Ax2 कोशिकाओं का समय-९६-अच्छी तरह से प्लेटों में प्रदर्शन किया । ली से विलियंस & Kay २०१८24, त्रुटि पट्टियां तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मानक त्रुटि दिखाएँ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: द्रव ऊपर उठाना खुराक प्रतिक्रिया घटता. (क) ब्याज की यौगिक जोड़ें, इस मामले में PI3K अवरोध करनेवाला LY294002, HL5 युक्त करने के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल TRITC-dextran पर डबल वांछित अंतिम अधिकतम एकाग्रता. HL5 विकास मध्यम के साथ मिश्रण + 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर dextran अकेले वाहन युक्त विभिंन अनुपात में शर्त प्रति २०० µ एल मध्यम की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला उत्पंन करने के लिए । धोने और आंतरिक प्रतिदीप्ति को मापने से पहले 1 ज के लिए सामांय रूप में कुओं में जोड़ें । (ख) Ax2 कोशिकाओं LY294002 से युक्त मध्यम से एकसे मशीन के लिए द्रव अधिक मात्रा प्रतिक्रिया वक्र । विलियंस और Kay २०१८24से अनुकूलित । द्रव एक अनुपचारित नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत है । त्रुटि पट्टियां तीन स्वतंत्र प्रयोगों की मानक त्रुटि दिखाती हैं । (ग) Ax2 कोशिकाओं nocodazole के साथ मशीन के लिए द्रव के ऊपर ले खुराक प्रतिक्रिया वक्र । विलियंस और Kay २०१८24से अनुकूलित । द्रव एक अनुपचारित नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत है । त्रुटि पट्टियां तीन स्वतंत्र प्रयोगों की मानक त्रुटि दिखाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

जबकि अन्य विधियों का आकलन करने के लिए द्रव तेज कम प्रवाह कर रहे हैं, सीटू में कोशिकाओं को धुलाई और सोडियम azide का उपयोग कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस विधि में महत्वपूर्ण कदम हैं, जो macropinocytosis की उच्च प्रवाह माप की अनुमति देते हैं, झिल्ली तेज, या phagocytosis ने Dictyostelium. के रूप में कोशिकाओं को एक सतह से जुड़े रहे है और मध्यम नहीं है, वे संलग्न किया जा सकता है जबकि उनके चारों ओर पहले से फेंक दिया है और फिर बफर में विसर्जन से बदल गया है और फिर से फेंका । सोडियम azide, जो सेलुलर एटीपी घट और झिल्ली30ध्रुवीकरण, तो कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और भी सेल व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना exocytosis24रोकता है ।

जबकि प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए Dictyostelium द्वारा macropinocytosis को मापने के द्रव तेज बहुत जल्दी से एक बहुत ही सटीक माप देता है, कारण स्थापित करने के लिए एक विशेष तनाव या हालत द्रव तेज बदल गया है, आगे की जांच का उपयोग कर माइक्रोस्कोपी24आवश्यक है । यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि पहले प्रकाशित परिणाम है, कुछ मामलों में, एक सतह पर या तो हो उत्परिवर्ती उपभेदों (जैसा कि इस मामले में), या मिलाते निलंबन (के रूप में मानक प्रोटोकॉल में)31में तरल पदार्थ में एक अंतर दिखाया । इस विधि का उपयोग कर सकते है मतलब है कि, दुर्लभ मामलों में, स्पष्ट द्रव के साथ ही दोष याद किया जाता है । phagocytosis को मापने के साथ ही, कणों की केवल कम सांद्रता इस्तेमाल किया जा सकता है । phagocytosis की अधिकतम दर है कि इस तकनीक के साथ निर्धारित किया जा सकता है अभी तक वास्तविक अधिकतम नीचे है, हालांकि यह अभी भी उपभेदों और24स्थितियों के बीच phagocytosis में प्रासंगिक मतभेदों को मापने के लिए संभव है । phagocytosis की अधिकतम दर निर्धारित करने के लिए, अधिक से अधिक एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल27द्वारा मिलाते निलंबन में मापा जाना चाहिए । कोशिकाओं है कि phagocytosed मोतियों की ओर तितर बितर हो गया है, तो यह तदनुसार के लिए सही किया जाना चाहिए जब तक प्रवाह cytometer की स्थापना ।

प्रवाह cytometry स्तनधारी कोशिकाओं३२में द्रव तेज उपाय करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन Dictyostelium में देखा से अन्य endocytic रास्ते से द्रव चरण तेज के उच्च अनुपात एक चिंता का विषय है. इसके अलावा, कोशिकाओं को आम तौर पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर trypsin का उपयोग कर अलग कर रहे हैं, आंतरिक dextran के आगे endocytic प्रगति की अनुमति । बर्फ ठंडा सोडियम azide मैक्रोफेज एक सतह (विलियंस, अप्रकाशित अवलोकन) से अलग करने के लिए कारण नहीं है, इस तकनीक को आगे अनुकूलन के बिना स्तनधारी कोशिकाओं को लागू नहीं कर रही ।

macropinocytosis के उच्च प्रवाह माप क्षमता है करने के लिए स्क्रीन जल्दी और सस्ते में अवरोधकों के प्रभाव के लिए इस्तेमाल किया जा, आनुवंशिक उत्परिवर्तन या Dictyostelium कोशिकाओं पर जीन पछाड़ना । म्यूटेंट हमेशा अपने प्रत्यक्ष माता पिता की तुलना में होना चाहिए । यदि पाठक Dictyostelium तनाव, गैर के लिए कोई पूर्व वरीयता है ऐसे DdB या NC4 के रूप में axenic उपभेदों और अधिक कर रहे है "जंगली प्रकार" axenic वालों से और के रूप में प्रभावी ढंग से हेरफेर किया जा सकता है axenic उपभेदों३३के रूप में । अंयथा, Ax2 उपभेदों के साथ axenic उपभेदों रहे है कटेंगे जीनोम३४, जबकि Ax4 के कई उपभेदों टलीं एक नॉकआउट है और अगर संभव हो तो बचा जाना चाहिए23। सबसे पहले प्रकाशित उपभेदों Dicty शेयर केंद्र३५से आदेश दिया जा सकता है ।

इस तकनीक से अधिक से अधिक खोजी संभावनाओं की अनुमति देता है Dictyosteliumद्वारा macropinocytosis पर विभिंन स्थितियों, अवरोधकों और उत्परिवर्तनों के प्रभाव में पहले से संभव था ।

Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

हम RRK के लिए चिकित्सा अनुसंधान परिषद ब्रिटेन कोर वित्त पोषण (U105115237) के लिए धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LSR_II flow cytometer BD Biosciences - Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD
TRITC-dextran (155 kDa) Sigma-Aldrich T1287 Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine
HL5 medium Formedium HLGCFG
96-well tissue culture plate Corning 3596 Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work
Dihydrostreptomycin sulfate Sigma-Aldrich PHR1517
Ampicillin sodium Formdium AMP50
Kanamycin monosulfate Sigma-Aldrich 60615
Sodium azide VWR 103694M
Magnesium sulfate hydrate VWR 25169.295
Calcium chloride dihydrate VWR 1.02382.0250
Potassium dihydrogen phopshate VWR 1.04877.1000
Di-potassium hydrogen phosphate VWR 1.05104.1000
Fluorimeter Perkin-Elmer LS 50 B
FM1-43 Thermofisher T35356
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm Polysciences 15702-10
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm Polysciences 09719-10
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm Polysciences 17687-5
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm Polysciences 09847-5
Texas Red E. coli bioparticles Thermofisher E2863
Flow-set fluorospheres Beckman Coulter 6607007 Calibration Beads
SM agar Formedium SMACFG
0.22 µm syringe filter Elkay Laboratory Products E25-PS22-50S
10 mL Syringe Becton Dickinson 302188
Round-bottom polystyrene tubes Corning 352058 Use a tube that will fit onto your flow cytometer.
70 µm cell strainer Falcon 352350
50 mL centrifuge tube Sarstedt 62.547.004
Repeating pipette Eppendorf M4-SK
5 mL repeating pipette tips Eppendorf 30089650
DMSO Sigma-Aldrich D2650-100ML
LY294002 Cayman Chemical Company 70920
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404-2MG

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References

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जीव विज्ञान अंक १३९ Dictyostelium discoideum प्रवाह cytometry macropinocytosis उच्च प्रवाह endocytosis एकल कोशिका संकल्प द्रव तेज
प्रवाह Cytometry द्वारा <em>Dictyostelium discoideum</em> Macropinocytosis का उच्च-प्रवाह मापन
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Williams, T., Kay, R. R. High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (139), e58434, doi:10.3791/58434 (2018).

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