Summary
Macropinocytosis, storskaliga ospecifika vätska upptag, är viktigt i många områden av klinisk biologi inklusive immunologi, infektion, cancer och neurodegenerativa sjukdomar. Här, har befintliga tekniker anpassats så att hög genomströmning, encelliga upplösning mätning av macropinocytosis i macropinocytosis modell organism Dictyostelium discoideum med flödescytometri.
Abstract
Storskaliga ospecifika vätska upptag av macropinocytosis är viktigt för spridningen av vissa cancerceller, antigen provtagning, värd cell invasion och spridningen av neurodegenerativa sjukdomar. De vanliga laboratorie stammarna av amöban Dictyostelium discoideum har extremt hög vätska upptag priser när den odlas i näringsmedium, över 90% som beror på macropinocytosis. Dessutom är många av de kända centrala delarna av däggdjur macropinocytosis också närvarande, vilket gör det en utmärkt modellsystem för att studera macropinocytosis. Här är standard tekniken att mäta internaliserade vätska med fluorescerande dextran som en etikett anpassade till ett format som plattan med 96 brunnar, med prover analyseras med flödescytometri med en hög genomströmning provtagning (HTS) bifogad fil.
Celler matas icke-quenchable fluorescerande dextran under en förutbestämd tid, tvättade av nedsänkning i iskall buffert och fristående med 5 mM natriumazid, som också stannar exocytos. Celler i varje brunn analyseras sedan av flödescytometri. Metoden kan även anpassas till mäta membran upptag och fagocytos av fluorescerande pärlor eller bakterier.
Denna metod var avsedd att möjliggöra mätning av flytande upptag av Dictyostelium på en hög genomströmning, arbetskraft och resurs effektivt sätt. Det tillåter samtidiga jämförelse av flera stammar (e.g. knockout mutanter av en gen) och villkor (t.ex. celler i olika medier eller behandlats med olika koncentrationer av hämmare) parallellt och förenklar tid-kurser.
Introduction
Storskaliga ospecifika vätska upptag av macropinocytosis är viktigt i flera biologiska sammanhang1, inklusive antigen provtagning av immun cellerna2, patogen trätt i värd celler3, cancer cell spridning4 och spridning av prion sjukdomar5. I däggdjurs- och Dictyostelium celler, aktin6,7, PI (3,4,5) P38,9,10 (även om den exakta innebörden av lipid skiljer sig mellan de två11), aktiverad Ras12,13och aktiverade Rac14,15 är viktiga för effektiv vätska upptag av macropinocytosis, även om det fortfarande finns många obesvarade frågor om hur macropinocytic plåstret är bildade, organiserad och så småningom internaliserade. Upptäcka mer proteiner viktiga för macropinocytosis och efterföljande bestämning av hur de är viktiga i de olika biologiska sammanhang, kommer att ge en mer omfattande förståelse av macropinocytosis och potentiellt möjliggöra utveckling av riktade behandlingar för en rad villkor.
Dictyostelium är en idealisk modellsystem för att studera macropinocytosis. Den höga nivån på konstituerande macropinocytosis i standard laboratorie stammar innebär att vätska upptaget är över 90% på grund av macropinocytosis6. Detta tillåter macropinocytosis skall mätas enbart genom att bestämma vätska upptag, till skillnad från däggdjursceller där andelen vätska upptag på grund av macropinocytosis är mycket lägre. Som macropinocytosis är så väl definierad och enkelt visualiseras12 i detta system på samma sätt erbjuder tydliga fördelar för att utreda kärnkomponenter bevarat av macropinosome framför andra system där det kan finnas flera regulatoriska signaler 16 , 17.
Standard tekniken används för att mäta macropinocytosis av däggdjursceller innebär fastställande celler efter pulserande med dextran under en kort tid följt av mikroskopi att bestämma området för en cell som upptas av dextran-positiv blåsor18. Denna teknik tar emellertid inte hänsyn till möjligheten att macropinosomes krymper när man kommer in i cellen, vilket har rapporterats i Dictyostelium19, och tar bara hänsyn till enda flygplan i cellen, vilket innebär att volymen internaliserat är oklart. En alternativ teknik, för att räkna antalet macropinosomes internaliseras i en given tid, har samma nackdelar20. Med Dictyostelium undviker dessa problem. befintliga tekniker för att mäta vätska upptag av Dictyostelium är dock relativt arbetsintensivt, använder en stor mängd både celler och dextran21. Celler är skakat på hög densitet i fluorescerande dextran och prover tas bort vid olika tidpunkter för bestämning av internaliserade fluorescensen använder en fluorimeter. Celler som förberett detta sätt kan analyseras med flödescytometri att få enstaka cell, i stället för befolkningen nivå, resolution22, även om detta fortfarande är låg genomströmning.
Här är standard tekniken att mäta internaliserade vätska med fluorescerande dextran som en etikett anpassade till ett format som plattan med 96 brunnar, med prover analyseras med flödescytometri med en hög genomströmning provtagning (HTS) bifogad fil. Celler matas icke-quenchable fluorescerande dextran under en förutbestämd tid, tvättade av nedsänkning i iskall buffert och fristående med 5 mM natriumazid, som också stannar exocytos. Celler i varje brunn analyseras sedan av flödescytometri. Denna metod var avsedd att övervinna begränsningarna av ovanstående metoder och tillåta simultana jämförelse av vätska upptaget av ett stort antal stammar/villkor samtidigt som använder mindre resurser och minskar arbetskraft som är inblandade.
Protocol
1. beredning av celler och material
- Odla celler antingen på SM agarplattor i samband med bakterier såsom Klebsiella aerogeneseller näringsmedium såsom HL5 som beskrivs23.
Obs: Växande knockout mutanter som är defekta i macropinocytosis på bakterier hjälper till att förhindra ansamling av sekundära mutationer som kan öka graden av macropinocytosis. Håll antalet passage under 4 efter plätering celler från bestånd för optimala resultat. Mutanter ska förvaras som fryst lager så snart som möjligt efter isolering. - För att odla celler på SM agarplattor, växa K. aerogenes till sammanflödet i SM medium. Tillsätt 200 – 300 μL av bakterier på en SM agarplatta och spridas. Ta en steril ögla av celler (vid överföring från en annan bakteriell tallrik) och sprida på ena kanten av plattan. Inkubera vid 22 ° C i upp till en vecka.
- Lös upp Tetra-metyl-rodamin fluoresceinisothiocyanat (TRITC-) dextran 50 mg/ml i vatten, filtrera med 0,22 μm filter till 1 mL portioner och förvaras vid-20 ° C. Alikvoter kan hållas på obestämd tid.
Obs: 155 kDa är typisk storlek används med den här metoden som det kan köpas billigt i bulk, men mindre dextrans mäta macropinocytosis lika effektivt i Dictyostelium24. Olika icke-quenchable dextrans, såsom cascade blå eller Alexa-647, finns alternativ om olika fluorophores krävs.
2. konvertera kvalitativa mätningar i kvantitativa (tillval)
-
Utföra en vätska upptag analysen använder celler i suspension.
- Pellet axenically växande celler vid 300 x g i 3 min, avlägsna supernatanten och återsuspendera i näringsmedium till 1 x 107 celler/mL. Tillsätt TRITC-dextran till 0,5 mg/mL och skaka på 180 rpm, 22 ° C.
- Späd 0,8 mL prover till 0,7 mL iskallt KK2 med 0, 30, 60, 90, 120 min. tvätta en gång i 1,5 mL iskallt KK2 buffert23 i en bänkmonterade centrifug, Omsuspendera 1 ml i samma bufferten och lagra på is.
Obs: tvätta omedelbart eller när alla prover har samlats ger likvärdiga resultat.
-
Bestäm volymen av vätska internaliseras av celler.
- Ange fluorimeter att mäta fluorescens med en magnetisering våglängd av 544 nm och utsläpp våglängd av 574 nm med 10 nm slits. Ställa in en utspädning serie av TRITC-dextran och använda den för att mäta fluorescensen för gett volymer av dextran. Skapa en kalibreringskurva.
- Mäta fluorescensen internaliseras av cellerna i avsnitt 2.1 med 0,9 mL cellsuspension. Beräkna volymen av vätska internaliserat per cell använder kalibrering kurva24.
- Späd återstoden av cellerna från varje tidpunkt separat i 0,5 mL is kallt KK2. Filtrera genom en 70 µm cell SIL till 5 mL polystyren flöde flödescytometri rör. Ange flödescytometer så att celler från varje tidpunkt är skilda från varandra och registrera deras fluorescens (se avsnitt 3.4 och 3.5).
- Mäta fluorescensen av kalibrering pärlor i den flödescytometer med ovanstående inställningar och spela in den.
Obs: Detta är referens för alla framtida fluorescens mätningar på flödescytometer: innan du använder igen kör pärlorna och justera inställningarna så att de har samma fluorescensen. Detta ger en mycket snävt definierad topp. Att sätta en grind runt fluorescens toppen kan göra detta lättare. - Upprepa tre gånger och rita cell fluorescens uppgifterna i avsnitten 2.2 och 2.3 mot varandra. Rita en linje för bästa passform och använda ekvationen för att konvertera kvalitativa data från flödescytometri i kvantitativa enheter.
3. mäta vätska upptag
Figur 1: Schematisk av hög genomströmning mätning av macropinocytosis. (A) att växa Dictyostelium på en SM-tallrik seedade med K. aerogenes bakterier (gul). Skörda celler utfodring framifrån (orange), undvika celler som redan utvecklade (grön), i 25 mL KK2 buffert. Vortex att sära, pellet 3 min centrifugering vid 300 x g, sedan tvätta 3 gånger i 50 mL KK2 buffert, kasta bort supernatanten varje gång. Omsuspendera till 1 x 105 celler/mL i HL5 odlingsmedium och tillsätt 50 µL i tre brunnar per prov av en platt bottenplattan med 96 brunnar. Inkubera vid 22 ° C under 24 h. (B) utspädd TRITC-dextran 1 mg/ml i HL5 odlingsmedium från en stamlösning av 50 mg/mL. Tillsätt 50 μl till varje prov (exklusive 0 min upptag kontrollbrunnarna) och inkubera vid 22 ° C för 1 h, efter som lägger till dextran till kontrollen 0 min upptag. (C) omedelbart Dekantera media, klappa plätera på en vävnad att ta bort överflödig medium och sänk ner i ett bad med iskallt KK2 buffert, fylla brunnarna att tvätta. Dekantera bufferten och klappa torrt igen. Tillsätt 100 µL av 5 mM natriumazid upplöst i KK2MC att lossa cellerna. Ta för att flöda cytometer för mätning av internaliserade fluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
-
Ställa in en flatbottnad 96 brunnar-vävnadskultur tallrik (figur 1A). Använder celler som odlas på bakterier och överföra dem till HL5 medium (innehållande 100 µg/mL dihydrostreptomycin, 100 µg/mL ampicillin och 50 µg/mL kanamycin) 24 h innan analysen; Detta tillåter macropinocytosis att vara uppreglerad från låga nivåer ses i celler som odlas på bakterier24. Alternativt, späd cellerna direkt från axenic kultur, inkubation för 24 h innan assay, minska fel på grund av cellerna späds från olika tätheter.
- Skörda celler utfodring framifrån in i 25 mL KK2 i ett 50 mL centrifugrör. Separera celler av vortexa och pellets vid 300 x g i 3 min. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten tvätta 3 gånger vid 300 x g i 3 min i 50 mL av KK2, kasta bort supernatanten varje gång att ta bort bakterier.
- Bestämma cell densiteten (med en hemacytometer eller annan cell räknar systemet) och späd till HL5 innehållande antibiotika till 1 x 105 celler/mL. Överför med pipett 50 μL till varje brunn, med tre brunnar för varje villkor. Inkubera vid 22 ° C under 24 h. kom ihåg att ställa in en kontroll för upptag av 0 min.
Obs: Ett alternativt medium, t.ex. SIH, VL6 kan användas i stället.
-
Lastceller med TRITC-dextran (figur 1B).
- Späd dextran 1 mg/ml i det medium som används (detta kan ökas till 2,5 – 5 mg/mL vid bedömningen av celler med mycket låg upptag). Tillsätt 50 μL till varje brunn (vilket ger en slutlig koncentration på 0,5 mg/mL TRITC-dextran) och tillbaka plattan till 22 ° C i 1 h, som detta ger betydande dextran ansamling men exocytos av dextran har ännu inte börjat.
Obs: repeater pipett gör detta steg göras snabbare, vilket minskar fel.
- Späd dextran 1 mg/ml i det medium som används (detta kan ökas till 2,5 – 5 mg/mL vid bedömningen av celler med mycket låg upptag). Tillsätt 50 μL till varje brunn (vilket ger en slutlig koncentration på 0,5 mg/mL TRITC-dextran) och tillbaka plattan till 22 ° C i 1 h, som detta ger betydande dextran ansamling men exocytos av dextran har ännu inte börjat.
-
Förbereda celler för flödescytometri (figur 1 c).
- Omedelbart före tvätt, lägga till 50 μL dextran-innehållande media av 0 min upptag kontrollerna.
- Dekantera medium och klappa torrt på en vävnad. Tvätta av dränka plattan i iskall KK2, sedan Dekantera.
Obs: vissa stammar med följsamhet defekter kan lossna under detta steg, t.ex. en knockout av båda homologs av Talin (talA-/ talB -)25. Var försiktig när du arbetar med cellinjer som fäster dåligt och aspirera media om det behövs. - Tillsätt 100 μL av iskall 5 mM natriumazid upplöst i KK2MC (KK2 + 2 mM MgSO4 och 100 μM CaCl2).
Varning: Natriumazid är extremt giftigt. Använd en ansiktsmask och skyddsglasögon när du arbetar med pulvret. Använd alltid handskar och labbrock. Undvik värme och får inte blandas med syra.
Obs: Celler loss snabbt och exocytos är förhindrade24. Ett Mikroskop kan användas för att kontrollera detta.
-
Mäta vätska upptag av flödescytometri
- Om du planerar att konvertera relativa värden till absoluta kära, använda pärlor för att standardisera flöde cytometer inställningar (se avsnitt 2). Alternativt använda celler laddad med dextran som i avsnitt 2 att se till att framåt scatter och side scatter fastställs på ett lämpligt sätt att isolera cellerna (figur 2A), se till att maskinen inte är blockerad, (figur 2B) och justera parametrar att mäta de internaliserade fluorescensen (figur 2 c).
- Fäst högt dataflöde provtagningssystemet och lägga till plattan. Ställa in ett protokoll för att mäta fluorescensen (för TRITC-dextran använda en gul-grön laser för att excitera och mäta i 582 nm kanalen eller liknande) på upp till 65 μL av cellsuspensionen och kör.
-
Analysera flödet flödescytometri resultat
- Grind på cellerna använder framåt scatter och side scatter (figur 2A). Beräkna median fluorescensen av cellerna med hjälp av alternativet statistik. Ange dessa parametrar med hjälp av ett prov och gäller för alla prover.
Obs: Framåt scatter/side scatter profilerna kan variera mellan prover när du använder olika mutanter eller -hämmare. - Bestämma medelvärdet av de tre brunnarna för varje villkor och subtrahera 0 min upptag kontroll. Antingen konvertera till kvantitativa värden med hjälp av ekvation som fastställs i avsnitt 2 eller normalisera till kontrollen.
- Grind på cellerna använder framåt scatter och side scatter (figur 2A). Beräkna median fluorescensen av cellerna med hjälp av alternativet statistik. Ange dessa parametrar med hjälp av ett prov och gäller för alla prover.
4. utför vätska upptag tid-kurser
- Ställa in celler som i avsnitt 3, med tre brunnar för varje tidpunkt och stam/skick.
- Lägga till dextran märkta medium olika brunnarna sekventiellt. En typisk tid-kurs åtgärder vätska upptag vid 0, 30, 60, 90, 120 och 180 min. Lägg dextran-innehållande medium för 180 min tid punkt brunnar, följt 60 min senare av att lägga till brunnarna för 120 min tidpunkten, etc. (figur 3A).
- Vid 0 min, tillsätt 50 μL av dextran-innehållande medium och omedelbart Dekantera och tvätta plattan enligt avsnitt 3.3. Analysera som beskrivs i avsnitt 3.5.
5. dos-responskurvor
- Ställa in celler som beskrivs i avsnitt 3, med tre brunnar för varje stam och skick.
- Späd sammansatta av intresse till medium innehållande 1 mg/mL dextran vid dubbel önskad maximal slutlig koncentration av substansen. Förbereda ett andra rör innehållande medium med dextran med samma andel av fordon som först. Vortex att blanda.
- Skapa en utspädning serie sammansatta av intresset för 200 μL dextran som innehåller medium per prov (figur 4A). Vortex att blanda. Tillsätt 50 μl av medium till varje prov väl för 1 h.
- Tvätta och analysera som beskrivs i avsnitt 3.3 och framåt.
6. fagocytos och membran upptag
- För att mäta membran upptag, förbereda cellerna som beskrivs i avsnitt 3. Tillsätt 50 μL av medium som innehåller 20 μM FM 1-43 för en slutlig koncentration på 10 μM. Efter lastning, tvätta och förbereda celler för flödescytometri som i avsnitt 3.3. Mäta i 585 nm kanalen eller liknande, med en blå laser för att excitera.
Obs: Eftersom membranet människohandel är snabbare än vätska-fas, 10 min är en lämpligare tidpunkt att använda än 1 h26. Alternativa färgämnen som fluorescerar endast när de införlivas i membranet kan användas i stället. -
Använda fluorescently märkta pärlor eller bakterier för att mäta fagocytos. Fluorescerande jäst kan inte användas, eftersom de är oskiljaktiga från Dictyostelium av framåt och side scatter24. Ställ in celler som beskrivs i avsnitt 3 och analysera som beskrivs27.
- För att mäta fagocytos av pärlor lägga till gul-gröna märkta pärlor som beskrivs i avsnitt 3.2 till en slutkoncentration på 5 x 107 pärlor/mL (1,75 och 2 μm) eller 1 x 108 pärlor/mL (1 – 1,5 μm) för 1 h innan tvätt och förbereda för flödescytometri som i avsnitt 3.3. Mäta i 525 nm kanalen eller liknande, med en blå laser för att excitera.
Obs: Högre koncentrationer leder till cell avlossning. - För att mäta fagocytos av bakterier, lägga till Texas-röd märkt Escherichia coli biopartiklar som beskrivs i avsnitt 3.2 till 1 x 108 bakterier/mL för 1 h innan tvätt och förbereda för flödescytometri som i avsnitt 3.3. Mäta i 610 nm kanalen eller liknande, med hjälp av en gul-grön laser för att excitera.
- För att mäta fagocytos av pärlor lägga till gul-gröna märkta pärlor som beskrivs i avsnitt 3.2 till en slutkoncentration på 5 x 107 pärlor/mL (1,75 och 2 μm) eller 1 x 108 pärlor/mL (1 – 1,5 μm) för 1 h innan tvätt och förbereda för flödescytometri som i avsnitt 3.3. Mäta i 525 nm kanalen eller liknande, med en blå laser för att excitera.
Representative Results
När tekniken har utförts och cellerna är laddad med dextran och redo för analys (figur 1), säkerställa flödescytometer inte är blockerad och justera framåt scatter/side scatter profilen likna cellerna visas i figur 2A. Om maskinen är blockerad, det kommer att se ut mer som det visas i figur 2B och måste låsas upp innan du fortsätter. Kontrollera parametrarna visas kontroll axenic celler har hög internaliserade dextran fluorescens vid längre tidpunkter och låg internaliserade fluorescens vid kortare sådana (figur 2 c).
När sett för skillnader mellan mutanter, är det troligt att det blir en av tre fenotyper. Mutanter kunde ha normal vätska upptag, de kunde ha en delvis defekt eller flytande upptag kunde slopas helt. Figur 2D visar en stam med normal vätska upptag, i detta fall standard laboratorium stam Ax2, en mutant med ~ 50% minskning av vätska upptag (Ax2 rasG-14) och en med avskaffade vätska upptag (Ax3 gefB-28). Få det genomsnittliga median vätska upptaget (avsnitt 3.5) och använda den för att beräkna volymen av vätska internaliserat (som i figur 3B) eller jämföra data till en kontroll (som i figur 4B och 4 C).
När du utför en vätska upptag tid kurs, som i figur 3A, internaliserade fluorescensen bör öka för 60 – 90 min, varefter dextran börjar att vara exocytosed och en platå nås (figur 3B). Använda 60 min som normaltid när jämföra macropinocytosis i olika mutanter/förhållanden därför tillåter en bra signal att uppnås, och ingen signal är förlorad på grund av exocytos. Mutanter där exocytos hindras allvarligt kan ta längre tid att nå en platå29.
När behandling av celler med hämmare som är effektiva mot macropinocytosis i Dictyostelium (Ställ in som i figur 4A), den dextran internaliseras i 1 h kommer att gå ner till nästan ingenting vid högre hämmare koncentrationer i flesta fall (Figur 4B). Vissa hämmare kanske inte 100% effektiv, men e.g. nocodazole endast hämmar upp till 50% av vätska upptag av macropinocytosis när till akut (figur 4 c). Om hämmare inte är effektiv, cellerna kommer att internalisera samma mängd dextran som kontroll och en minskning av fluorescens kommer inte att synas. Denna teknik gör ett stort utbud av olika hämmare och hämmare koncentrationer att undersökas för effekter på flytande upptag av macropinocytosis mycket snabbt, vilket minskar den tid optimera hämmare behandling.
Figur 2: uppsättning upp cytometer och representant flödesdata. (A) framåt scatter (FSC) och side scatter (SSC) profiler av celler bör fastställas så att cellerna kan lätt skiljas. Ett exempel på hur Ax2 celler bör se visas. (B) om flödescytometer blockeras, som i detta exempel, cellerna har mycket låg side scatter. Lasern kommer inte excitera fluorophores ordentligt och maskinen bör blockeringen innan du fortsätter. Alla data som erhållits medan maskinen blockerades ska kasseras. (C) fluorescensen bör ställas in så att ett prov för upptag av 0 min har låg fluorescens, vilket ökar när celler har inkuberats för längre i fluorescerande medium, som visas i detta exempel tagna från Williams & Kay 201824. (D) exempel på celler som har inkuberats med TRITC dextran för 1 h med normala macropinocytosis (Ax2, grön), minskad macropinocytosis (Ax2 rasG -, HM172614, orange) och avskaffade macropinocytosis (Ax3 gefB -, HM177628, blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: utför vätska upptag-tidsförlopp i 96 brunnar. (A) Dextran bör läggas till varje uppsättning prover sekventiellt, med samma sluttid. Sedan Tvätta brunnarna, lossa och mäta de internaliserade fluorescensen av flödescytometri. Här visas exempel gånger att lägga till dextran. (B) vätska upptag-tidsförloppet för Ax2 celler utförs i 96 brunnar. Taget från Williams & Kay 201824, Visar felstaplar tre oberoende experiment standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: flytande upptag dos-responskurvor. (A) lägga till sammansatta av intresse, i detta fall PI3K hämmare LY294002, till HL5 innehållande 1 mg/mL TRITC-dextran dubbel önskad slutlig maximal koncentration. Blanda med HL5 odlingsmedium + 1 mg/mL dextran som innehåller fordonet ensam i olika proportioner för att generera en utspädning serie 200 µL medium per tillstånd. Lägga till brunnar som vanligt för 1 h innan tvätt och mäta internaliserade fluorescens. (B) vätska upptag dos-responskurva för Ax2 cellerna inkuberas med LY294002-innehållande mediet från A. Anpassad från Williams & Kay 201824. Flytande upptag är normaliserad till en kontrollgrupp. Felstaplar visar tre oberoende experiment standardfel. (C) flytande upptag dos-responskurva för Ax2 cellerna inkuberas med nocodazole. Anpassad från Williams & Kay 201824. Flytande upptag är normaliserad till en kontrollgrupp. Felstaplar visar tre oberoende experiment standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Andra metoder att bedöma vätska upptag är låg genomströmning, tvättning av celler i situ och användning av natriumazid att lossa cellerna är de kritiska steg i denna metod, som tillåter hög genomströmning mätning av macropinocytosis, membran upptag, eller fagocytos av Dictyostelium. Eftersom cellerna är kopplade till en yta och mediet är inte, kan de vänster fäst medan medium runt dem är först kastat och sedan ändras genom nedsänkning i buffert och kastat igen. Natriumazid, som utarmar cellulär ATP och depolarizes membran30, sedan används för att lossa cellerna och förhindrar även exocytos påverkar cellen livskraft24.
Samtidigt med flödescytometri för att mäta macropinocytosis av Dictyostelium ger en mycket exakt mätning av flytande upptag mycket snabbt, för att fastställa anledningen till varför en viss stam eller tillstånd har förändrat vätska upptag, ytterligare utredning med mikroskopi är krävs24. Det bör också noteras att tidigare publicerade resultat, i vissa fall visat en skillnad i vätska upptag av muterade stammar odlas på en yta (som i detta fall), eller i skakar suspension (som i standardprotokollet)31. Med denna metod kan innebära att, i sällsynta fall uppenbar vätska upptag defekter missas. Dessutom, vid mätning av fagocytos, kan endast låga koncentrationer av partiklar användas. Den maximala procentsatsen för fagocytos som kan bestämmas med denna teknik ligger långt under det verkliga högst, men det är fortfarande möjligt att mäta relevanta skillnader i fagocytos mellan stammar och villkor24. För att bestämma den maximala procentsatsen för fagocytos, måste upptag mätas i skakar suspension av en alternativa protokoll27. Celler som har fagocyteras pärlor har ökat side scatter, så detta bör korrigeras för med detta när du ställer in flödescytometer.
Flödescytometri kan användas för att mäta vätska upptag i däggdjursceller32, men den större andelen vätska fas upptag av andra endocytic vägar än sett i Dictyostelium är ett bekymmer. Celler är dessutom vanligtvis fristående använder trypsin vid 37 ° C, möjliggör ytterligare endocytic progression av internaliserade dextran. Iskall natriumazid orsakar inte makrofager kopplas loss från en yta (Williams, opublicerade observation), att göra denna teknik inte tillämpliga på däggdjursceller utan ytterligare optimering.
Hög genomströmning mätning av macropinocytosis har potential att användas till skärmen snabbt och billigt för effekterna av hämmare, genetisk mutation eller gen knockdown på Dictyostelium celler. Mutanter bör alltid jämföras direkt överordnade endast. Om läsaren har ingen tidigare preferens för Dictyostelium stam, icke-axenic stammar såsom DdB eller NC4 är mer ”wild-type” än axenic och kan manipuleras så effektivt som axenic stammar33. Annars Ax2 stammar är den axenic stammar med den minsta genomet dubletter34, medan många stammar av Ax4 Talin A knockouts och bör undvikas om möjligt23. Den tidigare publicerade stammar kan beställas från Dicty lager Center35.
Denna teknik tillåter större undersökande möjligheter än tidigare möjligt om effekterna av olika förhållanden, -hämmare och mutationer på macropinocytosis av Dictyostelium.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Medicinska forskningsrådet UK för grundfinansiering (U105115237) till RRK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR_II flow cytometer | BD Biosciences | - | Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD |
| TRITC-dextran (155 kDa) | Sigma-Aldrich | T1287 | Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine |
| HL5 medium | Formedium | HLGCFG | |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3596 | Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work |
| Dihydrostreptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1517 | |
| Ampicillin sodium | Formdium | AMP50 | |
| Kanamycin monosulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Sodium azide | VWR | 103694M | |
| Magnesium sulfate hydrate | VWR | 25169.295 | |
| Calcium chloride dihydrate | VWR | 1.02382.0250 | |
| Potassium dihydrogen phopshate | VWR | 1.04877.1000 | |
| Di-potassium hydrogen phosphate | VWR | 1.05104.1000 | |
| Fluorimeter | Perkin-Elmer | LS 50 B | |
| FM1-43 | Thermofisher | T35356 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm | Polysciences | 15702-10 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm | Polysciences | 09719-10 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm | Polysciences | 17687-5 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm | Polysciences | 09847-5 | |
| Texas Red E. coli bioparticles | Thermofisher | E2863 | |
| Flow-set fluorospheres | Beckman Coulter | 6607007 | Calibration Beads |
| SM agar | Formedium | SMACFG | |
| 0.22 µm syringe filter | Elkay Laboratory Products | E25-PS22-50S | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302188 | |
| Round-bottom polystyrene tubes | Corning | 352058 | Use a tube that will fit onto your flow cytometer. |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 50 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
| Repeating pipette | Eppendorf | M4-SK | |
| 5 mL repeating pipette tips | Eppendorf | 30089650 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| LY294002 | Cayman Chemical Company | 70920 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG |
References
- Bloomfield, G., Kay, R. R.
- Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182 (2), 389-400 (1995).
- Hardt, W. D., Chen, L. M., Schuebel, K. E., Bustelo, X. R., Galan, J. E. S. typhimurium encodes an activator of Rho GTPases that induces membrane ruffling and nuclear responses in host cells. Cell. 93 (5), 815-826 (1998).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3548-3553 (2011).
- Hacker, U., Albrecht, R., Maniak, M. Fluid-phase uptake by macropinocytosis in Dictyostelium. Journal of Cell Science. 110, 105-112 (1997).
- Dowrick, P., Kenworthy, P., McCann, B., Warn, R. Circular ruffle formation and closure lead to macropinocytosis in hepatocyte growth factor/scatter factor-treated cells. European Journal of Cell Biology. 61 (1), 44-53 (1993).
- Buczynski, G., et al. Inactivation of two Dictyostelium discoideum genes, DdPIK1 and DdPIK2, encoding proteins related to mammalian phosphatidylinositide 3-kinases, results in defects in endocytosis, lysosome to postlysosome transport, and actin cytoskeleton organization. Journal of Cell Biology. 136, 1271-1286 (1997).
- Araki, N., Johnson, M. T., Swanson, J. A. A role for phosphoinositide 3-kinase in the completion of macropinocytosis and phagocytosis by macrophages. Journal of Cell Biology. 135 (5), 1249-1260 (1996).
- Araki, N., Egami, Y., Watanabe, Y., Hatae, T. Phosphoinositide metabolism during membrane ruffling and macropinosome formation in EGF-stimulated A431 cells. Experimental Cell Research. 313 (7), 1496-1507 (2007).
- Clark, J., et al. Dictyostelium uses ether-linked inositol phospholipids for intracellular signalling. The EMBO Journal. 33 (19), 2188-2200 (2014).
- Hoeller, O., et al. Two distinct functions for PI3-kinases in macropinocytosis. Journal of Cell Science. 126, 4296-4307 (2013).
- Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins. Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).
- Veltman, D. M., et al. A plasma membrane template for macropinocytic cups. Elife. 5, e20085 (2016).
- West, M. A., Prescott, A. R., Eskelinen, E. L., Ridley, A. J., Watts, C. Rac is required for constitutive macropinocytosis by dendritic cells but does not control its downregulation. Current Biology. 10 (14), 839-848 (2000).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109, 2731-2739 (1989).
- Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
- Clarke, M., Kohler, J., Heuser, J., Gerisch, G. Endosome fusion and microtubule-based dynamics in the early endocytic pathway of Dictyostelium. Traffic. 3, 791-800 (2002).
- Pacitto, R., Gaeta, I., Swanson, J. A., Yoshida, S. CXCL12-induced macropinocytosis modulates two distinct pathways to activate mTORC1 in macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 101 (3), 683-692 (2017).
- Rivero, F., Maniak, M. Quantitative and microscopic methods for studying the endocytic pathway. Methods in Molecular Biology. , 423-438 (2006).
- Bacon, R. A., Cohen, C. J., Lewin, D. A., Mellman, I. Dictyostelium discoideum mutants with temperature-sensitive defects in endocytosis. Journal of Cell Biology. 127, 387-399 (1994).
- Basu, S., Fey, P., Jimenez-Morales, D., Dodson, R. J., Chisholm, R. L. dictyBase 2015: Expanding data and annotations in a new software environment. Genesis. 53 (8), 523-534 (2015).
- Williams, T. D., Kay, R. R. The physiological regulation of macropinocytosis during Dictyostelium growth and development. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
- Tsujioka, M., et al. Overlapping functions of the two talin homologues in Dictyostelium. Eukaryotic Cell. 7 (5), 906-916 (2008).
- Aguado-Velasco, C., Bretscher, M. S.
- Sattler, N., Monroy, R., Soldati, T. Quantitative analysis of phagocytosis and phagosome maturation. Methods in Molecular Biology. 983, 383-402 (2013).
- Wilkins, A., Chubb, J., Insall, R. H. A novel Dictyostelium RasGEF is required for normal endocytosis, cell motility and multicellular development. Current Biology. 10, 1427-1437 (2000).
- Thomason, P. A., King, J. S., Insall, R. H. Mroh1, a lysosomal regulator localized by WASH-generated actin. Journal of Cell Science. 130 (10), 1785-1795 (2017).
- van Duijn, B., Vogelzang, S. A., Ypey, D. L., van der Molen, L. G., van Haastert, P. J. M. Normal chemotaxis in Dictyostelium discoideum cells with a depolarized plasma membrane potential. Journal of Cell Science. 95, 177-183 (1990).
- Novak, K. D., Peterson, M. D., Reedy, M. C., Titus, M. A. Dictyostelium myosin I double mutants exhibit conditional defects in pinocytosis. Journal of Cell Biology. 131, 1205-1221 (1995).
- Mercer, J., Helenius, A. Vaccinia virus uses macropinocytosis and apoptotic mimicry to enter host cells. Science. 320 (5875), 531-535 (2008).
- Paschke, P., et al. Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum. PLoS One. 13 (5), e0196809 (2018).
- Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum. Genome Biology. 9 (4), R75 (2008).
- Fey, P., Dodson, R. J., Basu, S., Chisholm, R. L. One stop shop for everything Dictyostelium: dictyBase and the Dicty Stock Center in 2012. Methods in Molecular Biology. 983, 59-92 (2013).
